Mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée gonflement Mitochondrial test

Résumé

Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca^{2 +} et Ca^{2 +}- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.

Résumé

La production d’ATP par phosphorylation oxydative est la principale fonction des mitochondries. Les mitochondries chez les eucaryotes supérieurs participent également à cytosolique Ca^{2 +} mise en mémoire tampon, et la production d’ATP dans les mitochondries peut être véhiculée par intramitochondrial Ca^{2 +} concentration libre. Capacité de ca^{2 +} rétention peut être considérée comme la capacité des mitochondries pour retenir le calcium dans la matrice mitochondriale. Ca intracellulaire accumulé^{2 +} conduit à la perméabilité de la membrane mitochondriale interne, appelé l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP), ce qui conduit à la fuite des molécules avec un moléculaire poids moins de 1,5 kDa. Ca^{2 +}-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. Nous décrivons ici deux essais afin d’examiner la capacité de rétention en Ca^{2 +} et Ca^{2 +}-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées. Après certains montants de Ca^{2 +} sont ajoutés, toutes les étapes peuvent être remplies en une seule journée et enregistrés par un lecteur de microplaques. Ainsi, ces deux tests simples et efficaces peuvent être adoptées pour évaluer le Ca^{2 +}-fonctions mitochondriales liées.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux organes cellulaires pour produire près de 95 % de l’ATP utilisé dans les cellules de mammifère par la phosphorylation oxydative. Il est signalé que la concentration micromolaire séquestrée de Ca^{2 +} par les mitochondries, la présence d’ADP et de phosphate inorganique peut être utilisé pour phosphoryler l’ADP à la synthèse d’ATP¹. Quand la concentration cytosolique Ca^{2 +} va au-delà d’un seuil, les mitochondries peuvent absorption Ca^{2 +} rapidement et l’efflux il lentement. Ainsi, les mitochondries de fonctionnement peuvent afflux l’augmentation Ca cytosolique^{2 +}. Sans rapport avec la participation de la phosphorylation oxydative, la mitochondrial Ca^{2 +} également prendre part à des signaux de calcium cytosolique et activer le mécanisme apoptotique mitochondriale en provoquant l’ouverture de la PFMP en interne mitochondriale membrane². Il a été largement reconnu qu’élévation anormale de la Ca intracellulaire^{2 +} peut induire mitochondrial enflure massive en ouvrant le mPTP³. Ainsi, le présent protocole a pour but d’évaluer la fonction mitochondriale en quantifiant la capacité mitochondriale de Ca^{2 +} rétention et Ca^{2 +}-trigged gonflement mitochondrial.

Capacité de rétention en ca^{2 +} est la mesure de la capacité des mitochondries de calcium cytosolique de l’absorption. Mitochondries peuvent mettre en mémoire tampon le calcium libre cytosolique et régulent les processus cellulaires dépendant du calcium par l’absorption de calcium sous forme de précipités inactives. Capacité altérée de Ca^{2 +} rétention se produit dans les phénomènes de stress associés à la limitation de l’énergie et de^4,maladies neurodégénératives voire⁵. Les mitochondries isolées ou cellules perméabilisées digitonine peuvent être utilisés pour identifier la capacité de rétention Ca^{2 +} , et la capacité élevée d’accumuler Ca^{2 +} par les mitochondries isolées avec le glutamate supplementaires et le malate n’est pas effectuée par le procédure d’isolement mitochondrial⁶. Une quantité titrée de digitonine devrait être utilisée pour permeabilize les membranes plasmiques des différents types de cellules. Le sel de hexapotassium de Ca^{2 +}-liaison colorant fluorescent vert, un Ca^{2 +}-cellule-imperméants sensible indicateur visible de la lumière-excitables, a été largement utilisé⁷. Ca^{2 +}-vert colorant fluorescent est un indicateur de faible affinité et utilisée pour montrer que des concentrations^{2 +} Ca libre intracellulaires continuent d’augmenter au cours de reliure prolongée de stimulations (5 min)⁸. Cette méthode était moins sensible que la technique du filtre radioactif, mais a été grandement simplifiée. Les autres Ca^{2 +} élève fluorescence verte de calcium et l’absorption de Ca^{2 +} par les mitochondries retourne la fluorescence au niveau de référence. Des additions séquentielles de Ca^{2 +} ont été faites jusqu'à ce que les mitochondries n’a pas d’absorption extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Un lecteur de microplaques de fluorescence peut être utilisé pour signaler en permanence la fluorescence verte de calcium.

