Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Резюме

Капиллярного изоэлектрической фокусировки является метод на основе антител, сверхчувствительная, высокая пропускная способность, позволяя подробную характеристику белков и их изоформы биологических пробах крайне мала. Ниже описывается протокол для обнаружения и количественного определения специфических белков и их изоформы автоматизированные и роботизированные образом.

Аннотация

Immunoblotting стала обычной техники во многих лабораториях для характеризации белка из биологических образцов. Следующий протокол предоставляет альтернативную стратегию, капиллярные изоэлектрической фокусировки (главный), с много преимуществ по сравнению с обычными immunoblotting. Это на основе антител, автоматизированных, быстрое и количественный метод, в котором полный западных blotting процедуры происходит внутри ультратонких капилляров. Этот метод не требует гель для передачи мембраны, зачистки помарки, или рентгеновские пленки, которые обычно требуются для обычных immunoblotting. Здесь, протеины разделены согласно их заряда (Изоэлектрическая точка; Пи), используя меньше, чем микролитр (400 nL) общего белка lysate. После электрофореза, белки являются иммобилизованных на стенки капилляров, ультрафиолетовый свет лечения, следуют первичный и вторичный (пероксидазы (ПХ) конъюгированных) Антитело инкубации, привязку которого обнаруживается через расширение Хемилюминесценция (ЭСЛ), создавая световой сигнал, который может быть захвачен и Записанная камерой зарядовой (связью ПЗС). Цифровые изображения могут быть проанализированы и количественно (площадь пика) с помощью программного обеспечения. Эта процедура высокая пропускная способность может обрабатывать 96 образцов одновременно; очень чувствительна, с обнаружением белка в диапазоне пикограмм; и производит высоко воспроизводимые результаты благодаря автоматизации. Все эти аспекты являются чрезвычайно ценными, когда количество образцов (например, образцы тканей и биопсии) является ограничивающим фактором. Методика имеет более широкое применение, включая скрининг наркотиков или антител, открытия биомаркеров и диагностических целей.

Введение

Капиллярные изоэлектрической упором (главный) является автоматизированной, основанный на капиллярной иммуноанализ, устраняющее белков на основе их заряда^1,2,3. Это очень воспроизводимость и способный разрешать белков и их post-translationally модифицированных изоформ быстро и количественно. Она представляет альтернативу обычные методы, такие как Западный blotting. В то время как Западный blotting очень хорошо для подтверждающих наличие обильные белков в легкодоступном образцов; изменчивость, время потребления и точный количественный всех присутствующих задач, в частности при рассмотрении образцы биологических тканей. Действительно, изменчивость присущие проблема в Западный blotting, как есть многочисленные шаги, связанные, например, загрузки и запуска гелях SDS-PAGE, перенос белков на мембраны, инкубации с различными реагентами (например., начальное и среднее антитела, ЭСЛ) и развитие на рентгеновской пленки⁴. В настоящее время западные blotting метод улучшается с осуществлением цифровой записи хемилюминесцентный сигналов (цифровой вестерны). Недавно автоматизированная система западных blotting был разработан, а именно капилляра Западной, которая является более свободные руки и гель свободной системы. Весь assay автоматически после загрузки образца пластины (образцы с всеми необходимыми реагентами) в системе^3,4. Инструмент будет выполнять все шаги, такие, как разделение белков, иммобилизации белков на капиллярной стенки, инкубаций антитела, моет между различные шаги и развитием и количественная оценка хемилюминесцентный сигналов. Таким образом главный представленные здесь приведен выше разрешение и чувствительность.

Этот метод является чувствительной, как сигналы могут быть созданы и количественно от пикограмм¹белки. Высокая чувствительность с отличную воспроизводимость делает эту технологию очень полезным для анализа клинических образцов. Он может обнаружить, а также отличить пост поступательные изменения (например, различные фосфорилированных белка изоформ) белков. Эта технология успешно используется для рассечения различных сигнальных путей^4,5 , в клинических исследованиях, направленных на разработку новой терапии рака³, и он имеет большой потенциал для обнаружения белковых биомаркеров и наркотиков .

