Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale

Résumé

Dans le présent rapport, les avantages de culture organotypique et dissocié des cultures primaires des ganglions rachidiens provenant de souris sont mises en évidence afin d’étudier un large éventail de mécanismes associés aux interactions neurone-gliales, neuroplasticité, neuroinflammation et réponse à l’infection virale.

Résumé

Ce protocole décrit un modèle ex vivo de souris-dérivé de la racine dorsale ganglions (GRD) explant et in vitro dérivées de DRG co-culture de dissocié des neurones sensoriels et les cellules gliales par satellite. Ce sont des modèles pour étudier diverses réactions biologiques associés à des troubles physiologiques et pathologiques du système nerveux périphérique (PNS) allant des interactions neurone-gliales, neuroplasticité, utiles et polyvalents neuro-inflammation et infection virale. L’utilisation de l’explant DRG est scientifiquement avantageuse par rapport aux modèles de cellules individuelles simpliste pour de multiples raisons. Par exemple, comme une culture organotypique, l’explant DRG permet aux ex vivo le transfert d’un réseau neuronal entier, y compris le microenvironnement extracellulaire qui jouent un rôle important dans toutes les fonctions neuronales et gliales. En outre, DRG explants peuvent également être maintenus ex vivo pour plusieurs jours et les conditions de culture peuvent être perturbées comme vous le souhaitez. En outre, le PMSI récolté peut être dissocié de plus dans une culture mixte in vitro de neurones sensitifs primaires et de cellules gliales par satellite pour étudier les interactions neuronales et gliales, neuritogenesis, interaction cône axonal avec l’extracellulaire microenvironnement et plus généralement, tout aspect lié au métabolisme neuronal. Par conséquent, le système DRG-explant offre une grande flexibilité pour étudier un large éventail d’événements liés à des conditions biologiques, physiologiques et pathologiques de manière rentable.

Introduction

Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode pour obtenir un modèle ex vivo d’organotypique d’un système de modèle DRG souris dérivé comme un micro-environnement tissu préservé pour enquêter sur un large éventail de réactions biologiques aux insultes PNS allant de neurone-gliales interaction, neuroplasticité, marqueurs de l’inflammation, d’infection virale. En outre, nous avons développé plus loin un protocole visant à créer une co-culture primaire de neurones sensoriels unique DRG-dérivés et de cellules satellites.

La DRG sont gris-matière-unités satellites situés à l’extérieur du système nerveux central (CNS) le long des racines spinales dorsales des nerfs rachidiens. Le PMSI, situé à proximité du foramen intervertébral, neurones sensoriels neurone de maison et les cellules gliales par satellite. Les neurone neurones comportent une neurite unique qui se divise en un processus périphérique transportant des apports somatiques et viscérales des périphériques cibles au corps cellulaire et un processus central qui soumet des informations sensorielles du corps cellulaire dans le SNC. Une capsule conjonctive définit et isole ce périphérique cluster des neurones et les cellules gliales du SNC. Aucune migration cellulaire postnatal vers ou à partir de la DRG n’a jamais été décrite et une niche de cellules souches locales est responsable de neurogènes événements qui ont lieu tout au long de la vie¹. Par conséquent, ce modèle est particulièrement adapté pour étudier la neurogenèse adulte, axonogénèse, réponse à une lésion traumatique et cellule mort^{2,3,4,5,6,7 ,8,9} .

Dans le domaine de la neurogenèse, le PMSI récoltées en vivo et explantés in vitro reproduit axonotmésis, une condition de blessures dans les axones sont entièrement rompus et le corps cellulaire neuronal est déconnectée de la cible innervée^{10 ,11}. Il est bien connu que les lésions du nerf périphérique peuvent provoquer l’expression des gènes une diminution et une augmentation dans le PMSI et bon nombre de ces changements sont le résultat de processus de régénération mais beaucoup peuvent aussi être le résultat de la réponse immunitaire ou un autre des cellules non neuronales. En utilisant un ex vivo système de DRG isolé, certaines de cette complexité est retiré et voies mécanistiques puissent être étudiés plus facilement.

