Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode

Résumé

La focalisation isoélectrique capillaire est une technique de base d’anticorps, ultrasensible, haut débit, ce qui permet une caractérisation détaillée de protéines et leurs isoformes de très petits échantillons biologiques. Ce qui suit décrit un protocole pour la détection et la quantification des protéines spécifiques et leurs isoformes de manière automatisée et robotisée.

Résumé

Immunoblotting est devenue une technique courante dans de nombreux laboratoires pour la caractérisation de protéines provenant d’échantillons biologiques. Le protocole suivant fournit une autre stratégie, capillaire isoélectrique en se concentrant (cIEF), avec de nombreux avantages comparé à conventionnel immunoblotting. Il s’agit d’une méthode axée sur les anticorps, automatisée, rapide et quantitative, dans lequel une procédure complète de transfert occidentale se déroule à l’intérieur d’un tube capillaire ultramince. Cette technique ne nécessite un gel de transférer à une membrane, décapage des taches, ni aux rayons x des films qui sont habituellement requis pour immunoblotting classique. Ici, les protéines sont séparées selon leur charge (point isoélectrique ; pI), à l’aide de moins d’un microlitre (400 nL) de lysat de protéine total. Après électrophorèse, les protéines sont immobilisés sur la paroi des capillaires de traitement par la lumière ultraviolette, suivie de primaire et secondaire (peroxydase de raifort (HRP) conjuguée) amélioré d’incubation d’anticorps, dont liaison détectée par le biais chimiluminescence (ECL), générant un signal lumineux qui peut être capturé et enregistré par une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD). L’image numérique peut être analysé et quantifié (aire du PIC) à l’aide de logiciels. Cette procédure de haut débit peut gérer 96 échantillons à la fois. est très sensible, avec détection de protéines dans la gamme picogramme ; et produit des résultats hautement reproductible en raison de l’automatisation. Tous ces aspects sont extrêmement précieuses lorsque la quantité d’échantillons (par exemple, des échantillons de tissus et biopsies) est un facteur limitant. La technique a des applications plus larges, y compris le dépistage des drogues ou des anticorps, découverte de biomarqueurs et des fins de diagnostic.

Introduction

Isoélectrofocalisation capillaire (cIEF) est un test immunologique automatisé, axée sur les capillaires qui résout des protéines sur la base de leurs frais^1,2,3. Il est hautement reproductible et capable de résoudre les protéines et leurs isoformes modifiées post-traductionnellement rapidement et quantitativement. Il présente une alternative aux méthodes classiques comme le western blot. Alors que le western blot est très bon pour confirmer la présence de protéines abondantes dans les échantillons facilement accessibles ; variabilité, consommation de temps et dosage précis tous présents défis, en particulier lors de l’examen des échantillons de tissus biologiques. En effet, la variabilité est un problème inhérent à éponger occidental, qu’il y a nombreuses étapes, telles que le chargement et fonctionnement des gels SDS-PAGE, transfert des protéines sur membrane, incubation avec différents réactifs (e.g., primaire et secondaire anticorps, ECL) et le développement sur x-ray film⁴. Actuellement, la technique western blot s’améliore avec la mise en œuvre de l’enregistrement numérique des signaux par chimiluminescence (Western digital). Récemment, un système automatisé de transfert western a été développé, à savoir le capillaire Ouest, qui est un système plus les mains libres et sans gel. Le test complet est automatique après le chargement d’une plaque d’échantillon (échantillons avec tous les réactifs nécessaires) dans le système^3,4. L’instrument se produira toutes les étapes telles que la séparation de protéines, immobilisation des protéines sur la paroi capillaire, des incubations anticorps, lave entre les différentes étapes, de développement et quantification des signaux par chimiluminescence. Ainsi, la procédure de cIEF présentée ici fournit plus haut résolution et sensibilité.

Cette méthode est sensible, comme les signaux peuvent être générés et quantifiés de picogrammes de protéines¹. La haute sensibilité avec excellente reproductibilité rend cette technologie très utile pour l’analyse des échantillons cliniques. Il peut détecter ainsi distinguer post traductionnelle modification (par exemple, les isoformes de protéines phosphorylées différents) des protéines. Cette technologie a été utilisée avec succès pour disséquer les différents signalisation voies^4,5 études cliniques visant à développer de nouvelles thérapeutiques dans le cancer³, et il a un grand potentiel pour la protéine biomarqueur et découverte de médicaments .

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Protocole

1. Culture, la Stimulation et la lyse des cellules

Remarque : Cette méthode peut être utilisée avec plusieurs types de cellules. Pour illustrer la méthode, un exemple d’utilisation des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) est décrite.