протокол

1. клетки культуры, стимуляции и Lysis

Примечание: Этот метод может использоваться с многие типы клеток. Чтобы проиллюстрировать метод, описан пример использования человеческого пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs).

1. Культура HUVECs на желатин покрытием, 10 см Петри в эндотелиальных клеток базального среде с соответствующих добавок (см. Таблицу материалы), а также содержащая 5% FCS, эпидермального фактора роста (5 нг/мл), Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF: 0,5 нг/мл), основные ФБП (10 нг/мл), инсулин подобный фактор роста (20 нг/мл), гидрокортизон (0,2 мкг/мл) и аскорбиновой кислоты (1 мкг/мл).
2. Голодать клетки на ночь с эндотелиальных клеток базального среднего дополнена 1% FCS и не дополнение фактор роста.
3. Аспирационная всех средних, добавить 2 мл питательной среды эндотелиальных клеток без роста факторов (голода средний) в одном блюде (управления), затем добавить 50 нг/мл VEGF в 2 мл питательной среды голода в второе блюдо за 7 мин.
4. Аспирационная среднего и вымыть клетки 2 раза с 10 мл комнатной температуре PBS.
5. Обеспечить Петри на льду и держать их там с этого года.
6. Мкл 250-400 лед холодной лизис буфера (Bicine/CHAPS; см. Таблицу материалы) содержащий водный протеазы ингибитор смеси и смеси ДМСО ингибитора (битор фосфатазы; см. Таблицу материалы) для каждой пластины 10 см. Вихрем пластину для обеспечения надлежащего охвата и держать его на 10 мин на льду.
   Примечание: Конечная концентрация протеазы и АБС битор смеси ДМСО должна быть 1 x.
7. Скрип клетки от блюдо с скребок клетки и передачи к трубке предварительно охлажденные отцентрифугировать. Пипетка вверх и вниз 5 раз, чтобы лизировать клетки.
8. Кратко sonicate клетки на 4 ° C. Установите sonicator следующим образом: количество циклов = 5, мощность = низкий, = 5 сек, OFF = 30 s. Этот шаг входит перерыв нуклеиновые кислоты и не Лизируйте клетки.
   Примечание: Sonication должна быть мягкой, чтобы избежать денатурации белков.
9. Вихревой трубе для 5 s (не постоянно), 2 s на время (3 раза) и держать на льду.
10. Уточнить lysate центрифугированием в 14.000 x g 15 мин при температуре 4 ° C, а затем немедленно перевести супернатант в трубу чистой предварительно охлажденные отцентрифугировать.
11. Измерьте концентрацию протеина, с помощью Bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного комплект⁴.
12. Сделать 10 мкл аликвоты, оснастки заморозить в сухой лед или жидкий азот и хранить при температуре-80 ° C до использования.

2. Подготовка смеси (расчет за 150 мкл пример Mix)

