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摘要

在本报告中, 强调了脊髓培养和分离的原代培养的小鼠背根神经节的优势, 以调查与神经元-胶质细胞相互作用的广泛机制, 可塑性,neuroinflammation 和对病毒感染的反应。

摘要

本协议描述了鼠源性背根神经节 外植体的原生模型, 并介绍了分离的感官神经元和胶质细胞的与后向的联合培养。这些都是有用的和多才多艺的模型, 以调查各种生物学反应的生理和病理条件的周围神经系统 (三七), 从神经胶质相互作用, 可塑性,neuroinflammation 和病毒感染。与单纯的单细胞模型相比, 根背节外植体的使用具有很科学的优越性。例如, 作为一种脊髓的文化, 根背节外植体允许在整个神经元网络中进行 "前体" 转移, 包括在所有神经元和胶质功能中发挥重要作用的胞内微环境。此外, 在几天内还可以保持根背根节外植体, 并且培养条件可能会因需要而受到扰动. 此外, 收获的根背根可以进一步分离成一个体外的原始感觉神经元和卫星胶质细胞的共培养, 以研究神经元-胶质相互作用, neuritogenesis, 轴突锥相互作用与胞外微环境, 更一般, 与神经元代谢相关的任何方面。因此, 背节-外植体系统提供了极大的灵活性, 以成本效益的方式研究与生物、生理和病理条件有关的广泛事件。

引言

在这篇手稿中, 我们报告了一个方法, 以获得一个脊髓的前体模型的小鼠神经根神经节模型系统作为一种保存的组织样的微环境, 以调查广泛的生物学反应, 从神经胶质的污辱范围相互作用, 可塑性, 炎症标志物, 病毒感染。此外, 我们进一步制定了一个协议, 以建立一个主要的共同文化的根神经节衍生的单一感官神经元和卫星细胞。

根背节是位于中枢神经系统外的卫星灰色物质单元, 沿脊髓神经的脊柱脊髓根部。神经节, 位于椎间孔附近, pseudounipolar 的感觉神经元和卫星胶质细胞。pseudounipolar 神经元的特点是一个单一的突起, 它分裂成一个外围过程, 将躯体和内脏的输入从外围目标带到细胞体, 以及将感官信息从细胞体提交中枢神经系统的中心过程。结缔组织胶囊定义并分离出中枢神经系统的神经元和胶质细胞的外围簇。无产后细胞迁移到或从根背根曾经被描述和一个地方干细胞利基负责的神经性事件发生在整个生命中1。因此, 这个模型特别适合研究成人神经发生, axonogenesis, 创伤性病变的反应, 细胞死亡2,3,4,5,6,7 ,8,9 。

在 neuroregeneration 领域中, 从体内和说明体外中收获的根神经节重现 axonotmesis, 这是一种损伤状态, 其中轴突完全切断, 神经元细胞体与支配目标10 分离。 ,11。众所周知, 周围神经损伤会导致节根节内的基因表达减少和增加, 许多这些变化是再生过程的结果, 但许多可能也是由于免疫应答或来自非神经细胞的另一种反应。通过使用一个孤立的根神经节的前体系统, 这些复杂性被删除, 机械通路可以更容易地调查。

除了它在向中枢神经系统传递感官输入的中心作用外, 许多神经递质的受体丰富, 包括 GABA12,13,14,15在神经元躯体的水平以及神经元间交叉激励的证据可能表明, 根背根是成熟的感官输入的初步集成商 16, 17.这些新发现给根背节外植体提供了类似于其他 "微型脑" 模型的微型神经元网络系统的特性, 这是神经组织特异的 organoids 用于更广泛的实验领域的调查和治疗神经疾病的方法18,19。这些证据连同根背根是一个离散和明确定义的神经组织簇包围的结缔组织胶囊, 使它成为一个合适的器官为前体移植。

培养小鼠背根是一种有吸引力的多细胞选择模型的人 pathophysiologies 由于结构和遗传相似的物种之间。此外, 一个大的转基因小鼠菌株储存库, 是非常有利于未来的机械研究。突起延长在开发期间和在损伤以后需要机械相互作用在成长锥体和基体之间20,21。纳米和微阵列基材已被用作工具, 以指导突起的产物, 并表明他们的能力, 以响应地形特征在他们的微环境。神经元已经被证明可以生存, 坚持, 迁移, 并定向他们的轴突, 以导航表面特征, 如凹槽在基板22,23。然而, 这些研究通常利用培养的细胞系, 很难预测主要神经细胞将如何响应明确定义的, 物理提示在体内或前体。

本建议使用的小鼠背根的前体外植体模型模拟了生长轴突周围的真实细胞细胞相互作用和生物化学线索。在许多不同的实验范式, 从轴突再生, 干细胞生产, 到 neuroinflammation, 根背根外植体模型继续作为一个宝贵的工具来调查病毒感染和潜伏期方面的感官神经节24,25,26,27。

