Митохондриальной Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек Assay

Резюме

Этот протокол направлен для описания метода для изучения Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}- срабатывает митохондриальной отек изолированных митохондриях SH-SY5Y клеток, шаг за шагом.

Аннотация

Производства АТФ, окислительное фосфорилирование является основной функцией митохондрий. Митохондрий у высших эукариот также участвуют в цитозольной Ca^{2 +} буферизации, и производства АТФ в митохондриальной может быть опосредовано intramitochondrial бесплатно Ca^{2 +} концентрации. CA^{2 +} водоудерживающего потенциала может рассматриваться как митохондрии возможность сохранить кальция в матрице митохондриальной. Накопленные внутриклеточных Ca^{2 +} приводит к проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, назвал открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), что приводит к утечке молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа. CA^{2 +}-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Здесь мы описываем двух анализов для изучения Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях. После определенного количества Ca^{2 +} добавляются все шаги можно завершить за один день и записан Считыватель микропланшетов. Таким образом, эти два простых и эффективных анализов могут быть приняты для оценки Ca^{2 +}-связанных митохондриальной функции.

Введение

Митохондрии являются основной сотовой органов производить почти 95% АТФ, используемые окислительного фосфорилирования в mammalian клетках. Сообщается, что поглощенных всех концентрации Ca^{2 +} , митохондрии, присутствие ADP и неорганического фосфата может использоваться для фосфорилировать ADP синтеза АТФ¹. Когда концентрация цитозольной Ca^{2 +} идет выше порога, митохондрии можно поглощение Ca^{2 +} быстро и измеряем его медленно. Таким образом функционирования митохондрий может приток увеличение цитозольной Ca^{2 +}. Отношения к участию в окислительного фосфорилирования, митохондриальных Ca^{2 +} также принимают участие в цитозольной кальция сигналов и активировать механизм митохондриальной apoptotic, вызывая открытие mPTP в внутренней митохондриальной ²мембраны. Широко признано, что аномальные повышение внутриклеточной Ca^{2 +} может вызвать митохондриальной массивные отеки, открыв mPTP³. Таким образом, этот протокол призван оценить функцию митохондрий путем определения количественных показателей митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-trigged митохондриальной отек.

CA^{2 +} водоудерживающего потенциала является измерение способности митохондрий цитозольной поглощение кальция. Митохондрий может регулировать кальций зависимых клеточных процессов поглощения кальция в виде неактивных преципитаты и буфере цитозольной свободного кальция. Нарушением Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала происходит в стресс явления, связанные с ограничением энергии и даже нейродегенеративных заболеваний^4,5. Изолированных митохондриях или digitonin-permeabilized клетки могут использоваться для идентификации Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала, и повышенной способностью накапливать Ca^{2 +} , изолированных митохондриях с дополнительная глутамата и малат не осуществляется митохондриальной изоляции процедура⁶. Титруемая количество digitonin должен быть использован для разрушения мембран плазмы из различных типов клеток. Hexapotassium соль Ca^{2 +}-привязка зеленого флуоресцентного красителя, Ca^{2 +}-чувствительных клеток impermeant видимый свет возбудимых индикатор, был широко используется⁷. CA^{2 +}-привязки зеленого флуоресцентного красителя является показателем низкого сродства и используется, чтобы показать, что внутриклеточные бесплатно Ca^{2 +} концентрации продолжать расти в течение длительного (5 мин) стимуляцию⁸. Этот метод был менее чувствительны, чем метод радиоактивных фильтр, но была значительно упрощена. Дополнительные Ca^{2 +} возвышает кальция Зеленая Флуоресценция и Ca^{2 +} поглощение митохондрий возвращает флюоресценция базовой линии. Последовательных добавлений Ca^{2 +} были сделаны до тех пор, пока митохондрии не поглощения extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Считыватель микропланшетов флюоресценции может использоваться непрерывно доклад кальция зеленой флуоресценцией.

После Ca^{2 +} накопления митохондрии деполяризованный, выпущенный Ca^{2 +} в среду и начал набухать. CA^{2 +}-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Электронная микроскопия и уменьшение поглощения света на 540 Нм может использоваться для измерения Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек^10,11. Митохондрии тома можно непосредственно определяется Форвард угол рассеяния света¹², где уменьшение поглощения отражают пассивной отек митохондриальной матрицы.

Здесь, мы иллюстрируем методологии для изучения митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях от SH-SY5Y клеток.

протокол

1. изоляция митохондрий

Примечание: Все решения и оборудование следует охладить до 0 - 4 ° C и хранится на льду.

