Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

Summary

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca - עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Abstract

הפקת ATP על ידי זרחון חמצוני הוא התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה. במיטוכונדריה פרוקריוטים גבוה יותר גם להשתתף cytosolic Ca^{2 +} אגירה, ייצור ATP ב מיטוכונדריאלי יכול להיות מתווכת על-ידי intramitochondrial חינם Ca^{2 +} ריכוז. Ca^{2 +} שמירה קיבולת יכול היה להיחשב ליכולת של המיטוכונדריה לשמור על הסידן המטריצה מיטוכונדריאלי. שהצטברו תאיים Ca^{2 +} מוביל החדירות של קרום מיטוכונדריאלי הפנימי, כינה את הפתיחה של חדירות מיטוכונדריאלי המעבר נקבובית (mPTP), כשבסופו לדליפת של מולקולות עם מולקולרית משקל kDa פחות מ- 1.5. Ca^{2 +}-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. כאן, אנו מתארים שני מבחני לבחון על Ca^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד. לאחר כמויות מסוימות של Ca^{2 +} מתווספים, כל השלבים ניתן יהיה להשלים ביום אחד, שהוקלט על ידי קורא microplate. לפיכך, מבחני שני אלה פשוט ויעיל ניתן לאמץ להעריך Ca^{2 +}-הקשורים פונקציות מיטוכונדריאלי.

Introduction

המיטוכונדריה הם האיברים הסלולר העיקרי לייצר כמעט 95% מ- ATP המשמש בתאים בתרבית של זרחון חמצוני. הוא דיווח כי הריכוז micromolar מוחרמת של Ca^{2 +} על ידי המיטוכונדריה, הנוכחות של ADP, פוספט אורגניים ניתן להשתמש כדי phosphorylate ADP סינתזת ATP¹. כאשר הריכוז של Ca cytosolic^{2 +} עובר מעל לסף מסוים, המיטוכונדריה יכול ספיגת Ca^{2 +} במהירות, בזרימת אותו לאט לאט. לפיכך, המיטוכונדריה מתפקדת יכול זרם מוגברת cytosolic Ca^{2 +}. לא רלוונטי-ההשתתפות זרחון חמצוני, מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} גם לקחת חלק אותות cytosolic סידן ו להפעיל את מנגנון מיטוכונדריאלי אפופטוטיים להיפגע על ידי גרימת הפתח של mPTP הפנימי מיטוכונדריאלי ממברנה². זה הוכרה נרחב חריג על ידי העלאת Ca תאיים^{2 +} יכול לגרום נפיחות מסיבית מיטוכונדריאלי על-ידי פתיחת mPTP³. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי מאת לכימות על Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת ו Ca^{2 +}-trigged מיטוכונדריאלי נפיחות.

Ca^{2 +} שמירה התפוסה היא מידת היכולת של המיטוכונדריה ספיגת הסידן cytosolic. המיטוכונדריה ניתן מאגר הסידן חינם cytosolic, לווסת סידן תלוית תהליכים תאיים על ידי ספיגת הסידן בצורה של פוחת משקעים לא פעיל. Ca לקוי^{2 +} שמירה קיבולת מתרחשת מתח תופעות הקשורות באנרגיה הגבלה,^4,של מחלות ניווניות אפילו⁵. המיטוכונדריה מבודד או תאים digitonin permeabilized יכול לשמש כדי לזהות את Ca^{2 +} השמירה קיבולת, ואת היכולת מוגברות לצבור Ca^{2 +} על ידי המיטוכונדריה מבודד עם נוספים גלוטמט, בנויים לא מושפע על ידי בידוד מיטוכונדריאלי נוהל⁶. כמות titrated של digitonin צריך לשמש permeabilize של ממברנות פלזמה של סוגי תאים שונים. Hexapotassium מלח Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט, Ca^{2 +}-אינדיקטור רגיש תא-impermeant אור-טמפרמנט גלוי, היה בשימוש נרחב⁷. Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט מחוון נמוך-זיקה ולא להשתמש בו כדי להראות כי תאיים חינם Ca^{2 +} ריכוזים ימשיכו לעלות במהלך ממושך (5 דקות) stimulations⁸. שיטה זו היה פחות רגיש יותר הטכניקה מסנן רדיואקטיבי, אולם היה לפשוט מאוד. נוספים Ca^{2 +} מעלה סידן ירוק פלורסצנטיות, Ca^{2 +} תפיסה על ידי המיטוכונדריה ומחזירה את קרינה פלואורסצנטית בסיסית. תוספות רציפים של Ca^{2 +} נעשו עד המיטוכונדריה נכשלה ספיגת extramitochondrial Ca^{2 + 9}. קורא microplate קרינה פלואורסצנטית ניתן לדווח באופן רציף על ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ירוק.