1. Culture des HUVECs sur gélatine-enduit, des plats de Pétri 10 cm dans le milieu basal des cellules endothéliales avec supplémentation appropriée (voir Table des matières) et contenant également 5 % FCS, facteur de croissance épidermique (5 ng/mL), facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF : 0,5 ng/mL), base FGF (10 ng/mL), facteur de croissance analogue à l’insuline (20 ng/mL), hydrocortisone (0,2 µg/mL) et l’acide ascorbique (1 µg/mL).
2. Affamer les cellules pendant la nuit avec le milieu de base de cellules endothéliales additionné de 1 % de FCS et aucun supplément de facteur de croissance.
3. Aspirer toutes les moyennes, ajouter 2 mL de milieu de culture de cellules endothéliales sans facteurs de croissance (moyenne de famine) dans un plat (contrôle), puis ajouter 50 ng/mL VEGF dans 2 mL de milieu de culture de famine dans un deuxième plat 7 mn.
4. Aspirer le milieu et laver les cellules 2 fois avec la température de la pièce 10 mL PBS.
5. S’assurer que les boîtes de Pétri sont sur la glace et les y garder de cette étape à partir.
6. Ajouter 250-400 µL du mélange de l’inhibiteur de la protéase aqueuse contenant tampon (Bicine/CHAPS ; voir Table des matières) froid lyse des glace et mélange inhibiteur de DMSO (inhibiteurs de la Phosphatase ; voir Table des matières) pour chaque plaque de 10 cm. Agiter la plaque afin d’assurer une couverture adéquate et gardez-le pendant 10 min sur la glace.
   Remarque : La concentration finale de protéase et le mélange inhibiteur de DMSO devrait être 1 x.
7. Grattez les cellules du plat avec un grattoir de cellules et le transfert d’un tube à centrifuger préalablement réfrigérées. Pipeter vers le haut et vers le bas 5 fois à lyser les cellules.
8. Soniquer brièvement les cellules à 4 ° C. Définissez le sonicateur comme suit : nombre de cycles = 5, puissance = bas, = 5sec, OFF = 30 s. Cette étape est incluse pour briser les acides nucléiques et non à lyser les cellules.
   Remarque : La Sonication doit être douce pour éviter la dénaturation des protéines.
9. Vortex le tube pendant 5 s (pas en continu), 2 s à la fois (3 fois) et les garder sur la glace.
10. Clarifier le lysat par centrifugation à 14 000 x g pendant 15 min à 4 ° C, puis immédiatement transférer le surnageant dans un tube à centrifuger préalablement réfrigérées propre.
11. Mesurer la concentration de protéine avec un acide Bicinchoninic (BCA) protéine test kit⁴.
12. Faire 10 µL d’extraits, clin d’oeil geler dans la neige carbonique ou l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

2. mélange préparation (calcul pour 150 µL échantillon Mix)

1. Tout d’abord, préparer un mélange diluant de l’échantillon en ajoutant 1 µL du mélange inhibiteur de DMSO (stock # x 50) et 2 µL d’inhibiteurs de la protéase (stock # x 25) à 47 µL de diluant pour échantillons (voir Table des matières), afin que la concentration finale des inhibiteurs de DMSO et inhibiteurs de la protéase devient 1 x. Ensuite, diluer les lysats de protéines en utilisant le mélange diluant de l’échantillon pour obtenir la concentration désirée (voir étape 2.3).
2. Préparer, inhibiteur de protéase/échelle/ampholyte/DMSO inhibiteur mélange en ajoutant standard 3,325 µL d’échelle (voir Table des matières; 60 x en stock), 6 µL d’inhibiteur de la protéase (x 25), 3 µL d’inhibiteur de DMSO (x 50) à prémélange d’ampholyte 137.675 µL (voir Table de Matériaux). Vortex le tube au moins 15 s total, 5 s à la fois (3 - 4 fois) et de garder sur la glace.
3. Mélanger les solutions de mesures 2.1 et 2.2 dans un rapport de 1:3, de sorte que les concentrations finales de DMSO, inhibiteurs de la protéase et l’échelle standard de pI devient 1 X, et les protéines dans le capillaire atteignent la concentration finale souhaitée (par exemple, 50 µg/mL a été utilisé pour La figure 2).
   Remarque : La concentration de protéines dans le capillaire et le bien sont les mêmes.
4. Charger 10 µL du mélange de l’échantillon dans le puits correspondant, selon le schéma modèle 384 puits assay (voir étape 3 et Figure 1) et de garder la plaque sur la glace.
5. Diluer le primaire (pERK1/2, 01:50 ; ERK1/2, 1/100 ; HSP 70, 1/500) et des anticorps secondaires (1 : 300) avec le diluant anticorps (voir Table des matières) et déposer 10µl de primaire et 15 µL d’anticorps secondaires dans chaque puits.
   Remarque : en général, une concentration plus élevée d’anticorps sont requis pour cIEF dosages par rapport aux transferts western classiques.
6. Mélanger le Luminol et peroxyde XDR (ratio 1:1 ; voir Table des matières) ensemble et distribuer 15 µL à chaque puits.
   NOTE : Mélanger ces frais des solutions chaque fois avant utilisation et garder sur la glace.
7. Une fois les échantillons et tous les réactifs sont distribués dans la plaque, centrifuger la plaque à 2 500 g pendant 10 min à 4 ° C pour faire tourner le liquide vers le bas et enlever les bulles. Si les bulles subsistent, supprimez-les manuellement à l’aide d’un embout de la pipette mince.
   Remarque : Ne chargez pas plus de 20 µL d’échantillons et de réactifs / puits ; dans le cas contraire, la pipette de l’instrument ne peut être lavée correctement. Assurez vous de suivre le manuel d’instructions du fabricant pour préparer tous les réactifs.

