Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

Summary

בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר מודל ex-vivo של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים (DRG) explant במבחנה DRG-derived משותף ותרבות של חלופה מועדפת החישה הניריונים ותאי גלייה בלוויין. אלו דגמים שימושי ופסיביות לחקור מגוון רחב של תגובות ביולוגיות המשויך בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) החל אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, זיהום ויראלי. השימוש DRG explant הוא מדעית יתרון בהשוואה למודלים פשטנית תאים בודדים מסיבות רבות. למשל, כמו תרבות organotypic, explant DRG מאפשר העברה ex-vivo של הרשת העצבית כולה כולל את microenvironment חוץ-תאית לשחק תפקיד משמעותי כל הפונקציות עצביים, גליה. עוד יותר, DRG explants יכול גם להישמר שמחוץ במשך מספר ימים ועל תנאי התרבות יכול להיות מוטרד ככל הרצוי. בנוסף, הרפובליקה שנקטפו יכול להיות עוד יותר הפומבית לתוך במבחנה שיתוף תרבות של נוירונים סנסוריים העיקרי ותאי גלייה בלוויין לחקור אינטראקציה עצביים-גליה, neuritogenesis, חרוט עצב אינטראקציה עם חוץ-תאית microenvironment, כללי יותר, כל היבט המשויך חילוף החומרים עצביים. לכן, המערכת DRG-explant מציע מידה רבה של גמישות ללימוד מגוון רחב של אירועים הקשורים לתנאי ביולוגי, פיזיולוגיים ופתולוגיים באופן יעיל.

Introduction

כתב יד זה, אנחנו מדווחים שיטה לקבל מודל לשעבר ויוו organotypic של מערכת מודל DRG העכבר נגזר כמו microenvironment כמו רקמות שהשתמרו לחקור מגוון רחב של תגובות ביולוגיות עלבונות מערכת העצבים ההיקפית החל נוירון-גליה אינטראקציה, והנוירולוגיה הפלסטית, סמנים דלקתיים, לזיהום ויראלי... בנוסף, בהמשך פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור תרבות משותפת העיקרי של נגזר DRG נוירונים סנסוריים יחיד ותאים בלוויין.

הרפובליקה הם בלוויין אפור-חומר-יחידות ממוקם מחוץ למערכת העצבים המרכזית (CNS) לאורך עמוד השדרה הגבי שורשי עצבים בעמוד השדרה. הרפובליקה, הממוקם בסמיכות foramina בין-חולייתי, בית pseudounipolar החישה הניריונים, לוויין גלייה. הנוירונים pseudounipolar כוללים neurite יחיד זה מתפצל תהליך היקפיים נושאת תשומות סומאטית ואת הקרביים של מטרות היקפיים לגוף התא, תהליך מרכזי שישלח מידע חושי מהגוף תא לתוך מערכת העצבים. הלקט חיבור מגדיר ומבודד מקבץ היקפיים של נוירונים ותאי גלייה של מערכת העצבים. אין העברה תא כמחנכת או ממנו הרפובליקה פעם שתיארנו, גומחת תאי גזע מקומי אחראי neurogenic אירועים המתרחשים לאורך כל החיים¹. לכן, מודל זה מתאים במיוחד ללמוד נוירוג'נסיס למבוגרים, axonogenesis, תגובה טראומטית הנגע ו תא מוות^{2,3,4,5,6,7 8, ,9} .

בתחום neuroregeneration, הרפובליקה שנקטפו ויוו , explanted במבחנה מתרבה axonotmesis, מצב הפציעה אקסונים אשר מלא במחוז, הגוף תאים עצביים מנותקת מן המטרה innervated^{10 ,11}. זה ידוע כי פגיעה במערכת העצבים ההיקפית יכול לגרום ירידה ו מוגברת גנים של הרפובליקה, רבים של שינויים אלה הם תוצאה של תהליכי הרגנרציה אך רבים יכול להיות גם תוצאה של התגובה החיסונית או תגובה נוספת מתאי שאינם עצבית. על-ידי שימוש של ex-vivo מערכת מבודדת DRG, חלק המורכבות הזו יוסר ולא מסלולים מכניסטית יכולה להיחקר בקלות רבה יותר.