神经系统 (NS) 一般是病毒感染的目标28,29,30。大多数病毒感染上皮和内皮细胞表面, 并通过周围神经感觉和运动纤维从表面组织到 NS 的途径。特别是, 在上皮细胞最初感染后, 单纯疱疹病毒1型 (HSV-1) 在感觉神经节中建立终生潜伏期, 最好是31,32的背根。HSV-1 neuroptropic 的感染的能力最终导致神经系统疾病的33。

研究方案

所有的程序, 包括使用这些动物都得到了机构审查委员会批准的议定书 (IACUC-中西部大学) 的批准。

1. 从小鼠胚胎中收获根背根

  1. 用窒息法弄死成年小鼠 (CO2), 然后斩首。立即进行手术切除椎体柱。
    1. 用细剪刀切开皮肤层背, 露出椎柱。通过切开柱子两侧的肋骨, 通过骶骨将椎柱与其他动物分开, 来隔离椎柱。
    2. 使用针/针将椎体柱 (腹侧向上) 安装在手术垫上。
  2. 用细剪刀在椎体两侧进行双切口, 以暴露椎管内侧。
  3. 在手术显微镜下 (放大率设置为 4X), 用剪刀轻轻地移动一侧的脊髓以暴露对侧背脊髓根部, 并沿周围神经的背根定位节段。每个神经节部分隐藏在椎间孔内。
  4. 要收割根背节, 用一把钳子捏住脊髓和神经节之间的背部根部, 然后轻轻地从椎间孔中拔下神经节。
  5. 将第二个钳放在脊柱神经周围的背节上, 并将背节与脊髓神经和脊柱根一起拉。
  6. 将收集的背节放置在35毫米培养皿中, 其中含有3毫升的冰血清游离介质 (可以持续森林)34。
  7. 在干玻璃培养皿中转移每个单独的背根, 在手术显微镜下, 用刀片清洁和修剪剩余的纤维和连接在背节上的结缔组织。根背节很容易被识别为一个凸出透明的结构沿白色脊柱神经/根部。血管经常被发现围绕着背节。
  8. 把清洗后的背根放在一个新的培养皿中, 其中包含冰冷的森林控制介质。
  9. 稀释凝胶蛋白混合物 (参见材料表) 在冰冷的森林间, (1:1)。
  10. 用12井板预涂10/20 µL 的凝胶蛋白混合物将背根背板前体, 并将其放在孵化器内37摄氏度和 5% CO2为30-60 分钟。
  11. 轻轻地添加 1.5-2 毫升的可持续森林管理, 以覆盖整个外植体和维持在培养条件下的外植 (37 °c 和 5% CO2)。
    注意: 这是一个关键的步骤, 因为根背节是锚定在玻璃盘子只由聚合凝胶蛋白混合物。聚合时间和吹打技能是避免漂浮的关键。
  12. 每72小时改变生长的根节的培养基, 让根背根生长, 只要需要。

2. 将单个细胞神经元与根神经节隔离

  1. 将所有在1.5 毫升无菌管中收集的根背节放置在1.2 毫升的 F12 培养基中, 含1.25 毫克胶原酶 IV, 并在37°c 和 5% CO2上孵化, 45 分钟. 在第一次孵化后重复此步骤, 再进行45分钟。
  2. 在37摄氏度和 5% CO2后, 在胶原酶 IV 治疗后立即用2毫升含有胰蛋白酶 (0.025%) 的 F12 培养基对外植体进行30分钟治疗。
  3. 孵育2毫升的 F12 培养基含有胎牛血清 (血清; 33%) 在37°c 和 5% CO2 15 分钟。
  4. 用2毫升的 F12 介质清洗外植体三次, 然后用玻璃吸管机械地将其分离, 直到介质变阴。
    注: 本程序涉及从动物身上收集干净/修剪过的背根, 如前节所述。在进行外植体机械分离时, 要温和, 不要使用过度的力, 因为它会导致工作材料的溢出和丢失。
  5. 过滤分离细胞培养通过0.22 µm 过滤器去除任何杂质和多余的结缔组织。离心过滤细胞裂解在 (2500 x g) 为2分钟。
  6. 移除上清和并用重悬细胞颗粒在500µL 的 neurobasal 培养基中含有补充的神经元培养 (1x), 抗生素混合物 (1x), l-谷氨酸 (0.5 毫米) 和神经生长因子 (5 µg/毫升) (见材料表)。
  7. 将离解的细胞板在层粘连蛋白涂层的覆盖物上 (50 µg/毫升; 参见材料表) 在首选的细胞密度。使用单元格计数器确定单元格的密度。
    注: 我们在2.5万细胞/封面幻灯片上镀细胞。这种技术允许神经元和胶质细胞的分离。与 pseudounipolar 神经元共培养的胶质成分对神经元的存活起着至关重要的作用。

3. 根背节外植体和背节衍生细胞的 HSV-1 感染

注: 这项工作是严格遵循生物安全 level-2 (BSL-2) 的要求, 我们有一个设备齐全的实验室, 由中西部大学生物安全委员会批准。本研究使用了 HSV-1 的一株科斯菌株。请采取适当的测量和安全预防措施, 根据当地机构的指导方针, 如果使用病毒菌株。