3. concevoir un nouveau modèle d’analyse avec un logiciel système (Figure 1)

1. Ouvrez le logiciel système et cliquez sur « nouveau » dans le menu fichier.
2. Allez dans le volet mise en page et assigner les emplacements des réactifs et des échantillons dans une plaque 384 puits. Utiliser jusqu'à un maximum de 96 puits par plaque 384 puits.
3. Faire une cession de réactif en cliquant un puits n’importe où dans le bloc. Sélectionner un bloc de la rangée de 12 puits de chaque. Puits, par exemple, de 1 à 12 ou 13-24, sont affectés en bloc par défaut.
4. Allez dans la barre d’outils volet mise en page et insérer un bloc de ligne vide ou un échantillon, primaire, secondaire ou bloc de rangée de luminol. Chaque bloc est assignée une couleur différente, afin qu’ils soient faciles à distinguer.
   Remarque : Lorsque vous cliquez sur un puits, une bordure noire peut être vu autour du bloc où le nouveau bloc sera inséré dans le volet. Un bloc de ligne peut également être supprimé.
5. Aller vers le volet du protocole et sélectionnez un emplacement de réactif dans la plaque. Ensuite, cliquez sur une cellule dans la colonne de l’échantillon et sélectionnez le réactif dans le menu déroulant.
6. Dans ce même mode, sélectionnez les emplacements de réactif pour le primaire, secondaire et luminol pour chaque cycle.
7. Cliquez sur les cellules, un à la fois, dans la colonne de l’anticorps primaire ou secondaire et modifier les temps d’incubation, si nécessaire.
   NOTE : Notes d’entrée pour chaque cycle peuvent également être ajoutés.
8. Ajouter des cycles en cliquant sur le bouton « Ajouter » dans la section protocole. 1 cycle, 4 cycles ou tous les cycles (un maximum de 8 cycles peut être ajouté au protocole).
   Remarque : Il est possible de copier et coller des informations de cycle dans cette étape : sélectionner un programme, allez à modifier et copier et coller.
9. Entrez les informations relatives à l’échantillon, comme l’identité de l’anticorps primaires et secondaires, leurs numéros de catalogue et les dilutions, etc., dans le volet de modèle. Il s’agit d’une étape facultative qui est utile lors de l’analyse post-exécution.
10. Enregistrez le nouveau fichier de test. Avant de cliquer sur le bouton « start », vérifier rapidement la mise en page pour s’assurer que tout est correct.

4. Protocole pour cIEF réglage de l’Instrument

1. Définir l’électrophorèse capillaire focalisation isoélectrique des conditions de séparation. Ceux-ci doivent être 15 000 µW et 40 min, et le temps d’immobilisation de UV devrait être 80 s. Cependant, le temps d’immobilisation UV peut être défini au sein de l’ordre de 80-140 s et devrez peut-être être optimisé pour la protéine d’intérêt.
   Remarque : Un point de temps pour l’immobilisation des UV peut être réglé pour chaque cycle, mais pas pour chaque capillaire.
2. Jeu laver 1 ou 2 lavages, pour 150 s chaque lavage (par défaut) et l’anticorps primaire incubation pendant 120 min.
3. Ensemble de lavage 2 à 2 lavages, pour 150 s chaque lavage (par défaut) et l’anticorps secondaire incubation pendant 60 min.
4. Set de lavage 3, qui devrait être de 2 lavages, pour 150 s chaque lavage (par défaut).
5. Définir les durées d’exposition lorsque chimiluminescence sera détectée ; ceux-ci devraient être de 30, 60, 120, 240, 490 et 960 s. Toutes les étapes (1-8) seront effectuera dans un capillaire unique.