En plus de son rôle central dans la transmission des influx sensitifs à la CNS, l’abondance des récepteurs de nombreux neurotransmetteurs dont GABA^12,13,14,15 au niveau du soma neuronal ainsi que preuve d’excitation croisée interneuronales peut suggèrent que les DRG sont sophistiqués intégrateurs préliminaires des inputs sensoriels^16,17. Ces nouveaux résultats confèrent à l’explant DRG les caractéristiques d’un système de réseau neuronal-mini semblable à d’autres modèles de « mini-cerveau », qui sont organoïdes nerveux-tissu-spécifique utilisé pour des champs expérimentaux plus larges enquête et thérapeutique approche de maladies neurologiques^18,19. Ces témoignages ainsi que le fait que le PMSI est un groupe discret et bien défini du tissu neuronal entouré par une capsule conjonctive, en font un organe approprié pour ex vivo de transplantation.

Culture souris DRG présente une option attrayante multicellulaire pour modéliser les pathophysiologies humaines en raison de similitudes structurales et génétiques entre les espèces. En outre, un grand dépôt de lignées de souris transgéniques est très propice à futures études mécanistes. Extension de neurites fois au cours du développement et après une lésion nécessite des interactions mécaniques entre croissance cône et substrat de^20,21. Nano et micro-aux motifs de substrats ont servi d’outils pour diriger la croissance neuritique et démontrer leur capacité à répondre à des caractéristiques topographiques dans leurs biocénoses. Les neurones ont démontré que survivre, adhérer, migrer et orienter leurs axones pour naviguer dans les caractéristiques de surface tels que les rainures dans les substrats^22,23. Toutefois, ces études ont utilisé généralement de lignées de cellules cultivées et il est difficile de prédire comment les cellules primaires neuronale volonté répondre aux repères bien définis, physique in vivo ou ex vivo.

Le modèle ex vivo explant de souris DRG utilisée pour cette proposition imite l’interaction cellule-cellule réelle et les signaux biochimiques qui entourent les axones croissantes. Parmi beaucoup d’autres paradigmes expérimentaux, allant de la régénération axonale, Neurosphère production, à la neuro-inflammation, le PMSI explantation modèle continue à servir comme un outil précieux pour étudier l’aspect viral infection et latence dans sensorielle les ganglions^24,25,26,27.

Le système nerveux (NS) est en général de cible pour les infections virales^28,29,30. La plupart des virus infectent la surface des cellules épithéliales et endothéliales et font leur chemin dans les tissus de surface à la NS par l’intermédiaire de nerf périphérique des fibres sensorielles et motrices. En particulier, le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) après une infection initiale dans les cellules épithéliales établit un temps de latence long de la vie dans les ganglions sensitifs de préférence, le PMSI du PNS^31,32. HSV-1 neuroptropic capacité d’infecter le PNS conduit finalement à des maladies neurologiques,³³.

Protocole

Toutes les procédures y compris l’utilisation des animaux ont été approuvés par l’examen de l’établissement approuvé par le Conseil des protocoles (IACUC-Midwestern University).

