Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

Resumen

En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.

Resumen

Este protocolo describe un modelo ex vivo de raíz dorsal de ratón derivados ganglios (DRG) explante y en vitro derivados de DRG Co cultura de disociado de las neuronas sensoriales y las células glial satélite. Estos son modelos versátiles y útiles para investigar una variedad de respuestas biológicas asociadas con condiciones fisiológicas y patológicas del sistema nervioso periférico (PNS) que van desde la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la infección viral. El uso de explantes de DRG es científicamente ventajoso en comparación con las células simples modelos por múltiples razones. Por ejemplo, como una cultura organotypic, explante GRD permite a transferencia ex vivo de toda una red neuronal como el microambiente extracelular que juegan un papel significativo en todas las funciones neuronales y gliales. Además, DRG explantes pueden también mantener ex vivo para varios días y las condiciones de cultivo pueden ser perturbadas como deseado. Además, el DRG cosechado puede ser disociado más en una cultura Co en vitro de neuronas sensoriales primarias y células glial satélite para investigar la interacción neuronal-glial, neuritogenesis, cono axonal interacción con el medio extracelular microambiente y más general, cualquier aspecto asociado con el metabolismo neuronal. Por lo tanto, el sistema de DRG-explante ofrece una gran flexibilidad para estudiar una amplia gama de eventos relacionados con las condiciones biológicas, fisiológicas y patológicas de una manera rentable.

Introducción

En este manuscrito, se presenta un método para obtener un modelo ex vivo de organotypic de un sistema de modelo de ratón derivado DRG como un microambiente como tejido conservado para investigar una amplia gama de respuestas biológicas a los insultos PNS desde neuronal-glial interacción, neuroplasticidad, marcadores inflamatorios, infección viral. Además, hemos desarrollado un protocolo para crear una cultura co primaria de derivados de DRG solo neuronas sensoriales y las células satélite.

El DRG son gris-materia-unidades satélite situadas fuera de sistema nervioso central (SNC) a lo largo de las raíces espinales dorsales de los nervios espinales. El DRG, situado en la proximidad de los agujeros intervertebrales, las neuronas sensoriales pseudounipolares casa y células gliales por satélite. Las neuronas pseudounipolares tienen una sola neurita que se divide en un proceso periférico lleva entradas somáticas y viscerales de objetivos periféricos al cuerpo de la célula y un proceso central que envía información sensorial del cuerpo celular en el SNC. Una cápsula de tejido conectiva define y aísla esta agrupación periférica de neuronas y células gliales del SNC. Sin migración celular postnatal desde el DRG o nunca se ha descrito y un nicho de células madre local es responsable de eventos neurógeno, que ocurre a lo largo de la vida¹. Por lo tanto, este modelo es particularmente adecuado para el estudio de la neurogénesis adulta, axonogenesis, respuesta a la lesión traumática y la célula muerte^{2,3,4,5,6,7 ,8,9} .

En el campo de Neurorregeneración, el DRG extraídas en vivo y explantado en vitro reproduce axonotmesis, una condición de la lesión en que axones son totalmente roto y el cuerpo neuronal de la célula está desconectada del destino inervados^{10 ,11}. Es bien sabido que lesión periférica del nervio puede causar expresión génica disminución y aumento en el DRG y muchos de estos cambios son el resultado de procesos regenerativos pero muchos también pueden ser el resultado de la respuesta inmune u otra respuesta de las células no neuronales. Mediante el uso de un ex vivo sistema de DRG aislado, algunos de esta complejidad se elimina y vías mecanicistas pueden investigarse más fácilmente.

Además de su papel central en transporte entradas sensoriales al SNC, la abundancia de receptores para muchos neurotransmisores como GABA^12,13,14,15 a nivel del soma neuronal, así como evidencia de excitación de Cruz interneuronal puede sugerir que DRG son sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriales^16,17. Estos nuevos hallazgos confieren al explante DRG las características de un sistema de red mini-neuronal similar a otros modelos "mini cerebro", que son específicos de tejido nervioso organitas utilizado para campos experimentales más amplio de investigación y terapéutica enfoque a enfermedades neurológicas^18,19. Estas evidencias junto con el hecho de que el GRD es un grupo discreto y bien definido de tejido neuronal rodeado por una cápsula de tejido conectiva, hacen que sea un órgano adecuado para el trasplante de vivo ex .

Cultivo ratón DRG presenta una opción atractiva multicelular modelo pathophysiologies humanas debido a las similitudes estructurales y genéticas entre las especies. Además, un gran repositorio de cepas de ratón transgénico es muy propicio para futuros estudios mecanicistas. Extensión del neurite tanto durante el desarrollo y después de la lesión requiere interacciones mecánicas entre crecimiento cono y sustrato^20,21. Nano - y micro-patrón sustratos se han utilizado como herramientas para dirigir la consecuencia del neurite y demostrar su capacidad para responder a las características topográficas en sus microambientes. Han demostrado las neuronas para sobrevivir, se adhieren, migran y orientar sus axones para navegar características superficiales como surcos en sustratos^,,²²²³. Sin embargo, estos estudios han utilizado típicamente líneas de cultivo de células y es difícil predecir cómo primarios neuronales células voluntad responde a pautas bien definidas, física en vivo o ex vivo.

