Erwachsenen Maus DRG Explant und distanzierte Zellmodelle um Neuroplastizität und Antworten auf ökologische Beleidigungen einschließlich Virusinfektion zu untersuchen

Zusammenfassung

In diesem Bericht werden die Vorteile des organotypischen Kulturen und dissoziierten Primärkulturen von Maus-abgeleitete Dorsal Root Ganglien hervorgehoben, um eine Vielzahl von Mechanismen, die Neuron-Glia-Interaktion, Neuroplastizität zugeordnet zu nehmen, Neuroinflammation und Antwort auf virale Infektion.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine ex Vivo Modell Maus abgeleitet Dorsal Root Ganglien (DRG) Explant und in-vitro- DRG-abgeleitete Co Kultur der dissoziierten sensorischen Neuronen und Gliazellen Satelliten. Dies sind nützliche und vielseitige Modelle, eine Vielzahl von biologischen Reaktionen im Zusammenhang mit physiologischen und pathologischen Bedingungen des peripheren Nervensystems (PNS) von Neuron-Glia-Interaktion, Neuroplastizität bis hin zu untersuchen, Neuroinflammation und Virusinfektion. Die Nutzung der DRG Explant ist wissenschaftlich vorteilhaft im Vergleich zu simpel Einzelzellen Modellen aus mehreren Gründen. Beispielsweise als eine organotypischen Kultur ermöglicht die DRG Explant ex Vivo Übertragung von ein ganzes neuronalen Netzwerk einschließlich der extrazellulären Mikroumgebung, die eine wichtige Rolle in der neuronalen und glialen-Funktionen. DRG-Explantaten können darüber hinaus auch beibehalten werden, ex Vivo für mehrere Tage und die Kulturbedingungen als gestört werden können die gewünschte. Darüber hinaus kann die geerntete DRG weiter in eine in-vitro- Co Kultur der primären sensorischen Neuronen und Glia Satellitenzellen untersuchen neuronale Glia Interaktion, Neuritogenesis, axonalen Kegel Interaktion mit der extrazellulären getrennt werden Mikroumgebung, und allgemeiner, jeden Aspekt der neuronalen Stoffwechsel zugeordnet. Daher bietet das DRG-Explant System ein hohes Maß an Flexibilität, eine Vielzahl von Veranstaltungen im Zusammenhang mit biologischen, physiologischen und pathologischen Bedingungen in einer kosteneffektiven Weise zu studieren.

Einleitung

In diesem Manuskript berichten wir über eine Methode, um ein organotypischen Ex Vivo Modell der DRG Modellsystem Maus abgeleitet als eine erhaltene Gewebe-wie Mikroumgebung zu untersuchen, eine Vielzahl von biologischen Reaktionen auf PNS Beleidigungen von Neuron-Glia bis hin zu erhalten Interaktion, Neuroplastizität, Entzündungsmarker, Virusinfektion. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll, um eine primäre Co DRG-abgeleitete einzelnen sensorischen Neuronen und Satellitenzellen Evaluierungskultur weiter entwickelt.

Die DRG sind Sat-grau-Materie-Einheiten außerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) entlang der dorsalen Wirbelsäulen Wurzeln der Spinalnerven. Die DRG, befindet sich in der Nähe der Bandscheiben Foramina, Haus pseudounipolar sensorischen Neuronen und Gliazellen Satelliten. Die pseudounipolar Neuronen verfügen über eine einzelne Neuriten, die teilt sich in einen peripheren Prozess mit somatischen und viszeralen Eingänge von peripheren Zielen zum Zellkörper und ein zentrales Verfahren, das sensorischen Informationen vom Zellkörper in das ZNS übermittelt. Eine verbindende Kapsel definiert und isoliert dieser peripheren Cluster von Neuronen und Gliazellen aus CNS. Keine postnatale Zellwanderung zur oder von der DRG hat jemals beschrieben und eine lokale Stammzellnische ist verantwortlich für neurogene Ereignisse im gesamten Leben¹. Daher eignet sich dieses Modell besonders zu studieren adulten Neurogenese, Axonogenesis, Reaktion auf traumatische Läsion und Zelle Tod^{2,3,4,5,6,7 ,8,9} .