לאחר צבירת^{2 +} Ca, המיטוכונדריה depolarized שוחרר Ca^{2 +} לתוך המדיום, החלה להתנפח. Ca^{2 +}-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. מיקרוסקופ אלקטרוני ו של הפחתת ספיגת האור-540 nm יכול לשמש כדי למדוד את Ca^{2 +}-עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות^10,11. המיטוכונדריה נפח יכול להיקבע באופן ישיר על ידי קדימה זווית פיזור אור¹², איפה ירידות ספיגת לשקף פסיבית נפיחות של המטריקס מיטוכונדריאלי.

כאן, אנחנו להמחיש את המתודולוגיה לבחון על Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מתאי SH-SY5Y.

Protocol

1. בידוד של המיטוכונדריה

הערה: כל פתרונות וציוד צריך להיות precooled 0 - 4 מעלות צלזיוס, נשמרים על קרח.

1. זרעי בערך 3 x 10⁶ SH-SY5Y תאים לכל מאכל תרבות תא 10 ס מ. התרבות התאים Dulbecco גבוהה-גלוקוז המתואמת של הנשר בינוני עם סרום שור עוברית 10%, פניצילין (100 U/mL)-סטרפטומיצין (100 µg/mL). לשמור על 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור המכילה 5% CO₂ בן לילה.
   הערה: לפחות 1-2 x 10 תאים⁷ SH-SY5Y יש צורך בכל assay בידוד.
2. להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר קרח בצלחת תרבות תא 10 ס מ 3 פעמים.
3. הוסף חדש 1 מ"ל של PBS קר קרח לתוך צלחת תרבות תא 10 ס מ, לגרד את תאים חסיד לתוך צינור 1.5 mL החדש. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 10-4 מעלות צלזיוס.
4. במהלך צנטריפוגה, להכין מאגר בידוד מיטוכונדריאלי 5 מ"ל (250 מ מ סוכרוז, 10 מ מ HEPES (חומצה ethanesulfonic-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine 4), 10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl₂, 1 מ מ EDTA) בתוספת μL 50 מניות מעכבי פרוטאז פתרון (100 x ריכוז; 1 טבליה נטולת EDTA מומס µL 500 של ddH₂O).
5. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר. דגירה הצינור 1.5 mL על קרח למשך 30 דקות.
6. Lyse התאים מושעה עם מהמגן זכוכית (15-25 משיכות) למעלה ולמטה באופן ידני על קרח.
   הערה: ודא כי קיימים אין בועות כאשר התאים הם הומוגני. לספור את התאים שלם ואת הגרעינים חשופות על ידי מיקרוסקופ מבחינה ויזואלית, לאשר את זה > 90% תא שבירה אירעה.
7. להעביר את homogenate לתוך צינור 1.5 mL צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C לפנות את הפסולת (גרעינים, התאים שנותרו ללא פגע).
8. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות 4 ° C.
9. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש ו צנטריפוגה ב 14,000 x g למשך 15 דקות 4 ° C.
10. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר.
11. Centrifuge הפתרון למשך 15 דקות ב g 14,000 x 4 ° C, כדי לזרז את המיטוכונדריה.
12. בגדר המיטוכונדריה וכתוצאה מכך חייב להיות כל הזמן על קרח, resuspended בתקשורת 50-100 μL אשלגן כלורי (125 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ K₂HPO₄, 1 מ MgCl₂, 20 מ מ. HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, ו- 2 μM rotenone, pH 7.4) על פי האחסון גלולה לפני כל התחת אחד בשני.
13. השתמש μL 5 של פתרון מיטוכונדריאלי כדי למדוד את ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי על ידי תקן assay BCA, מדידה OD562 באמצעות קורא¹³לצלחת.

