Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Resumen

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca^{2 +} y Ca^{2 +}- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

Resumen

La producción de ATP por fosforilación oxidativa es la función principal de las mitocondrias. Las mitocondrias en los eucariotas superiores también participarán en citosólica Ca^{2 +} buffering, y la producción de ATP en mitocondrial puede estar mediada por intramitochondrial gratis Ca^{2 +} concentración. Capacidad de retención de CA^{2 +} puede considerarse como la capacidad de las mitocondrias para retener el calcio en la matriz mitocondrial. Acumulación intracelular Ca^{2 +} lleva a la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna, como la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP), que conduce a la salida de moléculas con un molecular peso menos de 1.5 kDa. CA^{2 +}-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. Aquí, Describimos dos ensayos para examinar la capacidad de retención de Ca^{2 +} y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas. Después de ciertas cantidades de Ca^{2 +} se ha añadido, todos los pasos pueden ser completados en un día y registrados por un lector de microplacas. Por lo tanto, pueden adoptarse estos dos análisis simples y eficaces para evaluar el Ca^{2 +}-relacionadas con las funciones mitocondriales.

Introducción

Las mitocondrias son los principales órganos celulares que producen casi el 95% de la ATP que se utiliza en las células de mamífero por fosforilación oxidativa. Se informó que el secuestrado concentración micromolar de Ca^{2 +} por las mitocondrias, la presencia de ADP y fosfato inorgánico puede utilizarse para fosforilan ADP síntesis ATP¹. Cuando la concentración citosólica Ca^{2 +} por encima de un umbral, las mitocondrias pueden absorción de Ca^{2 +} rápidamente y eflujo poco a poco. Así pues, el funcionamiento de la mitocondria puede afluencia el aumento citosólico Ca^{2 +}. Irrelevante para la participación en la fosforilación oxidativa, la mitocondrial Ca^{2 +} también tomar parte en las señales de calcio citosólico y activar el mecanismo de apoptosis mitocondrial al inducir la apertura de la mPTP en el interior mitocondrial membrana². Ha sido ampliamente reconocida que elevación anormal de Ca intracelular^{2 +} puede inducir inflamación masiva mitocondrial por la apertura del mPTP³. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar la función mitocondrial mediante la cuantificación de la mitocondrial Ca^{2 +} capacidad de la retención y Ca^{2 +}-trigged hinchazón mitocondrial.

Capacidad de retención de CA^{2 +} es la medida de la capacidad de las mitocondrias de calcio citosólico de absorción. Las mitocondrias pueden búfer el calcio libre citosólico y regulan procesos celulares dependientes de calcio por la absorción de calcio en forma de precipitados inactivos. Deterioro capacidad de Ca^{2 +} retención ocurre en fenómenos de estrés asociados con limitación de energía e incluso neurodegenerativas enfermedades^4,5. Permeabilized digitonin células o mitocondrias aisladas se pueden utilizar para identificar la capacidad retención de Ca^{2 +} , y la elevada capacidad para acumular Ca^{2 +} por mitocondrias aisladas con el glutamato adicional y malato no es afectada por la Aislamiento mitocondrial procedimiento⁶. Debe utilizarse una cantidad pretitulada de digitonin a permeabilizar las membranas del plasma de diferentes tipos de células. La sal de hexapotassium de Ca^{2 +}-enlace colorante fluorescente verde, un Ca^{2 +}-indicador excitable luz visible célula impermeant sensible, ha sido ampliamente utilizado⁷. CA^{2 +}-encuadernación verde colorante fluorescente es un indicador de baja afinidad y se utiliza para mostrar que intracelular libre Ca^{2 +} las concentraciones siguen aumentando durante prolongado (5 min) estímulos⁸. Este método fue menos sensible que la técnica de filtros radiactivos pero fue simplificado grandemente. El adicional Ca^{2 +} eleva la fluorescencia verde de calcio y la absorción de Ca^{2 +} por mitocondrias devuelve la fluorescencia a línea de fondo. Se hicieron adiciones secuenciales de Ca^{2 +} hasta que la mitocondria no absorción extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Un lector de microplacas de fluorescencia puede utilizarse para informar continuamente la fluorescencia verde de calcio.

Después de la acumulación de Ca^{2 +} , mitocondrias despolarizado, liberan Ca^{2 +} en el medio y comenzaron a hincharse. CA^{2 +}-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. La microscopia electrónica y la disminución ligera absorbancia a 540 nm puede usarse para medir la Ca^{2 +}-activa de^10,hinchazón mitocondrial¹¹. Volumen de las mitocondrias puede determinarse directamente adelante ángulo dispersión ligera¹², donde disminuye la absorbancia refleja inflamación pasiva de la matriz mitocondrial.

Aquí ilustramos la metodología para examinar la mitocondrial Ca^{2 +} capacidad de la retención y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y.

Protocolo

1. aislamiento de mitocondrias

Nota: Todas las soluciones y equipos deben preenfriados a 0 - 4 ° C y mantener en hielo.