Auf dem Gebiet der Neuroregeneration der DRG von in Vivo geerntet und explantierten in Vitro reproduziert Axonotmesis, ein Verletzung Zustand in die Axone vollständig durchtrennt werden und die neuronale Zellkörper ist getrennt vom innervierten Ziel^{10 ,11}. Es ist bekannt, dass periphere Nervenverletzung kann verringerte und erhöhte Genexpression in der DRG verursachen und viele dieser Veränderungen ein Ergebnis der regenerativen Prozesse sind aber viele möglicherweise auch eine Folge der Immunantwort oder eine andere Antwort von nicht-neuronalen Zellen. Mithilfe einer ex Vivo System der isolierten DRG, etwas von dieser Komplexität wird entfernt und mechanistische Wege leichter untersucht werden können.

Neben ihrer zentralen Rolle bei der Vermittlung der Sinneseindrücke, des ZNS, die Fülle der Rezeptoren für viele Neurotransmitter GABA^12,13,14,15 auf der Ebene der neuronalen Soma einschließlich sowie Nachweis der interneuronale Kreuz-Erregung kann vorschlagen, dass DRG sind anspruchsvolle vorläufige Integratoren Sinneseindrücke^16,17. Diese neuen Erkenntnisse verleihen der DRG Explant die Eigenschaften eines Mini-neuronalen Netzwerk-Systems ähnlich wie bei anderen "Mini-Brain"-Modelle, die nervös-Gewebe-spezifische Organellen verwendet für breitere Experimentierfelder Untersuchung sind und therapeutische Umgang mit neurologischen Erkrankungen^18,19. Diese Beweise zusammen mit der Tatsache, dass die DRG ein diskret und gut definierte Cluster neuronale Gewebe umgeben von Bindegewebe Kapsel ist, machen es eine geeignete Orgel für ex-Vivo -Transplantation.

Kultivierung Maus DRG präsentiert mehrzelligen attraktiv, menschliche Krankheitszuständen durch strukturelle und genetische Ähnlichkeiten zwischen den Spezies zu modellieren. Darüber hinaus ist eine große Sammlung von transgenen Mausstämme sehr förderlich für zukünftige mechanistische Studien. Neurit Verlängerung während der Entwicklung und nach einer Verletzung erfordert mechanische Wechselwirkungen zwischen Wachstum Kegel und Substrat^20,21. Nano - und Mikro-gemusterten Substrate wurden als Werkzeuge, direkte Neuriten Auswuchs und demonstrieren ihre Fähigkeit, auf topografische Merkmale in ihrer Mikroumgebungen verwendet. Neuronen haben gezeigt, zu überleben, zu halten, migrieren und ihre Axone um Oberflächeneigenschaften wie Rillen in Substraten^22,23navigieren zu orientieren. Aber diese Studien haben in der Regel kultivierten Zelllinien verwendet und es ist schwer vorherzusagen, wie primäre neuronalen Zellen wird auf klar definierte, körperliche Signale in Vivo und ex Vivoreagieren.

Ex-Vivo Explant Modell Maus DRG verwendet für diesen Vorschlag imitiert die echte Zell-Zell-Interaktion und biochemische Hinweise rund um wachsende Axone. Unter vielen verschiedenen experimentellen Paradigmen von axonalen Regeneration, Neurosphäre Produktion, bis hin zu Neuroinflammation, DRG explant weiterhin Modell als ein wertvolles Instrument zu untersuchen, die virale Infektion und Latenz Aspekt innerhalb von sensorischen dienen Ganglien^24,25,26,27.

Das Nervensystem (NS) ist in der Regel Ziel für virale Infektionen^28,29,30. Die meisten Viren infizieren Epithelzellen und endotheliale Zelloberflächen und ihren Weg von der Oberfläche Gewebe zu NS über periphere Nerven sensorische und motorische Fasern. Vor allem die Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) nach ein Erstinfektion in epithelialen Zellen stellt eine lebenslange Latenz in den sensorischen Ganglien vorzugsweise die DRG der PNS^31,32. HSV-1 Neuroptropic-Fähigkeit der PNS zu infizieren führt letztendlich zu neurologischen Erkrankungen³³.