2. קביעת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} השמירה קיבולת

1. להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי ולהוסיף Ca^{2 +}-איגוד הפלורסנט ירוק ריכוז סופי של 0.5 μM לפני הניסוי.
2. העברת 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) באשלגן כלורי המדיה המכילה 0.5 μM Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט לתוך כל צלחת 6-ובכן, ובכן.
3. דגירה המיטוכונדריה ו- Ca^{2 +}-איגוד הפלורסנט ירוקים בצלחת 6-ובכן בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור מקיף עבור aliquots μL להוסיף 4 1 מינימלית של 20 מ מ פתרון₂ CaCl (20 מ מ CaCl₂, 127 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl₂ 20 מ מ HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, pH 7.4) כל צלחת 6-ובכן ובכן באמצעות האוטומטי לוותר על הגדרת להציג 200 nmol Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}/mg/חלבון.
4. להשתמש ספקטרומטר פלורסצנטיות לעקוב אחר שינויים פלורסצנטיות כל 3 s למשך 2 דקות עם אורך גל עירור של 506 ננומטר, אורך גל של פליטה של 531 ננומטר. הצלחת מצויד רועד ב 600 סל ד 3 s בין קריאות נשלט על ידי תוכנה (איור 1).
5. להוסיף על aliquot 4 μL נוספים של 20 מ מ CaCl₂ פתרון טוב לכל ולעקוב אחר השינויים פלורסצנטיות כל 3 s עבור 2 דק. חזור על שלב זה עד זריחה עולה עם הזמן.
   הערה: המיטוכונדריה מאותגרים עם מוסף Ca^{2 +} שצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ההקלטה מוגברת. עם פתיחת mPTP, זריחה עולה עם הזמן.
6. לפרש את הסכום הכולל של Ca^{2 +} להוסיף עד mPTP פותח לקיבולת Ca^{2 +} השמירה.

3. קביעה של Ca ^{2 +}-induced נפיחות מיטוכונדריאלי

1. להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי לפני הניסוי.
   1. להעביר 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) בתקשורת אשלגן כלורי לתוך כל צלחת 6-טוב טוב.
2. להוסיף 10 μL של 20 מ מ CaCl₂ תמיסה מימית (500 nmol/mg מיטוכונדריאלי חלבון) לתוך חלבון מיטוכונדריאלי לעורר מיטוכונדריאלי נפיחות.
3. שיא הירידה ספיגת-540 nm כל 3 s על קורא microplate נשלט על ידי תוכנה עבור 10 דקות (איור 2). השינויים פלורסצנטיות נגרמות על ידי זרם של מומסים בגבול על פני קרום פנימי מיטוכונדריאלי.
   הערה: ספיגת ירד ב- 540 nm מקביל המיטוכונדריה נפוחות. אם הקורא לא לצפות לירידה ספיגת, יותר זמן קריאה מרווח או זמן קריאה יכול להיות מאומץ.

תוצאות

תוצאות נציג של Ca^{2 +} שמירה קיבולת:
התוצאות היו הביע כערכים זריחה. עם פולסים נוספת של Ca^{2 +} (200 nmols/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת על ידי כפול מעל הבסיס עם פתיחת mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), מעכב של Ca^{2 +}-induced mPTP הפתיחה, או atractyloside μM 1 (ATR), activator Ca^{2 ...}

Discussion

כאן, אנו המתואר פרוטוקול פשוטה ויעילה מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} שמירה קיבולת assay, Ca^{2 +}-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות.

הבידוד מיטוכונדריאלי, ודא כי כל חומרי, צינורות הם על קרח, במיוחד כאשר homogenizing את התאים. 0.25% טריפסין-EDTA יכול לשמש גם כדי לנתק תאים מן המנה למשך 5 דקות ב 37 º C. לא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001