Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

Resumo

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Resumo

Este protocolo descreve um modelo ex vivo de rato-derivado de raiz de dorsal gânglio (DRG) explante e in vitro DRG-derivado co-cultura de neurônios sensoriais dissociados e células gliais do satélite. Estes são modelos útil e versátil para investigar uma variedade de respostas biológicas, associados a condições fisiológicas e patológicas do sistema nervoso periférico (SNP) variando de interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e infecção viral. O uso de explant DRG é cientificamente vantajoso em relação aos modelos de células únicas simplista, por várias razões. Por exemplo, como uma cultura de organotypic, o explante DRG permite transferência ex vivo de toda uma rede neuronal incluindo o microambiente extracelular que desempenham um papel significativo em todas as funções neuronais e gliais. Além disso, DRG explantes também podem ser mantidas ex vivo por vários dias e as condições de cultura podem ser perturbadas como desejado. Além disso, a DRG colhido pode ser dissociado ainda mais em uma em vitro co-cultura de neurônios sensoriais primários e células gliais satélites para investigar a interação neuronal-gliais, neuritogenesis, interação de cone axonal com o extracelular microambiente e mais geral, qualquer aspecto associado com o metabolismo neuronal. Portanto, o sistema de DRG-explante oferece uma grande flexibilidade para estudar uma grande variedade de eventos relacionados às condições biológicas, fisiológicas e patológicas em uma maneira cost-effective.

Introdução

Neste manuscrito, relatamos um método para obter um modelo ex vivo de organotypic de um sistema de modelo DRG rato derivado como um microambiente de tecido-como preservado para investigar uma ampla gama de respostas biológicas aos insultos PNS variando de neurônio-glia interação, neuroplasticidade, marcadores inflamatórios, a infecção viral. Além disso, temos desenvolvido um protocolo para criar uma cultura co primária de neurônios sensoriais único DRG-derivado e células satélites.

A DRG são cinza-matéria-unidades-satélites localizadas fora do sistema nervoso central (CNS) junto as raízes na espinha dorsais dos nervos espinhais. A DRG, localizado nas proximidades do Forame intervertebral, casa pseudounipolar neurônios sensoriais e por satélite células gliais. Os neurônios pseudounipolar apresentam um único axônio que se divide em um processo periférico transportando insumos somáticos e viscerais de alvos periféricos para o corpo celular e um processo central que envia informações sensoriais do corpo celular para o CNS. Uma cápsula Conectiva define e isola este aglomerado periférico de neurônios e células gliais do SNC. Sem migração celular pós-natal para ou a partir da DRG já foi descrita e um nicho de células-tronco local é responsável por neurogênicos eventos que ocorrem ao longo da vida¹. Portanto, este modelo é particularmente adequado para estudar a neurogénese adulta, axonogênese, resposta a lesão traumática e célula morte^{2,3,4,5,6,7 ,8,9} .

No campo das Epilepsias, DRG colhidos na vivo e explantados em vitro reproduz axoniotmese, uma condição de lesão na quais axônios são totalmente cortados e o corpo celular neuronal é desconectada o alvo inervado^{10 ,11}. É sabido que lesão de nervo periférico pode causar aumento e diminuição da expressao em DRG e muitas destas alterações são resultado de processos regenerativos, mas muitos também podem ser um resultado da resposta imune ou outra resposta de células não-neuronais. Usando um ex vivo sistema de DRG isolada, um pouco dessa complexidade é removido e vias mecanicistas podem ser investigadas mais facilmente.

Além de seu papel central na transmissão de entradas sensoriais ao SNC, a abundância de receptores para muitos neurotransmissores incluindo GABA^12,13,14,15 a nível do soma neuronal, bem como provas de interneuronal Cruz-excitação podem sugerir que DRG são sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriais^16,17. Estas novas descobertas conferem ao explante DRG as características de um sistema de rede mini-neuronal semelhante a outros modelos de "mini cérebro", que são organoids nervoso-tecido-específica usada para campos experimentais mais amplos de investigação e terapêutica abordagem de doenças neurológicas^18,19. Estas evidências juntamente com o facto do DRG um cluster discreto e bem definido de tecido neuronal, rodeado por uma cápsula conectiva, torná-lo um órgão apropriado para transplante ex vivo .

Rato de cultivo DRG apresenta uma opção atraente multicelular para modelar pathophysiologies humanos devido às similaridades estruturais e genéticas entre as espécies. Além disso, um grande repositório de cepas de rato transgénico é muito propício para futuros estudos mecanicistas. Extensão do axônio tanto durante o desenvolvimento e após lesão requer interações mecânicas entre crescimento cone e substrato^20,21. Substratos nano e microcom estampas têm sido usados como ferramentas para direcionar a consequência natural do axônio e demonstrar a sua capacidade para responder às características topográficas no seu microambiente. Os neurônios foram mostrados para sobreviver, aderir, migrar e orientar seus axônios para navegar características de superfície tais como sulcos em substratos^22,23. No entanto, estes estudos utilizaram tipicamente linhas de células cultivadas e é difícil prever como neuronal primária as células irá responder às sugestões bem definidas e física na vivo ou ex vivo.

