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摘要

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的、超灵敏的高通量技术, 它能够从极小的生物样品中详细描述蛋白质及其亚型。下面介绍了一种自动和机器人的方法, 用于检测和量化特定蛋白质及其亚型。

摘要

免疫印迹法已成为许多实验室的常规技术, 用于从生物样品中进行蛋白质的表征。下面的协议提供了一种替代策略, 毛细管等电聚焦 (cIEF), 与传统的免疫印迹法相比有许多优点。这是一种基于抗体的、自动化的、快速的和定量的方法, 在超薄毛细管内发生完全的西方印迹过程。这种技术不需要凝胶转移到膜, 剥离的印迹, 或 x 射线胶片, 这是通常需要的常规免疫印迹法。在这里, 蛋白质被分离根据他们的充电 (电性点; pI), 使用少于微升 (400 nL) 总蛋白质裂解。电泳后, 蛋白质通过紫外线照射固定在毛细血管壁上, 其次是初级和次生 (辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭) 抗体孵化, 通过增强的方法检测其结合化学发光 (ECL), 产生一个光信号, 可以捕获和记录的电荷耦合器件 (CCD) 相机。数字图像可以通过软件进行分析和量化 (峰值区域)。这个高吞吐量程序可以一次处理96个样本;高度敏感, 蛋白质检测在微量范围内;并产生高度可重复性的结果, 因为自动化。当样品数量 (例如组织样本和活检) 是一个限制因素时, 所有这些方面都非常有价值。该技术也有广泛的应用, 包括筛选药物或抗体, 生物标志物发现和诊断目的。

引言

毛细管电聚焦 (cIEF) 是一种基于毛细管的自动免疫分析法, 根据其电荷1、2、3来解析蛋白质。它具有高度的重现性, 能够快速、定量地解决蛋白质及其后 translationally 修饰亚型。它提出了一种替代传统方法, 如西方印迹。虽然西方印迹是非常好的确认存在丰富的蛋白质在容易接近的样品;可变性、时间消耗和准确定量所有目前的挑战, 特别是在检查生物组织样本。事实上, 变异是西方印迹中的一个固有问题, 因为有许多步骤, 例如 SDS 页凝胶的装载和运行, 蛋白质转移到膜上, 用各种试剂孵化 (e., 初级和中级抗体, ECL), 并发展到 x 射线胶片4。目前, 随着化学发光信号 (数字西部) 数字记录的实施, 西方印迹技术正在得到改进。最近, 一个自动化的西方印迹系统已经开发, 即毛细管西部, 这是一个更无免提和无凝胶系统。整个化验是自动化的在样品板材 (样品与所有必要的试剂) 的装载以后入系统3,4。该仪器将执行所有步骤, 如蛋白质分离, 固定化的蛋白质在毛细血管壁, 抗体孵化, 洗涤之间的不同步骤, 以及发展和量化的化学发光信号。因此, 这里提出的 cIEF 程序提供了更高的分辨率和灵敏度。

这种方法是敏感的, 因为信号可以产生和量化从 picograms 的蛋白质1。灵敏度高, 重现性好, 使该技术对临床样品的分析非常有用。它可以检测和区分后翻译修改 (例如,不同的磷酸化蛋白亚型) 的蛋白质。该技术已成功地用于解剖不同的信号通路4,5在临床研究旨在开发新的治疗癌症3, 它具有很大的潜力, 蛋白质生物标志物和药物发现.