1. récolte DRG embryons de souris

1. Euthanasier les souris adultes par méthode d’asphyxie (CO₂) suivis par décapitation. Procéder immédiatement à enlever chirurgicalement la colonne vertébrale.
   1. Exposer la colonne vertébrale en réduisant la couche de peau sur le dos à l’aide des ciseaux. Isoler la colonne vertébrale en coupe par le biais des côtes de chaque côté de la colonne et le sacrum qui la sépare de la colonne vertébrale du reste de l’animal.
   2. Monter la colonne vertébrale (face ventrale vers le haut) sur un tapis chirurgical à l’aide d’aiguilles/pins.
2. Un double à l’aide des ciseaux faire coupe des deux côtés des corps vertébraux à exposer la face ventrale du canal vertébral.
3. Sous un microscope chirurgical (grossissement 4 X la valeur), utiliser des ciseaux pour déplacer doucement la moelle épinière du côté d’exposer les racines spinales dorsales controlatérales et de localiser le PMSI, le long des racines dorsales des nerfs périphériques. Chaque ganglion est partiellement cachée dans le foramen intervertébral.
4. Pour récolter le PMSI, pincer la racine dorsale (entre la moelle épinière et la DRG) avec une pince et tirer doucement sur le PMSI depuis le foramen intervertébral.
5. Placez la deuxième pince sur le nerf rachidien périphériques à la DRG et tirez la DRG avec le nerf spinal et les racines spinales.
6. Placez le PMSI collecté dans une boîte de Pétri contenant 3 mL de sérum glacé médias libres (SFM)³⁴de 35 mm.
7. Transférer chaque DRG individuel dans un verre sec Pétri et, sous un microscope chirurgical, nettoyer et couper les fibres de l’excès et du tissu conjonctif encore attaché à la DRG à l’aide d’une lame. Le PMSI est facilement identifiable comme une structure transparente bulgy le long du nerf rachidien/racine blanche. Les vaisseaux sanguins sont souvent trouvés entourant le PMSI.
8. Placer la DRG nettoyée dans un nouvelle boîte de Pétri contenant glacee médias de GDF.
9. Diluer le mélange de protéines gélatineux (voir Table des matières) dans la GFD glacée (1:1).
10. Plaque le DRG ex vivo dans 12 plats revêtus avec 10/20 µL du mélange de protéine gélatineux et mettez-les à l’intérieur de l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 30 à 60 min.
11. Ajouter doucement 1,5 à 2 mL de l’AFD pour le système de culture pour couvrir l’explant ensemble et maintenir les explants à (37 ° C et 5 % CO₂) des conditions de culture.
    NOTE : Ceci est une étape cruciale car le PMSI est ancré à la vaisselle en verre que par le mélange de protéines gélatineux polymérisé. Temps de polymérisation et de pipetage compétences sont essentiels pour éviter le flottant.
12. Changer le support de plus en plus de DRG toutes les 72 h et laissez la DRG pousse pendant aussi longtemps que nécessaire.

2. isoler les neurones monocellulaire de DRG

1. Place tous la DRG recueilli dans un tube stérile de 1,5 mL à 1,2 mL de F12 médias contenant 1,25 mg/mL de collagénase IV et il incuber à 37 ° C et 5 % CO₂ pendant 45 min. Répétez cette étape pour un autre 45 min après la première incubation.
2. Traiter les explants avec 2 mL de F12 médias contenant de la trypsine (0,025 %) pendant 30 min immédiatement après le traitement de la collagénase IV à 37 ° C et 5 % de CO₂.
3. Incuber avec 2 mL de F12 milieux contenant du sérum de veau fœtal (SVF ; 33 %) à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 15 min.
4. Laver les explants trois fois avec 2 mL de médias F12 et procéder à leur désolidariser mécaniquement avec une pipette de verre jusqu'à ce que les médias devient trouble.
   Remarque : Cette procédure comprend la collecte de DRG nettoyer/piqûre de l’animal, comme expliqué dans la section précédente. Lorsque vous effectuez une dissociation mécanique des explants, Soyez doux et ne pas utiliser une force excessive car elle peut conduire à des débordements et perte de matériel de travail.
5. La culture de cellules dissociées filtrer sur un filtre de 0,22 µm pour éliminer les impuretés et excès de tissu conjonctif. Centrifuger la cellule filtrée lysate à (2 500 x g) pendant 2 min.
6. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de milieux neurobasal contenant du supplément pour culture neuronale (1 x), mélange antibiotique (1 x), L-glutamate (0,5 mM) et le facteur de croissance (5 µg/mL) de nerf (voir Table des matières).
7. Plaque des cellules dissociées sur glissières laminin-enduit couverture (50 µg/mL ; voir Table des matières) à une densité cellulaire préféré. Déterminer la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   NOTE : Nous avons plaqué cellules à 25 000 diapositives de cellules/couvercle. Cette technique permet la dissociation des neurones et de cellules gliales de satellite. Le composant glial cultivé conjointement avec les neurone neurones joue un rôle essentiel pour la survie des neurones.