1. Semillas aproximadamente 3 x 10⁶ SH-SY5Y células por placa de cultivo celular de 10 cm. Células en cultivo en alta glucosa Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 μg/mL). Mantener a 37 ° C en una incubadora con 5% CO₂ durante la noche.
   Nota: al menos 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y células se necesitan para cada ensayo de aislamiento.
2. Quite el medio y lavar las células con aproximadamente 1 mL de PBS frío de hielo en una placa de cultivo celular de 10 cm 3 veces.
3. Agregar nuevo 1 mL de PBS frío de hielo en la placa de cultivo celular de 10 cm y raspar las células adherentes en un nuevo tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 x g por 10 min a 4 ° C.
4. Durante la centrifugación, preparar 5 mL de tampón de aislamiento mitocondrial (250 mM sacarosa, 10 mM HEPES (ácido 4 (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) suplementado con 50 μL de la acción de los inhibidores de la proteasa solución (concentración x 100; 1 tableta libre de EDTA disuelto en 500 μl de ddH₂O).
5. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con 1 mL de tampón de aislamiento mitocondrial. Incubar el tubo de 1,5 mL en hielo durante 30 minutos.
6. Lyse las células suspendidas con un homogeneizador de vidrio (15-25 golpes) hacia arriba y hacia abajo manualmente en el hielo.
   Nota: Asegúrese de que no hay burbujas cuando las células están homogeneizadas. Contar las células intactas y núcleos desnudos por microscopio visualmente y confirmar que > se ha producido rotura de la célula de 90%.
7. Transferir el homogeneizado en un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para eliminar los desechos (núcleos y células intactas restantes).
8. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min 4 ° C.
9. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugar a 14.000 g x 15 min 4 ° C.
10. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene mitocondrias con 1 mL de tampón de aislamiento mitocondrial.
11. Centrifugue la solución durante 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar las mitocondrias.
12. El sedimento resultante de las mitocondrias debe mantenerse en hielo y resuspendió en 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM de glutamato, malato de 5 mM y la rotenona μM 2, pH 7.4) según el volumen de pellets antes de cualquier culo Ay.
13. Utilice 5 μL de solución mitocondrial para medir la concentración de proteína mitocondrial por análisis estándar de BCA, OD562 de medición usando un lector de placa¹³.

2. determinación de la capacidad de retención de mitocondrial Ca^{2 +}

1. Preparar los medios de comunicación de KCl y añadir el Ca^{2 +}-atar el tinte verde fluorescente a una concentración final de 0,5 μM antes del experimento.
2. Transferir 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en medio de KCl que contiene 0,5 μM Ca^{2 +}-atar bien el tinte fluorescente verde en cada placa de 6 pozos.
3. Incubar las mitocondrias y el Ca^{2 +}-enlace colorante fluorescente verde en la placa de la pozo 6 a temperatura ambiente protegido de la luz ambiental para 1 minuto 4 Añadir alícuotas μL de una solución de CaCl₂ (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ de 20 mM 20 mM HEPES, 5 mM glutamato, malato de 5 mM, pH 7,4) a cada placa de 6 pozos bien con el automático dispense ajuste para introducir la proteína mitocondrial de Ca^{2 +}/mg de 200 nmol.
4. Usar un espectrómetro de fluorescencia para supervisar los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 min con una longitud de onda de excitación de 506 nm y una longitud de onda de emisión de 531 nm. La placa está equipada con agitación a 600 rpm durante 3 s entre lecturas controlado por software (figura 1).
5. Añadir una alícuota adicional de 4 μL de solución de CaCl₂ de 20 mM a cada pocillo y monitoreo de los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 minutos Repita este paso hasta que la fluorescencia aumenta con el tiempo.
   Nota: Las mitocondrias son desafiadas con la Ca agregado^{2 +} indicada la grabación mayor fluorescencia. Cuando se abre el mPTP, la fluorescencia aumenta con el tiempo.
6. Interpretar la cantidad total de Ca^{2 +} añadido hasta que el mPTP se abre como el Ca^{2 +} capacidad de retención de.

3. determinación de Ca ^{2 +}-inducida hinchazón mitocondrial

1. Preparar los medios de comunicación de KCl antes del experimento.
   1. Transfiera 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en medio de KCl en cada placa de 6 pozos bien.
2. Añadir 10 μL de solución acuosa de CaCl₂ (proteína mitocondrial de 500 nmol/mg) de 20 mM en proteína mitocondrial para desencadenar la hinchazón mitocondrial.
3. Registrar la disminución de absorbancia a 540 nm cada 3 s en un lector de microplacas controlado por el software durante 10 minutos (figura 2). Los cambios de fluorescencia son causados por un flujo de solutos a través de la membrana interna mitocondrial.
   Nota: La disminución absorbancia a 540 nm corresponde a las mitocondrias hinchadas. Si el lector no observa una disminución en la absorbancia, un mayor intervalo de lectura o tiempo de lectura puede ser adoptado.

Resultados

Representante resultados de capacidad de retención de Ca^{2 +} :
Los resultados se expresaron como valores de fluorescencia. Con los pulsos adicionales de Ca^{2 +} (200 nmols/mg proteína mitocondrial), la fluorescencia aumentada por el doble por encima de la línea de fondo con la apertura del mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibidor de la Ca^{2 +}-inducida por mPTP apertura o 1 μM atractyloside (ATR), un activador de la Ca^{2 +}-inducida ...

Discusión

Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y eficaz para el mitocondrial Ca^{2 +} retención capacidad análisis y Ca^{2 +}-activa ensayo hinchazón mitocondrial.

Para el aislamiento mitocondrial, asegúrese de que todos los materiales y tubos son de hielo, especialmente cuando las células de homogeneización. 0.25% tripsina-EDTA puede utilizarse también para separar las células desde el plato durante 5 minutos a 37 ° C. Después de 15-25 golpes, es necesario observar la m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001