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研究方案

1. 细胞培养、刺激和裂解

注意: 此方法可与许多单元格类型一起使用。以人脐静脉内皮细胞 (血管内皮细胞) 为例, 说明该方法的应用。

  1. 培养血管内皮细胞对凝胶涂层, 10 厘米培养皿在内皮细胞基底培养基适当补充 (参见材料表), 并且包含 5% FCS, 表皮生长因子 (5 ng/毫升), 血管内皮生长因子 (VEGF:0.5 ng/毫升), 基本的后代 (10), 胰岛素样生长因子 (20 ng/毫升), 松 (0.2 µg/毫升) 和抗坏血酸 (1 µg/毫升)。
  2. 一夜间用内皮细胞基底培养基补充1% 的细胞, 无生长因子补充。
  3. 吸入所有培养基, 加入2毫升的内皮细胞培养基, 无生长因子 (饥饿培养基) 在一盘 (控制), 然后添加 50 ng/毫升 VEGF 在2毫升的饥饿培养基中的第二道菜7分钟。
  4. 吸入培养基和洗涤细胞2倍, 10 毫升室温 PBS。
  5. 确保培养皿在冰上, 并保持他们在那里从这个步骤开始。
  6. 添加250-400 µL 的冰冷裂解缓冲液 (Bicine/章; 见材料表) 含水蛋白酶抑制剂混合和亚砜抑制剂混合物 (磷酸酶抑制剂; 见材料表), 每10厘米板。旋转盘子, 确保适当的覆盖, 并保持10分钟的冰。
    注: 蛋白酶和亚砜抑制剂混合物的最终浓度应为1x。
  7. 用细胞刮刀刮去盘子里的细胞, 然后转到预冷的离心管。吸管向上和向下5次溶解细胞。
  8. 简要地油脂实验细胞在4°c。设置 sonicator 如下: 循环数 = 5, 电源 = 低, ON = 5 秒, 关闭 = 三十年代。这一步骤包括打破核酸, 而不是溶解细胞。
    注: 超声波应轻度, 以防止蛋白质变性。
  9. 涡流管 5 s (不连续), 2 s 一次 (3 次), 并保持冰。
  10. 用离心法澄清裂解液, 在4摄氏度时以 1.4万 x g 为15分钟, 然后立即将上清液转移到干净的预冷离心管上。
  11. 使用二辛可宁酸 (评估) 蛋白检测试剂盒4测定蛋白质浓度。
  12. 使10µL 整除数, 在干冰或液氮中凝固, 并贮存在-80 摄氏度, 直到使用。

2. 样品混合准备 (计算150µL 样品组合)

  1. 首先, 通过添加1µL 的亚砜抑制剂混合物 (股票 50x) 和2µL 蛋白酶抑制剂 (股票 25x) 到47µL 样品稀释剂 (见材料表), 使稀释剂的混合物, 从而使亚砜抑制剂和蛋白酶抑制剂的最终浓度成为1x。接下来, 稀释蛋白质裂解物使用样品稀释剂混合获得所需浓度 (见步骤 2.3)。
  2. 通过添加3.325 µL 标准梯 (见材料表; 库存 60x)、6µL 蛋白酶抑制剂 (25x)、3µL 的亚砜 (50x) 抑制剂, 制备 ampholyte/阶梯/蛋白酶抑制剂/亚砜抑制剂组合物 (见表材料)。涡流管至少十五年代总, 5 秒 (3-4 次), 并保持冰。
  3. 将步骤2.1 和2.2 中的解决方案与1:3 的比例混合, 使亚砜、蛋白酶抑制剂和 pI 标准阶梯的最终浓度变为 1X, 毛细管中的蛋白质达到最终所需浓度 (例如, 50 µg/毫升用于图 2)。
    注: 在毛细血管和井中蛋白质浓度是相同的。
  4. 将10µL 的样品混合到适当的井中, 根据384井板化验模板的布局 (见步骤3和图 1), 并保持板在冰上。
  5. 稀释初级 (pERK1/2, 1:50;ERK1/2, 1:100;热休克蛋白 70, 1:500) 和二次抗体 (1:300) 与抗体稀释剂 (参见材料表) 和吸管10µL 主要和15µL 二级抗体入每个井。
    注: 一般而言, 与传统的西方印迹相比, cIEF 检测需要更高的抗体浓度。
  6. 混合鲁米诺和过氧化物 XDR (1:1 比率; 看见材料表) 一起和吸管15µL 入每个井。
    注意: 每次使用前都要新鲜的混合这些溶液, 并保持冰块。
  7. 一旦样品和所有试剂被 pipetted 入板材, 离心机板材在 2500 x g 10 分钟在4°c 下转动液体并且去除气泡。如果气泡仍然存在, 请使用细吸管尖端手动取出。
    注: 不要每井装载超过20µL 的样品或试剂;否则, 仪器吸管不能正确清洗。请务必按照说明书从制造商, 以准备所有试剂。

