Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Resumo

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

Resumo

Immunoblotting tornou-se uma técnica de rotina em muitos laboratórios para caracterização de proteínas de amostras biológicas. O protocolo seguinte fornece uma estratégia alternativa, capilar isoeléctrico de focagem (cIEF), com muitas vantagens em relação ao convencional immunoblotting. Este é um método baseado em anticorpos, automatizado, rápido e quantitativo, em que um procedimento completo de mancha ocidental ocorre dentro de um capilar ultrafino. Esta técnica não exigem um gel para transferir a uma membrana, remoção de manchas, ou filmes, que são geralmente necessários para immunoblotting convencional de raios-x. Aqui, as proteínas são separadas de acordo com sua carga (ponto isoelétrico; pI), usando menos do que um microlitro (400 nL) de lisado de proteína total. Após a electroforese, proteínas são imobilizadas nas paredes capilares por tratamento com luz ultravioleta, seguido pelo primário e secundário (peroxidase de rábano (HRP) conjugado) reforçada de incubação do anticorpo, cuja ligação é detectada através de quimioluminescência (ECL), gerando um sinal luminoso que pode ser capturado e gravado por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). A imagem digital pode ser analisada e quantificado (área do pico) utilizando o software. Este procedimento de alta taxa de transferência pode manipular 96 amostras de cada vez; é altamente sensível, com deteção de proteína na faixa de picograma; e produz resultados altamente reprodutível devido à automação. Todos estes aspectos são extremamente valiosos, quando a quantidade de amostras (por exemplo, amostras de tecidos e biópsias) é um fator limitante. A técnica tem aplicações mais amplas, incluindo rastreio de drogas ou anticorpos, descoberta de biomarker e fins de diagnóstico.

Introdução

Focalização isoelétrica capilar (cIEF) é um imunoensaio automatizado, baseado em capilar que resolve as proteínas com base em sua carga^1,2,3. É altamente reprodutível e capaz de resolver proteínas e suas isoformas post-translationally modificadas rapidamente e quantitativamente. Apresenta uma alternativa aos métodos convencionais, como mancha ocidental. Enquanto mancha ocidental é muito bom para confirmar a presença de proteínas abundantes nas amostras prontamente acessíveis; variabilidade, consumo de tempo e quantificação exacta todos os presentes desafios, nomeadamente aquando da análise de amostras de tecidos biológicos. De fato, a variabilidade é um problema inerente na mancha ocidental, pois há várias etapas envolvidas, tais como carregamento e execução de geles de SDS-PAGE, transferência de proteínas na membrana, incubação com vários reagentes (EG., primário e secundário anticorpos, ECL) e desenvolvimento para filme de raio-x⁴. Atualmente, a técnica de mancha ocidental está melhorando com a implementação de gravação digital de sinais quimioluminescente (Western digital). Recentemente, um sistema automatizado de mancha ocidental foi desenvolvido, nomeadamente o capilar ocidental, que é um sistema mais mãos-livres e sem gel. O ensaio inteiro é automático após o carregamento de um prato de amostras (amostras com todos os reagentes necessários) para o sistema de^3,4. O instrumento irá executar todas as etapas, tais como a separação de proteínas, imobilização de proteínas na parede capilar, a incubação do anticorpo, lava entre diferentes etapas e desenvolvimento e quantificação dos sinais de quimioluminescência. Assim, o procedimento de cIEF aqui apresentado fornece maior resolução e sensibilidade.

Este método é sensível, como os sinais podem ser gerados e quantificados de picogramas de proteínas¹. A elevada sensibilidade com excelente reprodutibilidade torna esta tecnologia muito útil para a análise de amostras clínicas. Ele pode detectar bem como distinguir post translacional modificação (por exemplo, proteína fosforilada diferentes isoformas) de proteínas. Esta tecnologia tem sido usada com sucesso para dissecar diferentes sinalização percursos^4,5 em estudos clínicos, com o objetivo de desenvolver novas terapêuticas em câncer³, e tem grande potencial para a descoberta de biomarcadores e drogas de proteína .

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Protocolo

1. cultura, estimulação e Lysis da pilha

Nota: Este método pode ser usado com muitos tipos de células. Para ilustrar o método, é descrito um exemplo usando células endoteliais da veia umbilical humana (HX).