1. Во-первых, подготовить образец разбавителя смесь, добавив 1 мкл смеси ДМСО ингибитора (stock 50 x) и 2 мкл ингибиторов протеазы (сток 25 x) до 47 мкл пример разбавителя (см. Таблицу материалы), так что конечная концентрация ДМСО ингибиторы и ингибиторы протеазы становится 1 x. Затем разбавьте лизатов белка, используя образец смеси разбавителя для получения желаемой концентрации (см. шаг 2.3).
2. Подготовьте смесь ингибитор ингибиторы протеазы/лестницы/ampholyte/ДМСО, добавив 3.325 мкл Стандартная лестница (см. Таблицу материалов; фондовый 60 x), 6 мкл ингибитора протеазы (25 x), 3 мкл ингибитора ДМСО (50 x) чтобы 137.675 мкл ampholyte премиксов (см. таблицы Материалы). Вихревой трубы по крайней мере 15 s всего, 5 s в то время (3 - 4 раза) и держать на льду.
3. Смешать решения от шагов, 2.1 и 2.2 в соотношении 1:3, так что окончательный концентрации ДМСО, Ингибиторы протеаз и Стандартная лестница Пи стать 1 X, и белков в капилляр достичь окончательного желаемой концентрации (например, 50 мкг/мл был использован для Рисунок 2).
   Примечание: Концентрация белка в капиллярной и хорошо совпадают.
4. Загрузить 10 мкл пример смеси в соответствующие колодец, согласно 384-ну пластины пробирного шаблон макета (см. шаг 3 и Диаграмма 1) и держать пластину на льду.
5. Разбавить начальной (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) и вторичные антитела (1: 300) с антителом разбавителя (см. Таблицу материалы) и Пипетка 10 мкл первичных и 15 мкл вторичных антител в каждой скважине.
   Примечание: В целом, более высокая концентрация антител необходимы для главный анализов по сравнению с обычными западной помарки.
6. Смешать Luminol и перекись XDR (соотношение 1:1; см. Таблицу материалы) вместе и Пипетка 15 мкл в каждой скважине.
   Примечание: Смешать эти решения свежий каждый раз перед использованием и держите на льду.
7. После того, как образцы и все реагенты являются накапаны в пластину, центрифуга пластину на 2500 x g 10 мин при 4 ° C для спина вниз жидкости и удалить пузыри. Если пузыри все еще существует, удалите их вручную с помощью кончик тонкой пипеткой.
   Примечание: Не загружайте более чем 20 мкл пример или реагентов в скважины; в противном случае инструмент Пипетка нельзя стирать должным образом. Убедитесь в том следовать инструкции от производителя подготовить все реагенты.

3. проектирование нового шаблона Assay с системного программного обеспечения (рис. 1)

1. Откройте системного программного обеспечения и нажмите кнопку «Новый» из меню файл.
2. Перейдите к панели макета и назначение места для реагенты и образцы в 384 хорошо плиты. Использовать до максимум 96 скважин на 384-ну пластину.
3. Сделайте назначения реагента, щелкнув хорошо везде в блоке. Выберите строку блока 12 скважин. Уэллс, например, от 1-12 или 13-24, назначаются в качестве блока по умолчанию.
4. Перейдите к панели инструментов Макет панели и вставьте либо пустую строку или образца, начальных, средних либо luminol строки блок. Каждый блок присваивается другой цвет, поэтому они легко отличить.
   Примечание: При нажатии колодец, черную границу можно увидеть вокруг блока, где новый блок будет вставлен в панели. Можно также удалить строку блока.
5. Перейдите к панели протокол и выберите местоположение реагента в пластине. Затем щелкните ячейку в столбце образца и выберите реагента в раскрывающемся меню.
6. Таким же образом выберите расположение реагент для начального, среднего и luminol для каждого цикла.
7. Щелкните ячейки, один момент, в столбце первичного или вторичного антитела и при необходимости измените время инкубации.
   Примечание: Запись примечания для каждого цикла также могут быть добавлены.
8. Добавление циклов, нажав кнопку «Добавить» в разделе протокол. 1 цикл, 4 циклов или все циклы (максимум 8 циклов могут быть добавлены к протоколу).
   Примечание: Это можно скопировать и Вставить цикл информации в этот шаг: выберите цикл, перейдите к редактировать, копировать и вставлять.
9. Введите информацию, относящуюся к образцу, таких как личность первичных и вторичных антител, их номера каталога и разведения, и т.д., на панели шаблон. Это необязательный шаг, который полезен во время после выполнения анализа.
10. Сохраните новый файл assay. Перед нажатием кнопки «Пуск», быстро проверьте макет, чтобы убедиться, что все правильно.