El modelo de explante ex vivo del ratón DRG utilizado para esta propuesta imita la interacción célula-célula real y señales bioquímicas que rodea los axones creciente. Entre muchos diferentes paradigmas experimentales que van desde la regeneración axonal, desarrolló la producción, neuroinflamación, el DRG explante modelo continúa sirviendo como una herramienta valiosa para investigar el aspecto de la infección y la latencia viral en sensorial los ganglios^24,25,26,27.

El sistema nervioso (NS) en general es blanco para infecciones virales^28,29,30. Mayoría de los virus infecta las superficies de células epiteliales y endoteliales y hace su camino desde la superficie del tejido a NS a través de nervios periféricos las fibras sensoriales y motoras. En particular, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) después de una infección inicial en las células epiteliales establece un estado de vida latente en los ganglios sensoriales preferiblemente, el DRG del PNS^31,32. HSV-1 neuroptropic capacidad de infectar el PNS en último término conduce a enfermedades neurológicas³³.

Protocolo

Todos los procedimientos incluyendo el uso de los animales han sido aprobados por los protocolos de aprobado por la Junta de revisión institucional (IACUC Midwestern University).

1. recolección de DRG de embriones de ratón

1. Eutanasia a los ratones adultos por método de asfixia (CO₂) seguidos de la decapitación. Inmediatamente proceder a extirpar quirúrgicamente de la columna vertebral.
   1. Exponer la columna vertebral por el corte hacia abajo de la capa de la piel dorsal con unas tijeras finas. Aislar la columna vertebral por el corte a través de las costillas a ambos lados de la columna y el sacro separar la columna vertebral del resto de los animales.
   2. Monte la columna vertebral (ventral hacia arriba) sobre una colchoneta quirúrgica utilizando agujas/alfileres.
2. Con tijeras finas hacen un doble corte en ambos lados de los cuerpos vertebrales para exponer el lado ventral del canal vertebral.
3. Microscopio quirúrgico (ampliación a 4 X), use tijeras para mover suavemente la médula espinal en el lado para exponer las raíces espinales dorsales contralaterales y localizar el DRG, a lo largo de las raíces dorsales de los nervios periféricos. Cada ganglio está parcialmente escondido dentro de los agujeros intervertebrales.
4. Para cosechar el DRG, pellizcar la raíz dorsal (entre la médula espinal y el DRG) con una pinza y tire suavemente hacia fuera del DRG del agujero intervertebral.
5. Coloque la segunda pinza en el nervio espinal periférico para el DRG y tire el DRG junto con el nervio espinal y la raíz espinal.
6. Coloque el DRG recogido en una placa de Petri que contiene 3 mL de suero helado libre media (MFS)³⁴de 35 mm.
7. Transferir cada DRG individual en un vaso seco de Petri, microscopio quirúrgico, limpieza y recorte el exceso fibras y tejido conectivo fijados al DRG usando una hoja de. El DRG es fácilmente identificable como una estructura transparente abultada a lo largo de la raíz de nervio espinal blanco. Los vasos sanguíneos a menudo se encuentran alrededor del DRG.
8. Coloque el DRG limpio en una nueva placa de Petri que contiene medios SFM helados.
9. Diluir la mezcla de proteína gelatinosa (véase Tabla de materiales) en SFM helada (1:1).
10. El DRG ex vivo en placas de 12 pocillos había cubierto primero con 10/20 μl de mezcla de proteína gelatinosa y establecer dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 30-60 minutos.
11. Suavemente agregar 1.5-2 mL de SFM para el sistema de cultivo cubre el explante entero y mantener los explantes en el cultivo de las condiciones (37 ° C y 5% CO₂).
    Nota: Este es un paso crítico ya que el DRG está anclado a los platos de vidrio solamente por la mezcla de proteína gelatinosa polimerizado. Tiempo de polimerización y pipeteo habilidades son fundamentales para evitar la flotación.
12. Cambiar el medio de cultivo DRG cada 72 h y dejar que el DRG a crecer para siempre y cuando sea necesario.