1. Cultura HX na gelatina-revestido, os pratos de Petri de 10 cm em meio basal de células endoteliais com suplementação adequada (consulte Tabela de materiais) e também contendo 5% FCS, fator de crescimento epidérmico (5 ng/mL), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF: 0,5 ng/mL), FGF básico (10 ng/mL), fator de crescimento semelhante à insulina (20 ng/mL), hidrocortisona (0,2 µ g/mL) e ácido ascórbico (1 µ g/mL).
2. Morrer de fome as células durante a noite com meio basal de células endoteliais suplementado com FCS 1% e sem suplemento de fator de crescimento.
3. Aspire todos médio, adicionar 2 mL de meio de cultura de células endoteliais sem fatores de crescimento (média de inanição) em um prato (controle) e, em seguida, adicionar 50 ng/mL VEGF em 2 mL de meio de cultura de fome em um segundo prato por 7 min.
4. Aspire o meio e lavar as células 2 vezes com 10ml de temperatura PBS.
5. Certifique-se os pratos de Petri estão no gelo e mantê-los lá desta etapa em diante.
6. Adicione 250-400 µ l da mistura inibidor de protease aquosa contendo gelo frio lise tampão (Bicine/CHAPS; ver Tabela de materiais) e mistura de inibidor de DMSO (inibidores da fosfatase; ver Tabela de materiais) para cada placa de 10 cm. Agite a placa para assegurar uma cobertura adequada e mantê-lo por 10 min no gelo.
   Nota: A concentração final de protease e o mix de inibidor de DMSO deve ser 1 x.
7. Raspe as células do prato com um raspador de célula e transferir para um tubo de microcentrífuga pre refrigerada. Pipetar acima e para baixo 5 vezes para lyse pilhas.
8. Brevemente, proceda à sonicação as células a 4 ° C. Definir o sonicador da seguinte forma: número de ciclos = 5, poder = baixa, = 5 seg, OFF = 30 s. Esta etapa é incluída para quebrar os ácidos nucleicos e não para lyse pilhas.
   Nota: Sonication deve ser suave para evitar a desnaturação das proteínas.
9. Vórtice do tubo para 5 s (não continuamente), 2 s em um tempo (3 vezes) e manter no gelo.
10. Clarificar o lisado por centrifugação a 14.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e, em seguida, imediatamente transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga pre-refrigerada limpo.
11. Medir a concentração de proteína, usando um ácido Bicinchoninic (BCA) proteína ensaio kit⁴.
12. Faça 10 µ l alíquotas, snap freeze em gelo seco ou nitrogênio líquido e armazenam a-80 ° C até o uso.

2. preparação da mistura amostra (cálculo para 150 µ l amostra Mix)

1. Em primeiro lugar, preparar uma mistura de diluente de amostra adicionando 1 µ l do mix de inibidor de DMSO (estoque x 50) e 2 µ l de inibidores de protease (estoque x 25) para 47 µ l de diluente de amostra (ver Tabela de materiais), para que a concentração final de inibidores de protease e inibidores de DMSO torna-se 1 x. Em seguida, dilua o lisado de proteína usando o mix de diluente de amostra para obter a concentração desejada (ver passo 2.3).
2. Preparar a mistura de inibidor de inibidor de protease/ampholyte/escada/DMSO adicionando 3.325 µ l padrão da escada (consulte a Tabela de materiais; estoque x 60), 6 µ l de inibidor de protease (x 25), 3 µ l de inibidor de DMSO (50x) a pré-mistura de ampholyte 137.675 µ l (ver tabela de de Materiais). Vórtice o tubo de pelo menos 15 s total, 5 s de cada vez (3 - 4 vezes) e manter no gelo.
3. Misturar as soluções de passos 2.1 e 2.2 na proporção de 1:3, para que as concentrações finais de DMSO, inibidores da protease e a escada padrão pI se tornar 1 X, e as proteínas no capilar atingir a concentração final desejada (por exemplo, 50 µ g/mL foi usado para A Figura 2).
   Nota: A concentração de proteína no capilar e bem são os mesmos.
4. Carregar 10 µ l de amostra mistura dentro do poço apropriado, de acordo com o layout de modelo de ensaio de placa 384 (consulte a etapa 3 e Figura 1) e manter a placa no gelo.
5. Diluir o primário (pERK1/2, 01:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) e anticorpos secundários (1: 300) com diluente de anticorpo (ver Tabela de materiais) e pipetar 10 µ l de primária e 15 µ l de anticorpos secundários para cada poço.
   Nota: em geral, maior concentração de anticorpos são necessários para os ensaios de cIEF em comparação com borrões ocidentais convencionais.
6. Misturar o Luminol e peróxido de XDR (proporção 1:1; Veja Tabela de materiais) juntos e pipetar 15 µ l em cada poço.
   Nota: Misturar esses frescos de soluções cada vez antes de usar e manter no gelo.
7. Uma vez que todos os reagentes e amostras são pipetados na placa, centrifugar a placa a 2.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C, spin para baixo o líquido e remover as bolhas. Se as bolhas continuam a existir, removê-los manualmente usando a ponta da pipeta fina.
   Nota: Não carregue mais de 20 µ l de amostra ou reagentes por alvéolo; caso contrário, a pipeta do instrumento não pode ser lavada corretamente. Certifique-se de seguir o manual de instruções do fabricante para preparar todos os reagentes.