Protokoll

Alle Verfahren, einschließlich der Verwendung der Tiere sind durch die institutionelle Review Board genehmigten Protokolle (IACUC-Midwestern University) genehmigt worden.

1. Ernte DRG von Mäuseembryonen

1. Einschläfern Sie die Erwachsenen Mäusen durch Erstickung Methode (CO₂) gefolgt von Enthauptung. Fahren Sie sofort mit der Wirbelsäule operativ zu entfernen.
   1. Setzen Sie die Wirbelsäule durch eine Senkung der Hautschicht dorsal mit einer feinen Schere. Isolieren Sie die Wirbelsäule durch Schneiden durch die Rippen auf beiden Seiten der Spalte und durch das Kreuzbein der Wirbelsäule von der Rest des Tieres zu trennen.
   2. Montieren Sie die vertebrale Spalte (ventrale Seite nach oben) auf eine chirurgische Matte mit Hilfe der Nadeln/Pins.
2. Schneiden Sie ein Double mit feinen Schere machen auf beiden Seiten der Wirbelkörper, die Bauchseite den Wirbelkanal verfügbar zu machen.
3. Unter einem Operationsmikroskop (set mit 4 X Vergrößerung) mit einer Schere vorsichtig bewegen das Rückenmark auf der Seite, die kontralateralen dorsalen spinalen Wurzeln freizulegen und die DRG, entlang der dorsalen Wurzeln der peripheren Nerven zu finden. Jedes Ganglion ist teilweise in die Bandscheiben Foramina versteckt.
4. Zur Ernte der DRG, Dorsal Root (zwischen Rückenmark und die DRG) mit einer Zange zusammendrücken und der DRG von Bandscheiben Foramen vorsichtig herausziehen.
5. Legen Sie die zweite Zange auf die Spinalnerven Peripherie zu der DRG und ziehen Sie die DRG zusammen mit den Spinalnerven und spinalen Wurzel zu.
6. Legen Sie die gesammelten DRG in einem 35 mm Petrischale mit 3 mL eiskaltes Serum freie Medien (SFM)³⁴.
7. Übertragen Sie jedes einzelnen DRG in ein trockenes Glas Petrischale, unter einem Operationsmikroskop, reinigen Sie und schneiden Sie überschüssige Fasern und Bindegewebe, die noch an die DRG mit einer Klinge befestigt. Die DRG ist leicht erkennbar als eine bauchige transparente Struktur entlang der weißen Spinalnerven/Wurzel. Blutgefäße sind oft rund um die DRG gefunden.
8. Legen Sie die gereinigte DRG in eine neue Petrischale mit eiskalten SFM-Medien.
9. Verdünnen Sie die gallertartige Proteinmischung (siehe Tabelle der Materialien) im eiskalten SFM (1:1).
10. Platte der DRG ex Vivo in 12-Well Platten vorbeschichtet mit 10/20 µL gallertartige Proteinmischung und setzte sie in die Brutmaschine für 30-60 min bei 37 ° C und 5 % CO₂ .
11. Fügen Sie 1,5-2 mL SFM sanft das Kultursystem zu decken die gesamte Explant Explantaten bei Kultivierung Bedingungen (37 ° C und 5 % CO_{2 hinzu}).
    Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt, da die DRG die Glasschalen nur durch die polymerisierten gallertartige Proteinmischung verankert ist. Zeitpunkt der Polymerisation und Pipettieren Fähigkeiten sind entscheidend für schwimmende zu vermeiden.
12. Das Medium der wachsenden DRG alle 72 h verändern und lassen der DRG für wachsen, so lange wie nötig.