5. Exécutez le fichier de test

1. Une fois que tout est prêt, cliquez sur Démarrer pour commencer la course. Le logiciel vous demandera d’enlever les déchets, pour remplir l’eau et la zone capillaire, d’ajouter anolyte et catholyte sur le plateau de ressources, d’ajouter le tampon de lavage et enfin de charger la plaque dans le bac d’échantillon refroidi.
   Remarque : Retirez le couvercle de la boîte capillaire, mais ne retirez pas le couvercle de la plaque de test. Le couvercle de la plaque peut être supprimé automatiquement par l’appareil lorsque cela est nécessaire. Cela permet d’éviter l’évaporation de réactif.
2. Quelques minutes après la course a démarré, une barre de statut d’instrument s’affichera sur l’écran de l’ordinateur. Messages d’État et des barres de progression sont visibles correspondant au stade actuel de l’instrument.
   Remarque : Au départ, l’instrument va vérifier si tout est correct avant de procéder à Pipeter l’anolyte et catholyte dans le plateau de séparation, ramasser le premier bloc de 12 capillaires, enlever le couvercle de la plaque et placer les échantillons provenant de l’échantillon plaque dans les capillaires, puis enfin dans la chambre de séparation pour l’électrophorèse.
3. Cliquez sur l’écran d’exécution sommaire pour voir deux volets : statut et la séparation. Les utilisateurs peuvent afficher la progression d’exécution, et films de la séparation (12 capillaires de chaque cycle) peuvent être conservés une fois terminée l’étape de l’électrophorèse de chaque cycle. Pour observer la séparation de l’électrophorèse dans un capillaire, lire le film de séparation pour que capillaire en cliquant sur le programme désiré et ensuite le bouton de lecture dans le panneau de configuration.
4. Le fichier d’exécution peut être stocké automatiquement à l’issue de la course.

6. analyser les données (Figure S1)

1. Ouvrez le fichier à exécuter, puis sélectionnez l’onglet écran d’analyse. Les données affichées (pics) dans le graphique en Figure S1A, provient de capillaire sélectionné (c'est-à-dire, 4^ème capillaire du cycle 1).
2. Cliquez sur edit, puis analyse (Figure S1B). À ce stade, utilisateurs peuvent modifier la plage de pI, appliquer la norme pI approprié pour une expérience donnée, ajouter un ajustement de la crête et ajouter un nom de pic.
   Remarque : Lorsqu’à l’aide d’un ampholyte pH 5-8 prémélanger (comme c’est le cas ici), l’échelle standard recommandée à utiliser est l’un avec des peptides fluorescent étiquetés avec pi de 4,9, 6.0, 6.4, 7.0 et 7,3, et lorsque vous utilisez un pH 3-10 prémélange, l’échelle recommandée est l’un avec les pIs de 4.0 , 4,9 6,0, 6.4 et 7.3. ²
3. Résultats sont affichés dans l’onglet de pics ; les valeurs affichées pour les échantillons sont Position, pI, max. hauteur et superficie, % zone, pointe largeur et signal/bruit (S/B) (Figure S1C). Choisissez les données à utiliser et exporter les données pour une analyse ultérieure.
   NOTE : Les données ne peuvent être exportées qu’après marquage au sommet (Figure S1C).

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Résultats

Conception d’une nouvelle méthode de dosage : Une disposition de plaque dosage est illustrée dans la Figure 1 a. Au maximum, 96 puits peuvent être utilisés de la plaque 384 puits en blocs de 12 puits pour chaque maladie (anticorps). Chaque bloc de 12 puits peut commencer soit à partir de A1-A12 ou A13-A24. Lignes de code couleur permettent de distinguer des échantillons ou des réactifs de l’autre. Dans le modèle de test (

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Discussion

Sensibilité et la résolution des protéines sont cruciales pour la recherche protéomique sur des échantillons biologiques. Il est une grande valeur à pouvoir détecter les protéines qui sont présentes en quantités infimes dans les cellules. cIEF peut offrir une sensibilité améliorée et la résolution pour la détection des protéines et leurs isoformes⁴.

Cette technologie a été utilisée avec succès dans plusieurs protéomiques recherche rapports

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	For cIEF used (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementation to MV2 above
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
Ice