3. 使用系统软件设计新的检测模板 (图 1)

  1. 打开系统软件, 然后从 "文件" 菜单中单击 "新建"。
  2. 转到布局窗格, 并为384井板中的试剂和样品分配位置。每384井板最多可使用96口井。
  3. 通过单击块中任何位置的井进行试剂分配。选择每排12口井的行块。井,例如, 从1-12 或 13-24, 被分配作为块默认情况下。
  4. 转到布局窗格工具栏, 然后插入空行块或示例、主、次或鲁米诺行块。每个块都分配了不同的颜色, 所以它们很容易区分。
    注意: 单击一个井时, 可以在块周围看到一个黑色边框, 在该区块中, 新块将插入到窗格中。也可以删除行块。
  5. 转到 "协议" 窗格, 然后在盘中选择一个试剂位置。然后, 单击 "示例" 列中的某个单元格, 然后从下拉菜单中选择该试剂。
  6. 以同样的方式, 为每个周期选择主要的、次要的和鲁米诺的试剂位置。
  7. 单击第一个或第二个抗体列中的每个单元格, 并在必要时更改孵化时间。
    注意: 也可以添加每个周期的条目备注。
  8. 通过单击 "协议" 部分中的 "添加" 按钮来添加循环。1周期、4个周期或所有周期 (最多可将8个周期添加到协议中)。
    注意: 可以在此步骤中复制和粘贴周期信息: 选择一个周期, 转到编辑, 然后复制和粘贴。
  9. 在 "模板" 窗格中输入与该示例相关的信息, 如主要和次要抗体的标识、其目录号和稀释等。这是在运行后分析过程中有用的可选步骤。
  10. 保存新的检测文件。在单击 "开始" 按钮之前, 请快速检查布局, 确保所有内容都正确无误。

4. cIEF 仪器设置协议

  1. 设置毛细管等电聚焦电泳分离条件。这些应为1.5万µW 和40分钟, 紫外线固定时间应为八十年代。然而, 紫外线固定时间可以设定在 80-140 s 范围内, 可能需要为感兴趣的蛋白质优化。
    注意: 可以为每个周期设置 UV 固定的时间点, 但不能为每一个毛细管设定。
  2. 设置洗涤1到2洗涤, 为150s 每洗涤 (缺省) 和主要抗体孵化为120分钟。
  3. 设置洗涤2到2洗涤, 为150s 每洗涤 (缺省) 和二次抗体孵化为60分钟。
  4. 设置洗涤 3, 应该是2洗涤, 为150s 每洗涤 (缺省)。
  5. 设置暴露时间时, 化学发光将被检测;这些应为30、60、120、240、490和960s。所有步骤 (1-8) 将用单毛细管进行。

5. 运行化验文件

  1. 一旦一切就绪, 请单击 "开始" 开始运行。该软件将提示您去除废料, 重新灌装水和毛细管盒, 添加阳极液和 catholyte 到资源托盘, 增加洗涤缓冲, 最后把盘子装入冷却的样品托盘。
    注: 从毛细管盒中取下盖子, 但不要从化验盘上取下盖子。当有必要时, 仪表板上的盖子可以自动去除。这有助于防止试剂蒸发。
  2. 在运行启动几分钟后, 计算机屏幕上将显示仪表状态栏。状态消息和进度条可以看到对应于仪器的当前阶段。
    注: 最初, 仪器将检查是否一切是正确的, 然后继续把阳极液和 catholyte 进分离托盘, 采摘12毛细血管的第一块, 删除板的盖子, 并放置样品从样品板入毛细血管, 最后进入分离室进行电泳。
  3. 单击 "运行摘要" 屏幕可查看两个窗格: 状态和分隔。用户可以查看运行进度, 当每个周期的电泳步骤完成时, 可以存储分离的电影 (每个周期的12个毛细血管)。要观察毛细管电泳分离, 请在控制面板中单击所需的循环, 然后播放该毛细管中的 "播放" 按钮, 为该毛细管分离影片。
  4. 运行文件可以在运行完成后自动存储。