  1. 确定并准备在可持续森林媒体中正确稀释的病毒, 以感染该模型。本研究使用的病毒是 HSV-1 的科斯菌株。当使用根背节衍生的分离细胞, 用1单位的感染 (语言) 的感染, 这意味着病毒数量等于细胞数量。
  2. 如果感染根背节外植体, 请使用病毒 (例如, 1万病毒) 的数量, 因为不能确定外植体中的确切数量的细胞。
  3. 将外植体/细胞置于不育细胞板或管中, 其中含有可持续可持续的培养基和病毒的混合物。
    注: 我们使用2.5万病毒的封面幻灯片包含2.5万细胞 (1 语言)。为了感染外植体, 我们使用1万病毒。
  4. 将细胞板或管放置在37摄氏度, 以便感染发生;病毒感染的时间可能因病毒传染性而异。
    注: 使用邻硝基硝基苯基半乳糖苷 (ONPG) 和 5-溴-4-氯-3-哚-galactopyranoside (X-加仑) 测定法确认病毒进入,26。

4. 免疫荧光

  1. 修复磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 制备的4% 福尔马林中的外植体和单细胞样品。清洗样品3次, 每10分钟在 PBS。
  2. 用所需的原抗体孵化样品 (抗β蛋白, 抗感光, 抗硫酸硫酸盐 (HS), 和/或抗糖蛋白 D (gD) 抗体; 请参见材料表(稀释) 在 PBS 缓冲器中稀释, 其 0.3%-X (PBST) 和10正常山羊血清%。将样品存放在4摄氏度。
  3. 每3次用 PBS 清洗样品10分钟。在适当的二级抗体 (488 和/或 Cy3) 的室温下孵育1小时的样品; 请参阅 PBS 中稀释的稀释材料表。
  4. 每3次用 PBS 清洗样品10分钟。在安装步骤之前, 在 PBS 中用赫斯特染料 (1.5 µM) 孵化样品20分钟。
  5. 使用荧光安装介质和盖玻片在玻璃幻灯片上安装样品。

结果

可塑性和神经元-环境相互作用的多个方面可以用根神经节和一个分离细胞培养模型来研究。我们开始的研究, 通过隔离根背节外植体和根背节衍生的离解细胞, 以示意性代表在图 1。组织和单细胞模型可以通过使用多种分子技术, 如免疫荧光, 西方印迹, 基因组分析, 和其他分析技术, 取决于实验设计和目的的性质。首先, 我们使用我们的根背根外植体模型来研究生物化学线索对...

讨论

前体背节模型对于研究各种事件 (如神经元-胶质细胞相互作用) 以及微环境对神经元和胶质代谢的影响 (37) 极为有用。此外, 根背节模型可作为一种成本效益高的工具, 通过开发前体内系统进行急性慢性和潜伏感染阶段或某种疾病, 以此解决有关致病机制和相关标记的相关问题。此外, 在根背节外植体中的小分子筛查库可以利用这种植块模型进行药物开发。体外...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们衷心感谢中西部大学的影像核心设施 (MWU) 和学生组 [Chanmoly、克里斯托弗 Dipollina、达里尔 Giambalvo 和凯西 Sigerson] 在细胞培养和成像工作中的贡献。这项研究工作得到了 MWU 的内部拨款资助, 用于中频和研究开办基金 V.T。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult Mice NIH/SwissHarlan Laboratories
35mm petri dishCell Treat229635
Matrigel ECMSigma-AldrichE1270gelatinous protein mixture
F12 MediaGibco11765-054*Part of SFM media
Collagenase IVSigma-AldrichC5138
TrypsinSigma-Aldrich25200-056
FBSSigma-AldrichF6178
0.22um filterBD Falcon352350
Neurobasal mediaGibco10888-022
B27 supplementGibco17504-044Supplement for neuronal culture
PSN antibioticsGibco15640-055*Part of SFM media
Antibiotic mixture
L-glutamateSigma-AldrichG7513*Part of SFM media
NGFAlomone LabsN-100Nerve growth factor
Laminin coated coverslideNeuvitroGG-14-Laminin
ONPG subtratePierce34055
X-galInvitrogen15520034
Antibody anti-B-tubulinSigma-AldrichT83281:2000 dilution
Antibody anti-peripherinMilliporeAB15301:1000 dilution
Hoechst dyeThermo Fisher622491.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfateUS BiologicalH1890-100.180555556
Anti gD antibodyVirostat1961:10 dilution
BSA Sigma-AldrichA2153-100G*Part of SFM media
BMEGibco21010-046*Part of SFM media
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)Gibco51300-044*Part of SFM media
Vitamin-CSigma-AldrichA4403*Part of SFM media
PutrescineSigma-AldrichP7505*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)Life TechnologiesA11029
Cy3 (goat anti-rabbit)Jackson Immunoresearch laboratories111-165-003
Normal Goat serum VectorS-1000
Formalin SolutionSigma-AldrichHT5014-120ML
PBSGibco10010-031
Triton-XSigma-AldrichT9284-500ML
VectaShieldVectorH-1500Flurescence mount
Diamond White Glass CoverslidesGlobe Scientific1380-20

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