4. протокол для главный инструмент настройки

1. Установите капиллярного электрофореза изоэлектрической фокусировки условий разделения. Они должны быть 15000 мкВт и 40 мин, и УФ иммобилизации время должно быть 80 s. Однако время иммобилизации УФ может устанавливаться в пределах 80-140 s и может потребоваться быть оптимизированы для протеина интереса.
   Примечание: Время точкой для УФ иммобилизации можно задать для каждого цикла, но не для каждого капилляра.
2. Набор мыть моет 1 до 2, 150 s каждый мыть (по умолчанию) и основное антитело инкубации для 120 мин.
3. Набор мыть моет 2 до 2, 150 s каждый мыть (по умолчанию) и вторичное антитело инкубации 60 мин.
4. Установка мытье 3, которая должна быть 2 моет, 150 s каждый мыть (по умолчанию).
5. Задать время экспозиции, когда будет обнаружено хемилюминесценции; они должны быть, 30, 60, 120, 240, 490 и 960 s. Все шаги (1-8) будет осуществляться в один капилляр.

5. Запуск файла Assay

1. Как только все будет готово, нажмите кнопку Пуск для начала выполнения. Программа предложит вам удалить отходы, для пополнения воды и поле капилляров, чтобы добавить католит и анолит ресурсов лоток, чтобы добавить мыть буфера и наконец загрузить пластину в лоток охлаждения образца.
   Примечание: Снять крышку от капиллярной коробки, но не открывайте крышку от пробирного пластины. Крышки от пластины могут быть удалены автоматически инструмент при необходимости. Это помогает предотвратить реагент испарения.
2. Был запущен через несколько минут после запуска, строка состояния документа будет отображаться на экране компьютера. Индикаторы выполнения и сообщения о состоянии можно увидеть соответствующий инструмент текущего этапа.
   Примечание: Первоначально, инструмент будет проверить все ли правильно, прежде чем приступить к Пипетка католит и анолит в лоток разделения, выбирать первый блок 12 капилляров, снять крышку плиты и размещение образцов из образца плита в капиллярах, а затем наконец в разделение камеру для электрофореза.
3. Нажмите кнопку на экране запуска резюме чтобы увидеть две области: состояние и разделения. Пользователи могут просматривать ход выполнения, а фильмы разделения (12 капилляров каждого цикла) могут быть сохранены после завершения шага электрофорез каждого цикла. Наблюдать за Разъединение электрофореза в капилляр, играть разделения фильм для этого капилляров, нажав желаемого цикла, а затем кнопку воспроизведения на панели управления.
4. Выполняемый файл может храниться автоматически по завершении выполнения.

6. анализ данных (Рисунок S1)

1. Откройте файл запуска и выберите вкладку анализ экрана. В Рисунке S1Aотображаются (пики) в графе образца данные из выбранного капиллярные (т.е., 4-^й капиллярной из цикла 1).
2. Нажмите кнопку изменить, а затем анализ (Рисунок S1B). На этом этапе пользователи могут изменить диапазон Пи, применять соответствующие Пи стандарт для данного эксперимента, добавить пик fit и добавить имя пик.
   Примечание: При использовании рН 5-8 ampholyte премикс (как в данном случае), рекомендуемая Стандартная лестница использовать является одним с дневно обозначенные пептиды с НЦБ 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 и 7.3, и при использовании рН 3-10 премикс, рекомендованные лестница является одним с НЦБ 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 и 7.3. ²
3. Результаты отображаются на вкладке вершины; значения, отображаемые для образцов являются позиции, Пи, пик высотой и области, % площади, пик ширина и сигнал-шум (S/N) (Рисунок S1C). Выбрать, какие данные использовать и экспортировать данные для дальнейшего анализа.
   Примечание: Данные могут быть экспортированы только после маркировки пик (Рисунок S1C).

Результаты

Дизайн новой пробирного: Пробирного пластины схема приведена на рисунке 1A. Максимально 96 скважин может использоваться от 384-ну пластины в блоках 12 скважин для каждого условия (антител). Каждый блок 12 скважин можно запустить либо из A1-A12 и A13-A24. Цв...

Обсуждение

Чувствительность и разрешение белки имеют решающее значение для протеомических исследований биологических образцов. Существует большое значение в состоянии обнаружить белки, которые присутствуют в минуту количествах в клетках. Главный может предложить улучшена чувствительность и ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	For cIEF used (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementation to MV2 above
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
Ice