Après accumulation de Ca^{2 +} , les mitochondries dépolarisé, libéré Ca^{2 +} dans le milieu et a commencé à enfler. Ca^{2 +}-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. La microscopie électronique et la diminution de lumière absorbance à 540 nm peut être utilisé pour mesurer le Ca^{2 +}-déclenchée mitochondrial gonflement^10,11. Volume de mitochondries peut être directement déterminé par l’angle avant diffusion de la lumière¹², où la diminution de l’absorbance reflète gonflement passif de la matrice mitochondriale.

Ici, nous illustrons la méthodologie afin d’examiner la capacité mitochondriale de Ca^{2 +} rétention et Ca^{2 +}-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées des cellules SH-SY5Y.

Protocole

1. isolation des mitochondries

Remarque : Toutes les solutions et les équipements doivent être prérefroidir 0 - 4 ° C et gardés sur glace.

1. Semences environ 3 x 10⁶ SH-SY5Y cellules / boîte de Petri de cellule 10 cm. Des cellules de culture en haute-glucose Dulbecco modifiée milieu Eagle avec 10 % sérum de veau fœtal, la pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Maintenir à 37 ° C dans un incubateur contenant 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   NOTE : au moins 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y cellules sont nécessaires pour chaque dosage d’isolement.
2. Retirez le support et laver les cellules avec environ 1 mL de PBS froid glace dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm 3 fois.
3. Ajouter de nouveau 1 mL de PBS froid glace en boîte de Petri de cellule 10 cm et racler les cellules adhérentes dans un nouveau tube de 1,5 mL. Centrifuger à 800 x g pendant 10 min à 4 ° C.
4. Au cours de la centrifugation, préparer 5 mL de tampon d’isolement mitochondriale (250 mM saccharose, 10 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-pipérazine ethanesulfonic acide), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) additionné de 50 μL de stock d’inhibiteurs de la protéase solution (concentration de x 100 ; 1 comprimé sans EDTA dissous dans 500 µL de ddH₂O).
5. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot avec 1 mL de tampon d’isolement mitochondriale. Incuber le tube 1,5 mL sur la glace pendant 30 min.
6. Lyser les cellules les suspension avec un homogénéisateur de verre (15 à 25 coups) monter et descendre manuellement sur la glace.
   Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles lorsque les cellules sont homogénéisés. Compter les cellules intactes et les noyaux mis à nu par microscope visuellement et confirmer que > rupture cellulaire 90 % s’est produite.
7. Transférer l’homogénat dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les débris (noyaux et des cellules intactes restantes).
8. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min 4 ° C.
9. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à 14 000 x g pendant 15 min 4 ° C.
10. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot contenant des mitochondries avec 1 mL de tampon d’isolement mitochondriale.
11. Centrifuger la solution pendant 15 min à 14 000 x g 4 ° C pour précipiter les mitochondries.
12. Le culot de mitochondries qui en résultent doit être conservé dans la glace et resuspendu dans médias KCl 50-100 μL (KCl 125 mM, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, glutamate de 5 mM, malate de 5 mM et la 2 μM roténone, pH 7,4) selon le volume de granulés avant n’importe quel cul Ay.
13. 5 μL de solution mitochondriale permet de mesurer la concentration de protéines mitochondriales de l’essai normalisé de BCA, mesurant OD562 à l’aide d’un lecteur de plaque¹³.