מלבד תפקידה המרכזי להולכת תשומות חושי אל מערכת העצבים, השפע של קולטני נוירוטרנסמיטרים רבים כולל גאבא^12,13,14,15 ברמה של סומא עצביים וכן עדות interneuronal קרוס-עירור יכול להציע כי DRG הם מתוחכמים אינטגרטורים ראשוני של תשומות חושים^16,17. אלו הממצאים החדשים להתייעץ כדי explant DRG המאפיינים של מערכת רשת עצבית מיני הדומה דגמים אחרים "מיני המוח", אשר organoids עצבני-רקמות ספציפיות בשימוש עבור שדות ניסיוני רחבה יותר של החקירה וטיפוליים הגישה מחלות נוירולוגיות^18,19. הראיות הללו יחד עם העובדה כי הרפובליקה היא אשכול נפרד ומוגדר היטב של הרקמה העצבית מוקף קפסולה חיבור, לעשות את זה איבר מתאים עבור השתלת ex-vivo .

העכבר culturing DRG מציג אפשרות multicellular מושכת לדגם pathophysiologies האדם בשל דמיון גנטי מבניים בין המינים. בנוסף, מאגר גדול של זנים העכבר הטרנסגניים היא תורמת מאוד מכניסטית מחקרים עתידיים. סיומת Neurite במהלך הפיתוח והן לאחר פציעה דורש מכני האינטראקציות בין צמיחה חרוט, המצע^20,21. ננו, מיקרו-בדוגמת סובסטרטים שימשו ככלים neurite תוצר ישיר של להפגין את היכולת שלהם מגיבים לתכונות הטופוגרפי ב- microenvironments שלהם. נוירונים הוכחו לשרוד, דבקים, להעביר, אוריינט אקסונים שלהם כדי לנווט תכונות פני השטח כגון חריצים סובסטרטים^22,23. עם זאת, מחקרים אלה נעזרו בדרך כלל שורות תאים בתרבית וזה קשה לחזות איך ראשי עצביים תאים הרצון להשיב רמזים מוגדרים היטב, פיזית ויוו או ex-vivo.

הדגם explant ex-vivo של העכבר DRG המשמש עבור הצעה זו מחקה את התא אמיתי-תא אינטראקציה, סימנים ביוכימיים סביב האקסונים הגדלים. בקרב רבים שונים פרדיגמות ניסיוני ועד התחדשות עצב, ייצור neurosphere, neuroinflammation, הרפובליקה explant דגם ימשיך לשמש כלי רב ערך לחקור ההיבט זיהום וההשהיה ויראלי בתוך החישה הגרעינים^24,25,26,27.

באופן כללי, מערכת העצבים (NS) הוא יעד עבור זיהומים נגיפיים^28,29,30. רוב הווירוסים להדביק תאים אפיתל, אנדותל משטחים ולעשות דרכם מן הרקמה משטח NS דרך העצבים ההיקפית סיבי ורפלקסי. בפרט, נגיף הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) לאחר זיהום ראשוני בתאי אפיתל יוצר השהיה חיים ארוך בשנת הגרעינים חושית רצוי, הרפובליקה של^31,מערכת העצבים ההיקפית³². HSV-1 neuroptropic יכולת להדביק את מערכת העצבים ההיקפית מוביל בסופו של דבר מחלות נוירולוגיות³³.

Protocol

כל ההליכים לרבות השימוש החיות אושרו על ידי סקירה מוסדיים שאושרו על-ידי לוח הפרוטוקולים (אוניברסיטת נברסקה-IACUC).