O modelo ex vivo explante de rato DRG usado para esta proposta imita a interação célula-célula real e bioquímicas sugestões em torno de axônios crescentes. Entre muitos diferentes paradigmas experimentais variando de regeneração axonal, produção de neurosphere, a neuroinflammation, a DRG explant modelo continua a servir como uma valiosa ferramenta para investigar o aspecto de latência e infecção viral dentro sensorial gânglios^24,25,26,27.

Sistema nervoso (NS) em geral é alvo para infecções virais^28,29,30. A maioria dos vírus infectam superfícies de células epiteliais e endoteliais e fazer o seu caminho desde a superfície do tecido para o NS através de nervo periférico fibras sensoriais e motoras. Em particular, o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) após uma infecção inicial nas células epiteliais estabelece uma latência ao longo da vida nos gânglios sensoriais, de preferência, a DRG da PNS^31,32. HSV-1 neuroptropic capacidade de infectar o PNS acaba por conduzir a doenças neurológicas³³.

Protocolo

Todos os procedimentos, incluindo o uso dos animais foram aprovados pelos protocolos de aprovado Conselho de revisão institucional (IACUC-Midwestern University).

1. colheita DRG de embriões do rato

1. Eutanásia de ratos adultos pelo método de asfixia (CO₂) seguidos por decapitação. Seguir para a coluna vertebral de remover cirurgicamente.
   1. Expor a coluna vertebral, reduzindo a camada de pele dorsalmente, usando tesouras bem. Isole a coluna vertebral, cortando através das costelas de cada lado da coluna e Sacro separando a coluna vertebral do resto do animal.
   2. Monte a coluna vertebral (lado ventral para cima) para uma esteira cirúrgica usando agulhas/pinos.
2. Usando uma tesoura fina faça um duplo corte em ambos os lados dos corpos vertebrais para expor o lado ventral do canal vertebral.
3. Sob um microscópio cirúrgico (ampliação definido como 4 X), use a tesoura para mover suavemente a medula espinhal do lado para expor as raízes na espinha dorsais contralaterais e localize o DRG, junto as raízes dorsais dos nervos periféricos. Cada gânglio é parcialmente escondido dentro do Forame intervertebral.
4. Para colher o DRG, comprima a raiz dorsal (entre a medula espinhal e o DRG) com uma pinça e puxe delicadamente para fora o DRG do Forame intervertebral.
5. Coloque a segunda pinça no nervo espinhal periféricas para o DRG e puxe o DRG juntamente com o nervo espinhal e a raiz da coluna vertebral.
6. Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri contendo 3 mL de soro gelado mídia livre (SFM)³⁴de 35 mm.
7. Transferir cada DRG individual em um vidro seco de Petri e, sob um microscópio cirúrgico, limpe e retire as fibras em excesso e ainda ligado ao DRG usando uma lâmina de tecido conjuntivo. A DRG é facilmente identificável como uma barrigudo estrutura transparente ao longo da nervo espinhal/raiz branca. Os vasos sanguíneos muitas vezes encontram-se em torno da DRG.
8. Coloque o DRG limpo em uma nova placa de Petri contendo mídia gelada de SFM.
9. Dilua a mistura gelatinosa de proteína (ver Tabela de materiais) em gelada SFM (1:1).
10. Placa da DRG ex vivo em placas boas 12 pré-revestido com 10/20 µ l de mistura gelatinosa da proteína e defini-las dentro da incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ por 30-60 min.
11. Delicadamente adicione 1,5-2 mL de SFM no sistema de cultura para cobrir o explante inteiro e manter os explantes em cultivo condições (37 ° C e 5% CO₂).
    Nota: Este é um passo crítico porque DRG é ancorado para os pratos de vidro apenas pela mistura polimerizada proteína gelatinoso. Tempo de polimerização e pipetagem habilidades são essenciais para evitar flutuação.
12. Alterar o meio de cultivo DRG cada 72 h e deixar o DRG crescer para contanto que precisava.