2. détermination des mitochondries Ca^{2 +} capacité de rétention

1. Préparer les médias de KCl et ajouter le Ca^{2 +}-liaison colorant fluorescent vert à une concentration finale de 0,5 μM avant l’expérience.
2. Transférer 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans des milieux de KCl contenant 0,5 μM Ca^{2 +}-liaison colorant fluorescent vert dans chaque boîte de 6 puits bien.
3. Incuber les mitochondries et le Ca^{2 +}-liaison colorant fluorescent vert dans la plaque de 6 puits à température ambiante, abrie de la lumière ambiante pour 1 min. Ajouter 4 μL aliquotes d’un 20 mM CaCl₂ solution (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 20 mM HEPES, glutamate de 5 mM, malate de 5 mM, pH 7,4) à chaque plaque 6 puits, puits à l’aide de la boîte automatique distribuer réglage d’introduire 200 nmol Ca^{2 +}/mg protéine mitochondriale.
4. Utiliser un spectromètre à fluorescence pour surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pendant 2 min avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nm et une longueur d’onde d’émission de 531 nm. La plaque est équipée d’agitation à 600 tr/min pour 3 s entre lecture commandée par le logiciel (Figure 1).
5. Ajouter une aliquote de 4 μL supplémentaires de 20 mM CaCl₂ solution dans chaque puits et surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pour 2 min. Répétez cette étape jusqu'à ce que la fluorescence augmente avec le temps.
   Remarque : Les mitochondries sont mis au défi avec l’addition Ca^{2 +} indiquée par la fluorescence d’enregistrement accrue. Lorsque le mPTP s’ouvre, la fluorescence augmente avec le temps.
6. Interpréter la quantité totale de Ca^{2 +} ajoutés jusqu'à ce que le mPTP s’ouvre comme la capacité de rétention en^{2 +} Ca.

3. détermination du Ca ^{2 +}-induite de gonflement Mitochondrial

1. Préparer les médias KCl avant l’expérience.
   1. Transférer 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans les médias de KCl dans chaque boîte de 6 puits bien.
2. Ajouter 10 μL de 20 mM CaCl₂ solution aqueuse (500 nmol/mg de protéine mitochondriale) dans les protéines mitochondriales pour déclencher le gonflement mitochondrial.
3. Enregistrer la diminution de l’absorbance à 540 nm toutes les 3 s sur un lecteur de microplaques, commandé par le logiciel pendant 10 min (Figure 2). Les changements de fluorescence sont provoquées par un afflux de solutés à travers la membrane mitochondriale interne.
   Remarque : La diminution absorbance à 540 nm correspond aux mitochondries gonflées. Si le lecteur ne respecte pas une diminution de l’absorbance, un plus long intervalle de lecture ou du temps de lecture peuvent être adoptées.

Résultats

Représentant les résultats de Ca^{2 +} capacité de rétention :
Les résultats ont été exprimés en valeurs de fluorescence. Avec les impulsions supplémentaires du Ca^{2 +} (200 nmols/mg protéine mitochondriale), la fluorescence a augmenté de double au-dessus de référence avec l’ouverture du mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibiteur de Ca^{2 +}-induite par le mPTP ouverture ou 1 μM atractyloside (RTA), un activateur de Ca^{2 +}-...

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole simple et efficace pour le mitochondrial Ca^{2 +} rétention capacité dosage et Ca^{2 +}-déclenchée essai de gonflement mitochondrique.

Pour l’isolement mitochondriale, assurez-vous que tous les matériaux et les tubes sont sur la glace, surtout quand les cellules de l’homogénéisation. 0,25 % de trypsine-EDTA peut également servir pour détacher les cellules du plat pendant 5 min à 37 ° C. Après les coups de 15-25, il est néces...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001