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要約

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ フォームの検出と定量のためのプロトコルについて説明します。

要約

免疫ブロット生体試料中のタンパク質の特徴の多くの実験室のルーチンの技術となっています。次のプロトコルは、代替戦略を提供、従来免疫ブロット キャピラリー等電の多くの利点 (代表取締役) を中心に比べています。完全な西部のしみが付くプロシージャが起こる超毛細血管内抗体ベース、自動化、迅速かつ定量的な方法です。この手法、しみの除去、膜に転送するゲルを必要としないか、または x 線フィルム、通常従来免疫ブロットを必要です。充満 (等電点; pI) によるを使用してより小さい、1 マイクロリットルの蛋白質の分離、ここ (400 nL) 総蛋白ライセートの。電気泳動後のタンパク質はプライマリとセカンダリ (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役) 続いて、紫外光照射による毛細血管壁に固定化抗体の孵化、バインドは検出が強化されました。化学発光 (ECL)、キャプチャおよび電荷結合素子 (CCD) カメラによって記録が可能な光信号を生成します。デジタル画像分析することができ、定量化 (ピーク面積) ソフトウェアを使用しています。この高スループット プロシージャは、同時に 96 のサンプルを処理できます。非常に敏感な picogram の範囲でタンパク質検出自動化のため再現性の高い結果を生成します。すべてのこれらの側面は、試料 (例えば、ティッシュ サンプルおよび生検) の数量が制限要因非常に貴重です。技術がより広いアプリケーションだけでなく、薬や抗体、バイオ マーカーの探索と診断のためのスクリーニングを含みます。

概要

その電荷1,2,3蛋白を解決する自動、キャピラリーを用いたイムノアッセイ法であるキャピラリー等電集中 (代表取締役)それは高い再現性で迅速かつ定量的に蛋白質とそのファーストクリーニング変更を解決することができます。西部にしみが付くことなど従来の方法に代わるものを提示します。西部にしみが付くことは非常に容易にアクセスできるサンプルの豊富な蛋白質の存在を確認するため良い変動、時間消費、および正確な定量すべての存在の課題、特に生体組織サンプルを調べるとき。確かに、変動は西部にしみが付くことで本質的な問題があると多数手順、読み込みと SDS ページのゲルの実行、膜への蛋白の転送など様々 な試薬と孵化 (e.g、プライマリおよびセカンダリ。ECL 抗体)、x 線フィルム4を開発。現在、西部のしみが付く技術は化学発光信号 (デジタル西部劇) のデジタル録音の実装を改善します。、自動化された西部しみが付くシステムは近年、すなわち毛細血管西部、よりハンズフリーし、ゲル無料システムであります。全体アッセイ システム3,4に次のサンプル プレート (すべての必要な試薬とサンプル) の読み込みを自動化されています。楽器は蛋白質の分離などのすべての手順を実行、抗体の孵化、毛細血管壁へのタンパク質固定化を別の手順と開発化学発光シグナルの定量化と洗います。したがって、ここに示す代表取締役手順は、高い解像度と感度を提供します。

この方法は、機密性の高い信号を生成され、蛋白質1の用いたから定量化することができます。優れた再現性と高感度はこの技術を臨床サンプルの解析に非常に便利になります。それは、検出、蛋白質のポスト並進変更 (例えば、異なるリン酸化タンパク質アイソ フォーム) を区別することができます。この技術は、正常に異なるシグナル伝達経路4,5がん3、新しい治療法を開発することを目指して臨床研究を分析する使用されています、蛋白質バイオ マーカーおよび薬剤の発見のための素晴らしい可能性を持っています。.

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プロトコル

1. セルの換散、刺激、文化

注: このメソッドは、多くの細胞のタイプで使用できます。このメソッドを示すためには、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) の使用例が説明されています。