1. קצירת DRG מעוברים עכבר

1. המתת חסד העכברים למבוגרים בשיטה חנק (CO₂) ואחריו עריפת ראש. מיד להמשיך בניתוח להסיר את עמוד השדרה.
   1. לחשוף את עמוד השדרה על ידי כריתת לשכבת העור dorsally באמצעות מספריים משובחים. לבודד את עמוד השדרה על ידי גזירה את הצלעות משני צדדיו של העמודה ולפנים הצולב הפרדת בעמודה השדרה משאר החיות.
   2. הר של עמוד השדרה (הגחון בצד למעלה) על גבי שטיחון כירורגי באמצעות מחטים/סיכות.
2. באמצעות מספריים בסדר הפוך כפול חותכים בשני הצדדים של הגופים בחוליות לחשוף את הצד הבטני של תעלת השדרה.
3. תחת מיקרוסקופ כירורגי (הגדלה מוגדרת כ- 4 X), להשתמש במספריים בעדינות להזיז חוט השדרה בצד כדי לחשוף את השורשים בעמוד השדרה הגבי contralateral כדי לאתר את DRG, לאורך שורשי העצבים ההיקפיים העזוב. כל גנגליון חלקית חבוי את foramina בין-חולייתי.
4. הקציר הרפובליקה, לצבוט את השורש העזוב (בין הרפובליקה חוט השדרה) עם מלקחיים אחד ומשוך בעדינות את הרפובליקה של נקב בין-חולייתי.
5. במקום השני המלקחיים על העצב השדרה היקפיים כדי הרפובליקה ומשוך את DRG יחד עם עצבי השדרה בסיס עמוד השדרה.
6. מקם את DRG שנאספו 35 מ מ פטרי המכילות 3 מ"ל של סרום כקרח מדיה פנויה (SFM)³⁴.
7. העברת כל DRG בודדים בכוס יבש פטרי, תחת מיקרוסקופ כירורגי, לנקות, לקצץ את עודף סיבים ואת רקמות החיבור עדיין מחובר הרפובליקה באמצעות להב. הרפובליקה הוא קל לזיהוי כמבנה שקוף וכשכתבתי לאורך השדרה עצב/השורש הלבן. כלי דם לעיתים קרובות נמצאים סביב הרפובליקה.
8. מקום נקי הרפובליקה צלחת פטרי החדש מכיל מדיה מסוג SFM קר כקרח.
9. לדלל את התערובת חלבון ז'לטין (ראה טבלה של חומרים) תוך קר כקרח SFM (1:1).
10. צלחת DRG ex-vivo ב 12-ובכן צלחות מצופה מראש 10/20 µL תערובת חלבונים כמו ג'לי ולהגדיר אותם בתוך החממה-CO של 37 ° C ו- 5%-₂ למשך 30-60 דקות.
11. בעדינות להוסיף 1.5-2 מ"ל של SFM מערכת התרבות לכסות את explant שלמה ולתחזק את explants ב culturing תנאים (37 ° C ו- 5% CO₂).
    הערה: זהו צעד קריטי כי הרפובליקה היא מעוגנת את כלי הזכוכית רק על ידי תערובת חלבונים כמו ג'לי polymerized. הזמן של פלמור ומיומנויות pipetting הם קריטיים כדי למנוע הצפה.
12. לשנות את המדיום של גידול DRG כל 72 h ולתת את DRG לגדול לאורך זמן רב ככל הדרוש.

2. בידוד תא בודד נוירונים מ- DRG

1. המקום כל הרפובליקה שנגבו בשפופרת סטרילי 1.5 mL עם 1.2 מ ל F12 המדיה המכילה 1.25 מ"ג/מ"ל של collagenase הרביעי, דגירה זה ב 37 ° C ו- 5% CO₂ במשך 45 דקות חזור על שלב זה עבור עוד 45 דקות לאחר הדגירה הראשון.
2. לטפל explants עם 2 מ ל F12 המדיה המכילה טריפסין (0.025%) במשך 30 דקות מיד לאחר הטיפול collagenase הרביעי של 37 ° C ו 5% CO₂.
3. דגירה עם 2 מ ל F12 המדיה המכילה סרום שור עוברית (FBS; 33%)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 15 דקות.
4. לשטוף explants שלוש פעמים עם 2 מ ל F12 מדיה והמשך מכנית מביצועם אותם עם פיפטה מזכוכית עד המדיה הופך מעוננים.
   הערה: הליך זה כרוך אוסף של לנקות/גזוז DRG מן החיה כפי שהוסבר בסעיף הקודם. בעת ביצוע מכני דיסוציאציה של explants, תהיה עדין, אל תשתמש בכוח מופרז מאז זה יכול להוביל זליגת ואובדן של חומר עבודה.
5. לסנן את התרבות התא הפומבית דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסרת כל זיהומים, עודף רקמת חיבור. Centrifuge תא המסוננות lysate ב (2,500 x g) למשך 2 דקות.
6. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 500 µL של התקשורת neurobasal המכיל תוספת לתרבות עצביים (1 x), תערובת אנטיביוטיקה (1 x), L-גלוטמט (0.5 מ מ), ואת עצבי פקטורי גדילה (5 µg/mL) (ראה טבלה של חומרים).
7. צלחת התאים dissociated על גבי מכסה מצופה laminin שקופיות (µg 50/mL; ראה טבלה של חומרים)-צפיפות תא המועדפת. לקבוע את צפיפות התאים באמצעות מונה תא.
   הערה: אנחנו מצופה תאים על 25,000 תאים/כיסוי שקופיות. טכניקה זו מאפשרת דיסוציאציה של שני נוירונים ותאי גלייה בלוויין. הרכיב גליה תרבותי משותף עם הנוירונים pseudounipolar תפקיד קריטי להישרדות עצביים.