6. 分析数据 (图 S1)

  1. 打开 "运行文件", 然后选择 "分析屏幕" 选项卡。在图 S1A中, 样本图中显示的数据 (峰值) 来自所选毛细管 (即1 周期的 4 毛细管)。
  2. 单击 "编辑", 然后进行分析 (图 S1B)。在这个阶段, 用户可以改变 pi 范围, 为给定的实验应用适当的 pi 标准, 添加一个峰值匹配, 并添加一个峰值名称。
    注: 使用 ph 值 5-8 ampholyte 预混料 (如此处所称) 时, 推荐使用的标准梯为4.9、6.0、6.4、7.0 和7.3 的荧光标记多肽, 当使用 ph 值3-10 预混料时, 推荐的梯子为4.0 的 pi。、4.9、6.0、6.4 和7.3。2
  3. 结果显示在 "峰值" 选项卡中;为示例显示的值为位置、pI、峰值高度和区域、% 区域、峰值宽度和信号到噪声 (S1C)。选择要使用的数据, 然后导出数据以进行进一步分析。
    注意: 数据只能在标记峰值后导出 (图 S1C)。

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结果

一种新的检测方法的设计:图 1A显示了检测板布局。最大地, 96 个井可以使用从384井板材在12个井块为每个情况 (抗体)。每块12口井都可以从 A1-A12 或 A13-A24 开始。颜色编码行允许一个区分样品或试剂从彼此。在检测模板 (图 1B) 中, 可以存储该特定化验的相关信息, 可用于结果分析的后期阶段。图 1C

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讨论

蛋白质的敏感性和分辨力是生物蛋白质组学研究的关键。能够检测出细胞中微小数量的蛋白质是很有价值的。cIEF 可以为蛋白质及其亚型4的检测提供改进的灵敏度和分辨率。

该技术已成功地应用于许多蛋白质组研究报告5,6,7。尽管如此, 还是有一些限制与它相关, 例如, 并不是所有的主要?...

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披露声明

撰文人没有披露。

致谢

作者感谢瑞典乌普萨拉大学的 Claesson 教授对发展这个项目的支持。此外, 作者感谢罗斯史密斯和莉娜 Claesson 威尔士, 乌普萨拉大学的批评阅读和建议, 以改善手稿。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
NanoPro 1000ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plugProteinSimple040-972Ampholyte premix
DMSO inhibitor mixProteinSimple040-510Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor MixProteinSimple040-482Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3ProteinSimple040-646For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluentProteinSimple040-649
Antibody diluent ProteinSimple040-309
Wash concentrateProteinSimple041-108
Anolyte RefillProteinSimple040-337
Catholyte RefillProteinSimple040-338
Peroxide XDRProteinSimple041-084
LuminolProteinSimple040-652
Bicine/CHAPS Lysis BufferProteinSimple040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for ProteinSimpleCBS700
Assay Plate/Lid KitProteinSimple040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-035-152For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-035-150For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary AntibodyCell Signaling9101For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary AntibodyCell Signaling9102For cIEF used (1: 100)
Compass softwareProteinSimple
HUVECATCCPCS-100-010
MV2 (EBM-2)PromoCell C-22221Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPackPromoCellC-39221Supplementation to MV2 above
VEGFAPeproTech100-20
Long R3 IGFSigma-Aldrich85580C/I1146Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)DiagenodeB01020001
BCA Protein Assay kit Thermo Fischer Scientific23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermo Fischer ScientificNP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)Thermo Fischer ScientificNP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)Thermo Fischer ScientificNP0006
Immobilon PVDF membraneMilliporeIPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

参考文献

  1. O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
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  3. Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
  4. Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683(2016).
  5. Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
  6. Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
  7. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  8. Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6(2016).
  9. Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994(2016).
  10. Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).

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