  1. 文化 10 cm シャーレをゼラチンでコーティングされた、適切な補充と内皮細胞基本培地での比較 (材料の表を参照)、5% の FCS、表皮の成長因子 (5 ng/mL)、血管内皮増殖因子を含有 (VEGF:0.5 ng/mL) 基本的な FGF (10 ng/mL)、インスリン様成長因子 (20 ng/mL)、ヒドロコルチゾン (0.2 μ G/ml) とアスコルビン酸 (1 μ g/mL)。
  2. 1% の FCS と成長因子のないサプリメントを添加した内皮細胞基本培地で細胞を一晩餓死します。
  3. すべての培地を吸引、一皿 (コントロール) の成長因子 (飢餓中) することがなく血管内皮細胞培養培地 2 mL を追加し、2 番目の料理は 7 分間の飢餓培養培地 2 mL に 50 ng/mL VEGF を追加します。
  4. 培地を吸引し、10 mL 室温 PBS で 2 回細胞を洗ってください。
  5. ペトリ皿は氷の上、この手順以降から維持することを確認します。
  6. 氷冷の換散バッファー (ビシン/チャップス; 参照テーブルの材料) 含む水溶液プロテアーゼ阻害剤ミックスと DMSO 阻害剤ミックス (ホスファターゼの抑制剤; 参照テーブルの材料) の 250-400 μ L を各 10 cm プレートに追加します。適切なカバレッジを確保し、10 分間氷の上プレートを旋回します。
    注: プロテアーゼと DMSO 阻害剤ミックスの最終濃度は、1 x をする必要があります。
  7. あらかじめ冷やしておよび microfuge の管にお皿から細胞スクレーパーと転送細胞をこすり。ピペットを上下のセルを示した 5 回。
  8. 4 ° C でセルを簡単に超音波します。超音波発生装置を次のように設定: サイクル数 = 5、電源 = 低、5 秒を =、= 30 s。この手順は含まれている核酸を破るしていない細胞を溶解させます。
    注: 超音波処理はタンパク質の変性を防ぐために穏やかなする必要があります。
  9. 渦管 5 s (ない継続的に) 2 時間 (3 回)、し氷の上で s。
  10. 4 ° C で 15 分間 14,000 × g で遠心分離によってライセートを明確し、すぐにきれいな中古冷蔵および microfuge の管に上清を転送します。
  11. ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キット4を使用して蛋白質の集中を測定します。
  12. 作る 10 μ 因数、スナップ ドライアイスまたは液体窒素で凍結し、使用まで-80 ° C で保存します。

2. 試料ミックス (150 μ L サンプル ミックスの算定)

  1. DMSO 阻害剤ミックスの 1 μ L を追加することによってまず、サンプル希釈ミックスを準備 (50 x 在庫) とプロテアーゼ阻害薬 (在庫 25 x) サンプル希釈液の 47 μ L に 2 μ L (材料の表を参照)、DMSO 阻害剤とプロテアーゼ阻害剤の最終濃度1 倍になります。次に、サンプル希釈ミックスを使用して (手順 2.3 参照) 必要な濃度を取得するタンパク質溶解液を希釈します。
  2. 両性電解質/はしご/プロテアーゼ阻害剤/DMSO 阻害剤ミックスを準備するには、追加し 3.325 μ L 標準はしご (テーブルの材料; 60 倍の在庫を参照)、プロテアーゼ阻害剤 (25 x) 3 μ 137.675 μ L 両性電解質プレミックス (のテーブルを参照する DMSO (50 x) 阻害剤の 6 μ L材料)。渦管少なくとも 15 s、合計 5 時間で s (3-4 回) し、氷の上。
  3. 最終濃度の DMSO、プロテアーゼ阻害剤、および pI 標準はしご 1 X になるし、キャピラリー中でタンパク質最終目的の濃度に達するので、2.1 と 2.2 は比率 1:3 の手順からソリューションをミックス (例えば、50 μ g/mL 用いて図 2)。
    注: 蛋白濃度キャピラリーとも、同じです。
  4. 384 ウェル プレート アッセイのテンプレートのレイアウトに応じて適切な井戸にサンプル ミックスの 10 μ L を読み込む (手順 3 と図 1を参照) し、氷の上のプレート。
  5. 希釈するプライマリ (pERK1/2、1:50;ERK1/2、1: 100。HSP 70、1: 500) および抗体希釈液と二次抗体 (1: 300) (材料の表を参照) を各ウェルに二次抗体のプライマリおよび 15 μ L の 10 μ L をピペットと。
    注: 一般に、抗体の濃度が高く、従来の西部のしみと比べて代表取締役アッセイに必要です。
  6. ルミノールをミックスし、XDR (比率 1:1; 参照テーブルの材料) を一緒に過酸化水素を各ウェルに 15 μ L をピペットします。
    注: は使用前に毎回これらのソリューションの新鮮なをミックスして、氷の上。
  7. サンプルおよびすべての試薬は、プレートに戻は、一度は、スピン ・ ダウン液体と気泡を除去するための 4 ° C で 10 分間 2,500 x g でプレートを遠心します。泡がまだ存在する場合は、細いピペット チップを使用して手動でそれらを削除します。
    注: 以上 20 μ L のサンプルや試薬によくあたりが読み込まれないそれ以外の場合、計測器ピペットを正しく洗浄できません。すべての試薬製造元の取扱説明書に従うことを確認してください。