3. le HSV-1 Infection des Explants DRG et DRG dérivées des cellules dissociées

NOTE : Ce travail a été effectué en suivant strictement les biosécurité niveau 2 (BSL-2) exigences auxquelles nous avons un laboratoire entièrement équipé qui est approuvé par le Comité de biosécurité Midwestern University. Une souche de KOS de HSV-1 a été utilisée dans cette étude. Veuillez prendre les mesures appropriées et des mesures de sécurité selon les directives des institutions locales si vous travaillez avec des souches de virus.

1. Déterminer et préparer le virus dans les dilutions correctes dans les médias de GDF pour infecter le modèle. Le virus utilisé dans cette étude était KOS souche de HSV-1. Lors de l’utilisation des dérivés de DRG dissociées des cellules, utilisez 1 unité de la multiplicité d’infection (MOI) pour l’infection, ce qui signifie que le nombre de virus égale le nombre de cellules.
2. Si infectant DRG des explants, utilisez le numéro des virions (p. ex., 10 000 virions) parce que le nombre exact de cellules dans un explant ne peut pas être déterminé.
3. Placer les explants/cellules infectées par le virus dans une plaque de cellules stérile ou un tube contenant un mélange de médias de gestion durable des forêts et de virus.
   NOTE : Nous avons utilisé des virions 25 000 pour une diapositive de couverture contenant 25 000 cellules (1 MOI). Pour infecter un explant, nous utilisons des virions 10 000.
4. Placer la plaque cellulaire ou du tube à 37 ° C pour l’infection se dérouler ; temps d’exposition virale peut varier selon l’infectivité virale.
   NOTE : L’entrée virale a été confirmée en utilisant ortho-nitrophényl-β-galactoside (ONPG) et 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) essais²⁶.

4. immunofluorescence

1. Difficulté des explants et des échantillons de cellule unique à 4 % de formol préparé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun dans du PBS.
2. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires désirés (anti-β-tubuline, anti-périphérine, anticorps d’anti-héparane sulfate (HS), et/ou anti-glycoprotéine de D (gD) ; Voir Table des matières pour les dilutions) dilués dans un tampon PBS contenant 0,3 % Triton-X (PBST) et 10 % de sérum de chèvre normal. Conserver les échantillons à 4 ° C durant la nuit.
3. Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun avec du PBS. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h dans l’anticorps secondaire approprié (488 et/ou Cy3 ; voir Table des matières pour les dilutions) dilué dans du PBS.
4. Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun avec du PBS. Incuber les échantillons avec un colorant Hoechst (1,5 µM) dans du PBS pendant 20 min avant l’étape de montage.
5. Monter les échantillons sur lames de verre à l’aide d’un milieu de montage de fluorescence et de la lamelle couvre-objet.

Résultats

Plusieurs aspects de la neuroplasticité et neurone-environment interaction peuvent être étudiées à l’aide de DRG et un modèle de culture de cellules dissociées du même. Nous avons commencé les études en isolant un explant DRG et DRG dérivées des cellules dissociées comme schématiquement représentées dans la Figure 1. Les tissus et modèles de cellules individuelles peuvent être analysés en utilisant une variété de techniques moléculaires tels que l’immunofluorescence...

Discussion

Le modèle DRG ex vivo est extrêmement utile d’examiner un large éventail d’événements comme des interactions neurone-glie, ainsi que l’effet du microenvironnement sur ces deux métabolismes neuronales et gliales³⁷. En outre, le DRG-modèle pourrait servir comme un outil économique pour répondre à des questions pertinentes en ce qui concerne le mécanisme pathogène et associés des marqueurs en développant ex vivo des systèmes pour la phase chronique et latente ai...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20