3. HSV-1 זיהום של DRG Explants ותאים DRG-derived חלופה מועדפת

הערה: עבודה זו נעשה על ידי בקפדנות בעקבות הדרישות (BSL-2) ברמה 2 אבטחה אשר יש לנו מעבדה מאובזר אושרה על ידי הוועדה אבטחה אוניברסיטת נברסקה. זן קוס של HSV-1 נעשה שימוש במחקר זה. נא לקחת את המידות המתאימות ואת אמצעי זהירות לפי הנחיות המוסדות המקומיים אם עובד עם זני וירוס.

1. לקבוע והכן הנגיף דילולים הנכון בתקשורת SFM להדביק את המודל. הווירוס השתמשו במחקר זה היה זן קוס של HSV-1. בעת עבודה עם DRG-derived הפומבית תאים, השתמש 1 יחידה של ריבוי של זיהום (MOI) עבור זיהום, כלומר המספר של וירוס שווה מספר התאים.
2. אם מדביקים DRG explants, להשתמש מספר virions (למשל, 10,000 virions) כי לא ניתן לקבוע את מספר מדויק של תאים explant.
3. המקום התאים/explant כדי להיות נגוע בווירוס צלחת תא סטרילי או שפופרת המכילה תערובת של מדיה מסוג SFM וירוס.
   הערה: השתמשנו 25,000 virions עבור שקופית כיסוי המכיל תאים 25,000 (1 MOI). כדי להדביק את explant, אנו משתמשים 10,000 virions.
4. למקם את התא צלחת או צינור ב 37 ° C זיהום להתקיים; זמן החשיפה ויראלי עשוי להשתנות בהתאם infectivity ויראלי.
   הערה: ערך ויראלי אושר על-ידי שימוש אורתופדיה-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) ו- (X-גל) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside מבחני²⁶.

4. immunofluorescence

1. לתקן את explants ודוגמאות תא בודד בפורמלין 4% מוכן בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). רחץ דגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב- PBS.
2. דגירה בדגימות עם הרצוי נוגדנים הראשי (anti-β-טובולין, anti-peripherin, נוגדן anti-הפאראן גופרתי (HS), ו/או אנטי-גליקופרוטאין D (gD); ראו טבלה של חומרים דילולים) מדולל במאגר PBS עם 0.3% טריטון-X (PBST) ל- 10 % עז נורמלית בסרום. חנות דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. לשטוף את הדגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם PBS. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 1 h בהנוגדן המשני המתאים (488 ו/או Cy3; ראה טבלה של חומרים עבור דילולים) מדולל ב- PBS.
4. לשטוף את הדגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם PBS. דגירה בדגימות עם Hoechst צבען (1.5 מיקרומטר) ב- PBS כעשרים דקות לפני שלב הרכבה.
5. הר הדגימות בשקופיות זכוכית באמצעות קרינה פלואורסצנטית הרכבה בינונית coverslip.

תוצאות

ריבוי הפנים של אינטראקציה והנוירולוגיה הפלסטית ואקולוגיה נוירון יכול ייחקרו באמצעות DRG ודגם תרבות ותא חלופה מועדפת. התחלנו את המחקרים על-ידי בידוד של explant DRG ותאים DRG-derived הפומבית כמו סכמטי מיוצג באיור1. רקמות ומודלים תאים בודדים ניתן לנתח באמצעות מגוון רחב של טכניקות מולקו?...

Discussion

המודל DRG ex-vivo הוא מאוד שימושי לחקור מגוון רחב של אירועים כגון אינטראקציה נוירון-עכשיו, דונלד, כמו גם השפעת microenvironment על שני החומרים עצביים, גליה³⁷. עוד, DRG-המודל יכול לשמש ככלי חסכונית כדי לטפל שאלות רלוונטיות לגבי מנגנון פתוגניים ומקושרת סמנים על ידי פיתוח ex- vivo מערכות ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20