3. システム ソフトウェア (図 1) と新しいアッセイ テンプレートのデザイン

  1. システム ソフトウェアを開き、[ファイル] メニューから「新規」をクリックします。
  2. レイアウト ペインに移動し、試薬および 384 ウェル プレートのサンプルの場所を割り当てます。96 ウェルの 384 ウェル プレートごとの最大値使用します。
  3. 試薬割り当てをブロックでまあどこでもクリックしてください。12 ウェルの行ブロックを選択します。井戸、例えば1-12 または 13-24 からは既定でブロックとして割り当てられます。
  4. レイアウト ウィンドウのツール バーに移動し、空の行ブロックまたはサンプル、プライマリ、セカンダリ、またはルミノール行ブロックを挿入します。各ブロックには、区別するためなので別の色が割り当てられます。
    注: 井戸をクリックすると、黒い境界線がペインに新しいブロックを挿入、ブロックの周り表示されます。行のブロックを削除することも。
  5. プロトコル] ウィンドウに移動し、プレートに試薬の場所を選択します。[サンプル] 列のセルをクリックし、ドロップ ダウン メニューから、試薬を選択します。
  6. この同じ方法では、各サイクルのルミノールおよびプライマリ、セカンダリ、試薬の場所を選択します。
  7. 1 つずつ、プライマリまたはセカンダリの抗体] 列でセルをクリックし、必要に応じてインキュベーション時間を変更します。
    注: 各サイクルのエントリについての情報を追加もできます。
  8. サイクルを追加するには、プロトコルのセクションの追加」ボタンをクリックします。1 サイクル、4 サイクル、またはすべてのサイクル (8 サイクルの最大値は、プロトコルに追加することができます)。
    注: この手順でサイクルの情報をコピペすることは: サイクルを選択、コピーして貼り付け、編集に行きます。
  9. サンプルでは、第一次および二次抗体、カタログ番号と希釈など、テンプレート ペインでの id などに関連する情報を入力します。これは、実行後の分析中にある省略可能な手順です。
  10. 新しい分析ファイルを保存します。「スタート」ボタンをクリックしてする前にすべてが正しいことを確認するレイアウトをすばやく確認します。

4. 代表取締役計測器の設定のためのプロトコル

  1. キャピラリー等電点電気泳動の分離条件を設定します。これらは 15,000 μ と 40 分をする必要があります、UV 固定時間は 80 にする必要があります s。しかし、紫外線の固定時間 80 140 s の範囲内で設定することができます、興味の蛋白質のために最適化する必要があります。
    注: 各毛細血管ではなく、各サイクルの UV 固定の時点を設定できます。
  2. セットを洗って 1 に 2 洗浄、150 s 各洗浄 (既定値) と 120 分の一次抗体の孵化。
  3. セットを洗う 2 に 2 洗浄、150 s 各洗浄 (既定値) と 60 分のための二次抗体の孵化。
  4. 洗浄 3、150 の 2 洗浄をする必要がありますを設定 s 各洗浄 (既定値)。
  5. 化学発光が認められるときの露光時間を設定します。30、60、120、240、490、960 これらする必要があります s。(1-8) の手順をすべては単一の毛細血管でわれます。

5. 分析ファイルを実行します。

  1. すべてが準備ができていると、開始をクリックして実行を開始します。ソフトウェアは、水と洗浄バッファーを追加する、リソース トレイに陽極と陰極を追加する、キャピラリー ボックスを補充するため、廃棄物を削除するよう指示されます、最後に冷却サンプル トレーにプレートを読み込む。
    メモ: は、キャピラリーのボックスからふたを外すが、アッセイ プレートから蓋を削除しないでください。プレートから蓋は、必要に応じて計測器によって自動的に削除することができます。これは試薬の蒸発を防ぐのに役立ちます。
  2. 実行後、分のカップルが開始された、楽器のステータスバーは、コンピューターの画面に表示されます。ステータス メッセージと進行状況バーは、計測器の現在のステージに対応する見ることが。
    注: 最初に、楽器がチェック、すべてが分離トレイに陽極と陰極をピペットに進む、12 毛細血管の最初のブロックを拾って、プレートの蓋を取り外し、サンプルからサンプルを配置する前に正しいプレート、毛細血管にし、最終的に電気泳動分離室へ。
  3. 2 つのペインを参照してください実行のサマリー画面でクリックして: 状態および分離。ユーザーは、実行の進行状況を表示できます、各サイクルの電気泳動のステップが完了したときに分離 (それぞれのサイクルの 12 毛細血管) の映画を格納できます。キャピラリー電気泳動分離を観察するには、目的のサイクルをクリックし、コントロール パネルの再生ボタン クリックしてでその細管用の分離ムービーを再生します。
  4. 実行ファイルは、実行の完了時に自動的に保存することができます。