3. criando um novo modelo de ensaio com Software do sistema (Figura 1)

1. Abra o software do sistema e clique em "novo" do menu arquivo.
2. Vá para o painel de layout e atribuir locais para os reagentes e amostras em uma placa-384. Usam até um máximo de 96 poços por placa de 384.
3. Fazer uma atribuição de reagente, clicando em qualquer lugar um poço no bloco. Selecione um bloco de linha de 12 poços cada. Poços, por exemplo, de 1-12 ou 13-24, são atribuídos como um bloco por padrão.
4. Vá para a barra de ferramentas do painel de layout e inserir um bloco linha vazia ou uma amostra, primária, secundária ou bloco de linha de luminol. Cada bloco é atribuído uma cor diferente, então eles são fáceis de diferenciar.
   Nota: Quando você clicar em um poço, uma borda preta pode ser vista em torno do bloco onde o novo bloco será inserido no painel. Um bloco de linha também pode ser excluído.
5. Vá para o painel de protocolo e selecione um local de reagente no prato. Em seguida, clique em uma célula na coluna de amostra e selecione o reagente no menu suspenso.
6. Dessa mesma forma, selecione os locais de reagente para o primário, secundário e o luminol para cada ciclo.
7. Clique em células, um de cada vez, na coluna de anticorpo primário ou secundário e alterar os tempos de incubação, se necessário.
   Nota: As notas de entrada para cada ciclo também podem ser adicionadas.
8. Adicione ciclos clicando no botão 'Adicionar' na seção de protocolo. 1 ciclo, 4 ciclos ou todos os ciclos (um máximo de 8 ciclos pode ser adicionado ao protocolo).
   Nota: É possível copiar e colar informações de ciclo nesta etapa: selecione um ciclo, vá para editar e copiar e colar.
9. Insira as informações referentes à amostra, tais como a identidade dos anticorpos primários e secundários, seus números de catálogo e diluições, etc, no painel de modelo. Este é um passo opcional que é útil durante a análise após a execução.
10. Salve o novo arquivo de ensaio. Antes de clicar no botão 'Iniciar', verificar rapidamente o layout para certificar-se de que tudo está correto.

4. protocolo para cIEF configuração do instrumento

1. Conjunto de eletroforese de focalização isoelétrica capilar condições de separação. Estes devem ser 15.000 µW e 40 min, e o tempo de imobilização de UV deve ser 80 s. No entanto, o tempo de imobilização de UV pode ser definido dentro do intervalo de 80-140 s e pode precisar de ser otimizado para a proteína de interesse.
   Nota: Um ponto de tempo para a imobilização de UV pode ser definido para cada ciclo, mas não para cada capilar.
2. Conjunto de lavagem lavagens 1 a 2, para 150 s cada lavagem (padrão) e a incubação do anticorpo primário por 120 min.
3. Conjunto de lavagem lavagens de 2 a 2, para 150 s cada lavagem (padrão) e a incubação do anticorpo secundário por 60 min.
4. Conjunto de lavagem 3, que deve ser 2 lavagens, para 150 s cada lavagem (padrão).
5. Definir os tempos de exposição quando quimioluminescência será detectada; Estes devem ser 30, 60, 120, 240, 490 e 960 s. Todos os passos (1-8), realizarão em um único capilar.