2. aislar las neuronas unicelular de DRG

1. Lugar el DRG recoger en un tubo estéril de 1.5 mL con 1,2 mL de medio de F12 que contiene 1,25 mg/mL de colagenasa IV e incubar a 37 ° C y 5% CO₂ para 45 min Repita este paso para otro 45 min después de la primera incubación.
2. Tratamiento de explantes con 2 mL de medio de F12 que contiene tripsina (0.025%) durante 30 minutos inmediatamente después del tratamiento de la colagenasa IV a 37 ° C y 5% CO₂.
3. Incubar con 2 mL de medio de F12 que contenga suero fetal bovino (FBS; 33%) a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 15 minutos.
4. Lavar los explantes tres veces con 2 mL de medio de F12 y proceder mecánicamente saldarse con una pipeta de vidrio hasta que los medios de comunicación se vuelve turbia.
   Nota: Este procedimiento implica la colección de DRG limpiar/recortado del animal como se explica en la sección anterior. Al realizar la disociación mecánica de explantes, ser suave y no use fuerza excesiva ya que puede conducir a derrames y la pérdida de material de trabajo.
5. Filtrar el cultivo de células disociadas a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier impurezas y exceso de tejido conectivo. Centrifugar el filtrado celular lysate (2.500 x g) durante 2 minutos.
6. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 500 μl de neurobasal medios que contenga suplemento para cultivo neuronal (1 x), mezcla antibiótica (1 x), L-glutamato (0,5 mM) y nervio del factor de crecimiento (5 μg/mL) (véase Tabla de materiales).
7. Las células disociadas en diapositivas cubierta revestida de laminina (50 μg/mL; véase Tabla de materiales) de la placa a una densidad celular preferido. Determinar la densidad celular usando un contador de células.
   Nota: Nos plateó las células de 25.000 diapositivas de las células de la cubierta. Esta técnica permite la disociación de las neuronas y células glial satélite. El componente glial cultivado conjuntamente con las neuronas pseudounipolares juega un papel fundamental para la supervivencia neuronal.

3. HSV-1 infección de explantes DRG y las células disociadas derivadas de DRG

Nota: Este trabajo se realizó siguiendo estrictamente los bioseguridad nivel 2 (BSL-2) requisitos a los que tenemos un laboratorio totalmente equipado que es aprobado por el Comité de bioseguridad Midwestern University. En este estudio se usó una cepa KOS de HSV-1. Por favor tome medidas apropiadas de seguridad y según las directrices de las instituciones locales si se trabaja con cepas de virus.

1. Determinar y preparar el virus en las diluciones correctas en medio SFM para infectar al modelo. Los virus utilizados en este estudio fue cepa KOS de HSV-1. Cuando trabajo con derivados de DRG disocia células, utilizar 1 unidad de la multiplicidad de infección (MOI) para la infección, lo que significa el número de virus igual el número de células.
2. Si infección DRG explantes, utilice el número de viriones (p. ej., 10.000 viriones) porque no se puede determinar un número exacto de las células en un explante.
3. Coloque el explante/células infectadas con el virus en una placa celular estéril o tubo que contiene una mezcla de medios SFM y virus.
   Nota: Se utilizaron 25.000 viriones para una diapositiva de cubierta que contiene 25.000 células (1 MOI). Para infectar un explante, usamos 10.000 viriones.
4. Coloque la placa de la célula o el tubo a 37 º C para infección ocurrir; tiempo de exposición viral puede variar dependiendo de la infectividad viral.
   Nota: Entrada Viral fue confirmada utilizando Orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) y 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) ensayos²⁶.

4. inmunofluorescencia

1. Fijar los explantes y unicelular muestras en formol al 4% preparado en tampón fosfato salino (PBS). Lavar las muestras durante 10 minutos 3 veces en PBS.
2. Incubar las muestras con anticuerpos primarios deseados (anti-β-tubulina, anti-peripherin, anticuerpos de anti-heparán sulfato (HS), o contra la glicoproteína D (gD); véase Tabla de materiales para las diluciones) diluidos en tampón PBS con 0.3% Triton-X (SAFT) y 10 % de suero normal de cabra. Almacenar las muestras a 4 ° C durante la noche.
3. Lavar las muestras durante 10 minutos con PBS 3 veces. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 hora en el correspondiente anticuerpo secundario (488 o Cy3; véase Tabla de materiales para las diluciones) diluido en PBS.
4. Lavar las muestras durante 10 minutos con PBS 3 veces. Incubar las muestras con colorante Hoechst (1,5 μm) en PBS durante 20 minutos antes del paso de montaje.
5. Montar las muestras en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos.

Resultados

Múltiples aspectos de la interacción de la neuroplasticidad y la neurona y el medio ambiente se pueden investigar mediante DRG y un modelo de cultura de célula disociados. Comenzamos los estudios aislando un explante de GRD y las células disociadas derivadas de DRG como esquemáticamente representadas en la figura 1. Modelos de células y tejidos pueden ser analizados usando una variedad de técnicas moleculares como la inmunofluorescencia, Western blot, ensayos de genómicos y otras té...

Discusión

El modelo ex vivo DRG es muy útil para investigar una amplia gama de eventos como interacción neurona-glia, así como el efecto del microambiente en ambos el metabolismo neuronal y glial³⁷. Además, el DRG-modelo podría utilizarse como una herramienta rentable para abordar preguntas relevantes sobre el mecanismo patogénico y asociado marcadores desarrollando ex vivo sistemas para fase aguda crónica y latente de la infección o de una determinada enfermedad. Además, una bibl...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20