6. 分析データ (図 S1)

  1. 実行ファイルを開くし、解析画面のタブを選択します。図 S1Aで (ピーク) をサンプル グラフに表示するデータは、(すなわち1 のサイクルから 4回キャピラリー) 選択した毛細血管からです。
  2. 編集し、分析 (図 S1B) をクリックします。この段階では、pI の範囲を変更、与えられた実験のため適切な pI 基準を適用、ピーク フィットを追加したりできますピーク名を追加します。
    注: pH 5-8 両性電解質を用いたプレミックス (ここでの場合と同様)、7.3、7.0 6.4 6.0 4.9 の小僧と蛍光標識ペプチドであるを使用する推奨される標準はしごし推奨のはしご、4.0 の小僧と 1 台で pH 3-10 プレミックスを使用している場合、7.3 6.4,、6.0 4.9。2
  3. [ピーク] タブに結果が表示されます。サンプルに表示される値は、位置、pI、ピーク高さとエリア、% 地域、ピーク幅、信号対雑音 (S/N) (図 S1C) です。使用して、データを選択し、詳細な分析データをエクスポートします。
    注意: データは、ピーク (図 S1C) にラベリングした後のみエクスポートできます。

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結果

新しいアッセイのデザイン:図 1 aに、アッセイ プレート レイアウトを示します。最大限に、各条件 (抗体) の 12 の井戸のブロックで 384 ウェル プレートから 96 ウェルを使用できます。12 ウェルの各ブロックは A1 A12 または A13 A24 のいずれかから開始できます。色分けされた行は互いのサンプルや試薬を区別すること。分析テンプレ?...

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ディスカッション

感度と分解能のタンパク質が生体試料のプロテオーム研究のため重要です。細胞内微量に含まれるタンパク質を検出できることに大きな価値があります。代表取締役には、感度の向上と蛋白質とのアイソ フォーム4の検出のための解像度を提供できます。

この技術は、多くプロテオーム研究レポート5,6,

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開示事項

著者には、開示はしません。

謝辞

著者教授レナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学、スウェーデンはこのプロジェクトを開発するための彼女のサポートのおかげでください。さらに、著者は、ロス スミスとレナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学の重要な読書と原稿を改善する提案をありがちましょう。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
NanoPro 1000ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plugProteinSimple040-972Ampholyte premix
DMSO inhibitor mixProteinSimple040-510Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor MixProteinSimple040-482Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3ProteinSimple040-646For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluentProteinSimple040-649
Antibody diluent ProteinSimple040-309
Wash concentrateProteinSimple041-108
Anolyte RefillProteinSimple040-337
Catholyte RefillProteinSimple040-338
Peroxide XDRProteinSimple041-084
LuminolProteinSimple040-652
Bicine/CHAPS Lysis BufferProteinSimple040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for ProteinSimpleCBS700
Assay Plate/Lid KitProteinSimple040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-035-152For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-035-150For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary AntibodyCell Signaling9101For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary AntibodyCell Signaling9102For cIEF used (1: 100)
Compass softwareProteinSimple
HUVECATCCPCS-100-010
MV2 (EBM-2)PromoCell C-22221Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPackPromoCellC-39221Supplementation to MV2 above
VEGFAPeproTech100-20
Long R3 IGFSigma-Aldrich85580C/I1146Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)DiagenodeB01020001
BCA Protein Assay kit Thermo Fischer Scientific23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermo Fischer ScientificNP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)Thermo Fischer ScientificNP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)Thermo Fischer ScientificNP0006
Immobilon PVDF membraneMilliporeIPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

参考文献

  1. O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
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  3. Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
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  5. Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
  6. Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
  7. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
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  10. Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).

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