5. executar o arquivo de ensaio

1. Depois que tudo estiver pronto, clique em Iniciar para começar a correr. O software irá pedir-lhe para remover os resíduos, para reabastecer a água e a caixa capilar, para adicionar anolito e catholyte para a bandeja do recurso, para adicionar o tampão de lavagem e, finalmente, para carregar a placa para a bandeja de refrigeração da amostra.
   Nota: Remova a tampa da caixa capilar, mas não remova a tampa da placa de ensaio. A tampa da placa pode ser removida automaticamente pelo instrumento quando necessário. Isto ajuda a prevenir a evaporação de reagente.
2. Alguns minutos após a execução tem sido iniciada, uma barra de status do instrumento será exibida na tela do computador. Mensagens de status e barras de progresso podem ser vistas correspondente ao estágio atual do instrumento.
   Nota: Inicialmente, o instrumento irá verificar se está tudo correto antes prosseguindo para pipetar o anolito e catholyte para a bandeja de separação, escolhendo o primeiro bloco de 12 capilares, retirar a tampa da placa e colocar as amostras da amostra placa para os capilares e então finalmente na câmara de separação por eletroforese.
3. Clique sobre a tela de Resumo de execução para ver dois painéis: status e separação. Os usuários podem exibir o andamento da execução, e filmes da separação (os 12 capilares de cada ciclo) podem ser armazenados quando o passo de electroforese de cada ciclo é concluído. Para observar a separação eletroforese em um capilar, reproduzir o filme de separação para o capilar clicando o ciclo desejado e, em seguida, o botão de play no painel de controle.
4. O arquivo de execução pode ser armazenado automaticamente após a conclusão da execução.

6. analisar os dados (Figura S1)

1. Abra o arquivo executado e selecione a guia de tela de análise. Na Figura S1A, os dados mostrados (picos) no gráfico de exemplo são do capilar selecionado (ou seja, 4^th capilar do ciclo 1).
2. Clique em Editar e, em seguida, análise (Figura S1B). Nesta fase, os usuários podem alterar o intervalo de pI, aplicar o padrão de pI apropriado para um determinado experimento, adicionar um ajuste de pico e adicionar um nome de pico.
   Nota: Quando usar um pH 5-8 ampholyte premix (como é o caso aqui), a escada padrão recomendada para usar é um com peptídeos fluorescente etiquetados com pIs de 4.9 6.0, 6.4, 7.0 e 7.3, e ao usar um pH premix de 3-10, a escada recomendada é um com pIs de 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 e 7.3. ²
3. Os resultados são exibidos na guia de picos; os valores exibidos para as amostras são posição, pI, pico altura e área, % área, largura de pico e sinal de ruído (S/N) (Figura S1C). Escolha quais dados usar e exportar os dados para posterior análise.
   Nota: Os dados só podem ser exportados depois etiquetar o pico (Figura S1C).

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Resultados

Design de um novo ensaio: Um layout de placa de ensaio é mostrado na figura 1A. Màxima, 96 poços podem ser usados na placa de 384 em blocos de 12 poços para cada condição (anticorpo). Cada bloco de 12 poços pode começar na A1-A12 ou A13-A24. Linhas de código de cores permitem distinguir amostras ou reagentes de um para o outro. No modelo de ensaio (figura 1B), as informações pertinentes para que pode s...

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Discussão

Sensibilidade e resolução de proteínas são cruciais para a investigação de proteomic em amostras biológicas. Há grande valor em ser capaz de detectar as proteínas que estão presentes em quantidades nas células. cIEF pode oferecer melhorou a sensibilidade e resolução para a detecção de proteínas e suas isoformas⁴.

Esta tecnologia tem sido usada com sucesso em muitos proteomic pesquisa relatórios^5,6

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	For cIEF used (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementation to MV2 above
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
Ice