1. Семя клетки⁶ SH-SY5Y около 3 x 10 на 10 см клетки культуры блюдо. Культура клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная среднего орла с 10% плода бычьим сывороточным, пенициллин (100 ед/мл)-стрептомицином (100 мкг/мл). Сохранять при 37 ° C в инкубаторе, содержащей 5% CO₂ на ночь.
   Примечание: по крайней мере 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y клетки необходимы для калибровочных изоляции.
2. Удаление среды и вымыть клетки с около 1 мл холодного льда PBS в блюдо культуры клеток 10 см 3 раза.
3. Добавить новый 1 мл холодного льда PBS в 10 см клетки культуры блюдо и скрип адэрентных клеток в новой 1,5 мл трубки. Центрифуга на 800 x g 10 мин при 4 ° C.
4. Во время центрифугирования Подготовьте 5 мл митохондриальной изоляции буфера (250 мм сахарозы, 10 мм HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-пиперазина ethanesulfonic кислоты), 10 мм KCl, 1,5 мм MgCl₂, 1 мм ЭДТА) дополнены 50 мкл акций ингибиторы протеазы решение (100 x концентрации; 1 ЭДТА бесплатные таблетки растворяют в 500 мкл ddH₂O).
5. Удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 1 мл буфера митохондриальной изоляции. Инкубируйте 1,5 мл на льду за 30 мин.
6. Лизируйте подвесной клетки с стекла гомогенизатора (15-25 штрихи) вверх и вниз вручную на льду.
   Примечание: Убедитесь, что есть никаких пузырей, когда гомогенизированные клетки. Граф нетронутым клеток и обнажённая ядер Микроскоп визуально и подтвердить, что > 90% клеток поломка произошла.
7. Перенесите огневки в 1,5 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для удаления мусора (ядер и оставшихся нетронутыми клетки).
8. Перевести супернатант в новой 1,5 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут 4 ° C.
9. Супернатант передать новой трубки и центрифуги в 14.000 x g 15 мин 4 ° C.
10. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы, содержащие митохондрии с 1 мл буфера митохондриальной изоляции.
11. Центрифуга решение для 15 мин на 14 000 x g 4 ° C для митохондрий.
12. Результате гранулы митохондрий должны хранится на льду и высокомобильна в 50-100 мкл KCl СМИ (125 мм KCl, 2 мм K₂HPO₄, 1 мм MgCl₂, 20 мм HEPES, 5 мм глутамата, малат 5 мм и 2 мкм ротенон, рН 7,4) согласно Пелле тома перед любой осел Ай.
13. Используйте 5 мкл митохондриальной решения для измерения концентрации митохондриальных белок стандартного анализа BCA, измерения OD562 с помощью пластины читатель¹³.

2. Определение митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала

1. Подготовить KCl СМИ и добавить Ca^{2 +}-привязка зеленого флуоресцентного красителя до конечной концентрации 0,5 мкм до эксперимента.
2. Передача 1 мл изолированных митохондриях (0,4 мг/мл) в СМИ KCl, содержащий 0,5 мкм Ca^{2 +}-привязка зеленый Люминесцентную краску в каждом 6-ну пластины хорошо.
3. Инкубировать митохондрии и Ca^{2 +}-привязка зеленого флуоресцентного красителя в пластину 6-ну при комнатной температуре в защищенном от окружающего света за 1 мин добавить 4 мкл аликвоты 20 мм CaCl решение₂ (20 мм CaCl_{2, 127 мм KCl, 1 MgCl2} 20 мм HEPES, 5 мм глутамата, 5 мм малат, рН 7,4) для каждой пластины 6-Ну хорошо, с помощью автоматического обойтись параметр ввести 200 нмоль Ca^{2 +}/mg митохондриальных белок.
4. Используйте спектрометр флюоресценции для мониторинга флуоресценции изменений каждые 3 s 2 мин с волны возбуждения 506 Нм и длина волны излучения 531 Нм. Пластины оснащен встряхивания на 600 об/мин для 3 s между чтений, контролируемых программного обеспечения (рис. 1).
5. Добавьте дополнительные 4 мкл Алиготе 20 мм CaCl₂ решения для каждой скважины и отслеживать изменения флюоресценции каждые 3 s 2 мин повторить этот шаг до тех пор, пока флюоресценция увеличивается с течением времени.
   Примечание: Митохондрий оспариваются с добавил Ca^{2 +} свидетельствует увеличение записи флуоресценции. При открытии mPTP флюоресценция возрастает со временем.
6. Интерпретируйте общее количество Ca^{2 +} добавлены до тех пор, пока mPTP открывается как Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала.

3. Определение Ca ^{2 +}-индуцированной митохондриальной опухоль

1. Подготовьте KCl СМИ до эксперимента.
   1. Передача 1 мл изолированных митохондриях (0,4 мг/мл) в СМИ KCl в каждом 6-ну пластины хорошо.
2. Добавьте 10 мкл 20 мм CaCl₂ водный раствор (500 нмоль/мг митохондриальных белок) в митохондриальных белок, чтобы вызвать митохондриальной отек.
3. Запись уменьшение поглощения на 540 Нм каждые 3 s на Считыватель микропланшетов контролируемых программного обеспечения для 10 мин (рис. 2). Флуоресценции изменения были вызваны притоком растворенных веществ через внутреннюю мембрану митохондрий.
   Примечание: Снижение поглощения на 540 Нм соответствует опухшие митохондрий. Если читатель не наблюдать уменьшение поглощения, больше читать интервал или читая время может быть принят.

Результаты

Представитель результаты Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала:
Результаты были высказаны как флуоресценции значения. С дополнительные импульсы Ca^{2 +} (200 nmols/мг митохондриальных белок), увеличилось на двойной выше базовой линии с открытием mPTP флуоресценци?...

Обсуждение

Здесь, мы описали простой и эффективный протокол для митохондриального Ca^{2 +} сохранение потенциала пробирного и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек пробирного.

Для митохондриального изоляции убедитесь, что все материалы и трубы находятся на льду, особенно к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001