2. isolieren einzelne Zelle Neuronen von DRG

1. Ort die DRG in einem 1,5 mL steriles Röhrchen mit 1,2 mL F12 Medien mit 1,25 mg/mL der Kollagenbildung IV gesammelt und bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 45 min. inkubieren wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 45 Minuten nach der ersten Inkubation.
2. Explantaten mit 2 mL F12 Medien mit Trypsin (0,025 %) für 30 min sofort nach der IV Kollagenase-Behandlung bei 37 ° C und 5 % CO₂zu behandeln.
3. Mit 2 mL F12 Medien mit fetalen bovine Serum (FBS; 33 %) bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 15 min inkubieren.
4. Waschen Sie Explantaten dreimal mit 2 mL F12 Medien zu, und fahren Sie mit mechanisch mit einer Glaspipette distanzieren, bis die Medien trübe werden.
   Hinweis: Dieses Verfahren beinhaltet die Sammlung von reinigen/getrimmt DRG des Tieres wie im vorherigen Abschnitt erläutert. Bei der mechanischen Dissoziation von Explantaten sanft sein und keine Gewalt anwenden, da es zu verschütten und Verlust von Arbeitsmaterial führen kann.
5. Filtern Sie die dissoziierten Zellkultur durch einen 0,22 µm-Filter um überschüssiges Bindegewebe und Verunreinigungen zu entfernen. Zentrifugieren Sie die gefilterten Zelle lysate (2.500 x g) 2 min. lang.
6. Entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL Neurobasal Medien mit Zuschlag für neuronale Kultur (1 X), antibiotische Mischung (1 X), L-Glutamat (0,5 mM), und Nerven-Wachstumsfaktor (5 µg/mL) (siehe Tabelle der Materialien).
7. Platte die dissoziierten Zellen auf Laminin-beschichteten Abdeckung Dias (50 µg/mL; siehe Tabelle Material) auf eine bevorzugte Zelldichte. Bestimmen Sie die Zelldichte Zelle Zähler.
   Hinweis: Wir vernickelt Zellen auf 25.000 Zellen/Titeldia. Diese Technik ermöglicht Dissoziation von Neuronen und Gliazellen Satelliten. Die Glia Komponente CO kultiviert mit den pseudounipolar Neuronen spielt eine entscheidende Rolle für das neuronale überleben.

3. HSV-1 Infektion der DRG Explantaten und DRG-abgeleitete dissoziierten Zellen

Hinweis: Diese Arbeit erfolgte durch streng nach den Biosafety Level-2 (BSL-2) Anforderungen, die haben wir ein voll ausgestattetes Labor, das vom Midwestern University Biosafety Committee genehmigt ist. Ein KOS-Stamm von HSV-1 wurde in dieser Studie verwendet. Bitte nehmen Sie entsprechende Messungen und Sicherheitsvorkehrungen gemäß lokalen Institutionen Richtlinien, wenn mit Virusstämmen arbeiten.

1. Bestimmen Sie und bereiten Sie das Virus in die korrekte Verdünnungen in SFM Medien, das Modell zu infizieren. Das Virus in dieser Studie verwendet wurde KOS Stamm von HSV-1. Beim Arbeiten mit DRG-abgeleitete Zellen getrennt, verwenden Sie 1 Einheit der Multiplizität der Infektion (MOI) für Infektion, d.h. die Anzahl der Virus gleich der Anzahl der Zellen.
2. Wenn explants DRG zu infizieren, verwenden Sie die Anzahl der Virionen (z.B. 10.000 Virionen), da eine genaue Anzahl von Zellen in einem modellabhängigen nicht bestimmt werden kann.
3. Legen Sie die modellabhängigen/Zellen mit Virus in eine sterile Zelle Platte oder Röhrchen mit einer Mischung von SFM Medien und Virus infiziert werden.
   Hinweis: Wir haben 25.000 Virionen für ein Titeldia mit 25.000 Zellen (1 MOI). Um eine Explant infizieren, verwenden wir 10.000 Virionen.
4. Platzieren Sie die Zellplatte oder Röhrchen bei 37 ° C für eine Infektion stattfinden; virale Belichtungszeit variieren je nach virale Infektiosität.
   Hinweis: Virale Eintrag wurde mithilfe von ortho-Nitrophenyl-β-Galactoside (ONPG) und 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) Assays²⁶bestätigt.