2. isolar neurônios única célula de DRG

1. Lugar o DRG todos coletados em um tubo estéril de 1,5 mL com 1,2 mL de F12 mídia contendo 1,25 mg/mL de colagenase IV e -incubar a 37 ° C e 5% de CO₂ por 45 min. Repita este passo para mais 45 minutos após a primeira incubação.
2. Trate de explantes com 2 mL de F12 mídia contendo tripsina (0.025%) durante 30 minutos imediatamente após o tratamento de colagenase IV em 37 ° C e 5% de CO₂.
3. Incube com 2 mL de F12 mídia contendo soro bovino fetal (FBS; 33%) a 37 ° C e 5% CO₂ por 15 min.
4. Lave explantes três vezes com 2 mL de mídia F12 e prossiga para dissociar--los mecanicamente com uma pipeta de vidro até que a mídia se transforma nublada.
   Nota: Este procedimento envolve a coleta de DRG limpar/aparada do animal como explicado na seção anterior. Ao executar a dissociação mecânica de explantes, seja gentil e não exerça força excessiva, uma vez que pode levar a derrames e perda de material de trabalho.
5. A cultura de células dissociadas do filtro através de um filtro de 0,22 µm para remover quaisquer impurezas e o excesso de tecido conjuntivo. Centrifugue o filtrado celular lisado a (2.500 x g) por 2 min.
6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de neurobasal mídia que contém o suplemento para cultura neuronal (1x), mistura de antibiótica (1x), L-glutamato (0,5 mM) e fator de crescimento (5 µ g/mL) do nervo (ver Tabela de materiais).
7. As células dissociadas em slides capa laminina-revestido (50 µ g/mL; ver Tabela de materiais) da placa em uma densidade de celular preferido. Determine a densidade de células usando um contador de célula.
   Nota: Nós chapeado células no slide de células/tampa 25.000. Esta técnica permite a dissociação de neurônios e células gliais do satélite. O componente glial co cultivado com os neurônios pseudounipolar desempenha um papel crítico para a sobrevivência neuronal.

3. HSV-1 infecção de explantes DRG e DRG-derivado de células dissociadas

Nota: Este trabalho foi feito seguindo estritamente os requisitos de (BSL-2) de nível 2 de biossegurança a que nós temos um laboratório totalmente equipado que é aprovado pelo Comitê de biossegurança Midwestern University. Neste estudo, utilizou-se uma estirpe de KOS de HSV-1. Por favor tome medidas adequadas e precauções de segurança, conforme orientações de instituições locais se trabalhando com estirpes de vírus.

1. Determinar e preparar o vírus nas diluições em meios SFM infectar o modelo corretos. O vírus utilizado neste estudo foi KOS estirpe de HSV-1. Quando trabalhando com derivados de DRG dissociada de células, use 1 unidade da multiplicidade de infecção (MOI) para a infecção, o que significa o número de vírus igual o número de células.
2. Se infectar DRG explants, use o número de virions (por exemplo, 10.000 virions) porque não é possível determinar um número exato de células em um explante.
3. Coloque as explante/células infectadas com o vírus em uma placa de células estéreis ou tubo contendo uma mistura de SFM media e vírus.
   Nota: Usamos 25.000 virions para um slide de capa contendo 25.000 células (1 MOI). Para infectar um explante, usamos 10.000 virions.
4. Coloque a placa de células ou o tubo a 37 ° C para a infecção ocorrer; tempo de exposição viral pode variar dependendo da infectividade viral.
   Nota: Entrada Viral foi confirmada usando orto-nitrofenil-β-galactoside (ONPG) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) ensaios²⁶.

4. imunofluorescência

1. Corrigi os explantes e única célula amostras em formol 4%, preparado em tampão fosfato soro fisiológico (PBS). Lave as amostras por 10 min cada por 3 vezes em PBS.
2. Incubar as amostras com anticorpos primários desejados (anti-β-tubulina, anti-peripherin, anti-heparan sulfato (HS), e/ou antiglicoproteína anticorpos de D (gD); ver Tabela de materiais para as diluições) diluídos em tampão PBS com 0,3% Triton-X (PBST) e 10 % de soro de cabra normal. Armazenar as amostras em 4 ° C durante a noite.
3. Lave as amostras por 10 min cada com PBS por 3 vezes. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h em anticorpo secundário apropriado (488 e/ou Cy3; consulte Tabela de materiais para as diluições) diluído em PBS.
4. Lave as amostras por 10 min cada com PBS por 3 vezes. Incube as amostras com corante Hoechst (1,5 µM) em PBS por 20 min antes da etapa de montagem.
5. Monte as amostras em lâminas de vidro usando um meio de montagem de fluorescência e lamela.

Resultados

Múltiplos aspectos da interação neuroplasticidade e neurônio-ambiente podem ser investigados usando DRG e um modelo de cultura única célula dissociada. Começamos os estudos isolando um explante DRG e células dissociadas DRG-derivado, como esquematicamente representadas na Figura 1. Ambos os tecidos e modelos de células únicas podem ser analisados usando uma variedade de técnicas moleculares, tais como a imunofluorescência, Western blot, ensaios de genômicos e outras técnicas an...

Discussão

O modelo ex vivo DRG é extremamente útil para investigar um amplo espectro de eventos tais como interação neurônio-glia, bem como o efeito do microambiente em ambos do metabolismo neuronal e glial³⁷. Além disso, a DRG-modelo poderia ser usado como uma ferramenta de baixo custo para abordar questões relevantes referentes ao mecanismo de patogenicidade e associado a marcadores desenvolvendo ex vivo sistemas para fase aguda de crônica e latente da infecção, ou em uma deter...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20