4. Immunfluoreszenz

1. Befestigen Sie den Explantaten und einzelne Zellenproben in 4 % Formalin in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereitet. Waschen Sie Proben 3 mal 10 min in PBS.
2. Inkubieren Sie die Proben mit gewünschten primären Antikörper (Anti-β-Tubulin, Anti-Peripherin, Anti-Heparan Sulfat (HS) und/oder Anti-Glykoprotein D (gD) Antikörper; siehe Tabelle der Materialien für Verdünnungen) verdünnt in PBS-Puffer mit 0,3 % Triton-X (PBST) und 10 % normalem Ziegenserum. Speichern Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht.
3. Waschen Sie die Proben 3 mal 10 min mit PBS. Proben bei Raumtemperatur für 1 h in der entsprechenden Sekundärantikörper inkubieren (488 und/oder Cy3; Tabelle der Materialien finden Sie in Verdünnungen) in PBS verdünnt.
4. Waschen Sie die Proben 3 mal 10 min mit PBS. 20 min vor Montage Schritt inkubieren Sie die Proben mit Hoechst Farbstoff (1,5 µM) in PBS.
5. Montieren Sie die Proben auf Objektträgern mit einem Fluoreszenz-Eindeckmittel und Deckglas.

Ergebnisse

DRG und eine Einzelzelle dissoziierten Kultur Modell können mehrere Aspekte der Neuroplastizität und Neuron-Umwelt-Interaktion untersucht werden. Wir begannen die Untersuchungen durch die Isolierung einer DRG Explant und DRG-abgeleitete dissoziierten Zellen wie schematisch in Abbildung 1dargestellt. Gewebe und Einzelzellen-Modelle können mit einer Vielzahl von molekularen Techniken wie Immunfluoreszenz, Western-Blot, genomische Assays und andere analytische Techniken je nach Art der Versu...

Diskussion

Das ex-Vivo DRG Modell ist äußerst nützlich, um ein breites Spektrum an Veranstaltungen wie Neuron-Glia-Interaktion sowie die Wirkung der Mikroumgebung auf beiden neuronalen und Glia-Stoffwechsel-³⁷zu untersuchen. Darüber hinaus das DRG-Modell als ein kostengünstiges Instrument ließe sich relevante Fragen bezüglich pathogenetischen Mechanismen und die damit verbundenen Marker für akute chronische und latente Phase der Infektion oder in einer bestimmten Krankheit ex- Vivo ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mice NIH/Swiss	Harlan Laboratories
35mm petri dish	Cell Treat	229635
Matrigel ECM	Sigma-Aldrich	E1270	gelatinous protein mixture
F12 Media	Gibco	11765-054	*Part of SFM media
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin	Sigma-Aldrich	25200-056
FBS	Sigma-Aldrich	F6178
0.22um filter	BD Falcon	352350
Neurobasal media	Gibco	10888-022
B27 supplement	Gibco	17504-044	Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics	Gibco	15640-055	*Part of SFM media Antibiotic mixture
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G7513	*Part of SFM media
NGF	Alomone Labs	N-100	Nerve growth factor
Laminin coated coverslide	Neuvitro	GG-14-Laminin
ONPG subtrate	Pierce	34055
X-gal	Invitrogen	15520034
Antibody anti-B-tubulin	Sigma-Aldrich	T8328	1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin	Millipore	AB1530	1:1000 dilution
Hoechst dye	Thermo Fisher	62249	1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate	US Biological	H1890-10	0.180555556
Anti gD antibody	Virostat	196	1:10 dilution
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-100G	*Part of SFM media
BME	Gibco	21010-046	*Part of SFM media
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	*Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A)	Gibco	51300-044	*Part of SFM media
Vitamin-C	Sigma-Aldrich	A4403	*Part of SFM media
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505	*Part of SFM media
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029
Cy3 (goat anti-rabbit)	Jackson Immunoresearch laboratories	111-165-003
Normal Goat serum	Vector	S-1000
Formalin Solution	Sigma-Aldrich	HT5014-120ML
PBS	Gibco	10010-031
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
VectaShield	Vector	H-1500	Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides	Globe Scientific	1380-20