단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

요약

모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

초록

Immunoblotting 생물학 견본에서 단백질 특성에 대 한 많은 실험실에서 일상적인 기술 되고있다. 대체 전략을 제공 하는 다음 프로토콜, 기존의 immunoblotting 모 세관 (cIEF), 많은 장점을가지고 초점 전자 비교. 이는 완전 한 서쪽 더 럽 히 절차 수행 ultrathin 모 세관 내부 항 체 기반, 자동, 급속 한, 및 양적 방법입니다. 이 기술은 젤 막,도 말의 스트립 전송 필요 또는 기존의 immunoblotting에 일반적으로 필요한 영화를 x 선 하지 않습니다. 여기, 단백질 분리 (전자 포인트, pI) 그들의 책임에 따라, 사용 하 여 보다는 microliter (400 nL) 총 단백질 lysate의. 전기 이동 법, 후 단백질 자외선 빛 치료, 기본 및 보조 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용)에 의해 모 세관 벽에 움직일 수 있다 항 체 외피, 누구의 바인딩을 통해 감지 향상 화학 (ECL), 점령 하 고 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라에 의해 기록 된 수 있는 광 신호를 생성 한다. 디지털 이미지 분석 될 수 있다 및 계량 (피크 지역) 소프트웨어를 사용 하 여. 이 높은 처리량 절차 한 번;에 96 샘플을 처리할 수 있습니다 매우 민감한, picogram 범위의; 단백질 검출 그리고 자동화 때문에 높은 재현성 결과 생산입니다. 이러한 측면의 모두 매우 귀중 한 때 (예를 들어, 조직 샘플 및 생 검) 샘플의 수량 제한 요소입니다. 기술은 더 넓은 응용 프로그램 뿐만 아니라, 약물 또는 항 체, 바이오 마커 발견 및 진단 목적으로의 심사를 포함 하 여 있다.

서문

모 세관 전자 초점 (cIEF) 그들의 충전^1,2,3에 근거 하 여 단백질을 확인 하는 자동화 된, 모 세관 기반 immunoassay입니다. 그것은 매우 재현 하 고 신속 하 고 양적 단백질과 그들의 post-translationally 수정된 isoforms를 해결 하기 위한 능력입니다. 그것은 서쪽에 게 더 럽 히기와 같은 기존의 방법에 대안을 선물 한다. 매우 쉽게 액세스할 수 있는 샘플;에 풍부한 단백질의 존재 확인에 대 한 좋은 서쪽에 게 더 럽 히기 다양성, 시간 소비, 및 정확한 정량 모두 존재 도전, 특히 생물학 조직 샘플을 검사 하는 경우. 실제로, 다양성 서쪽 blotting에 고유의 문제는, 거기에 수많은 단계 참여, 로드 및 SDS 페이지 젤의 실행, 전송, 막에는 단백질의 다양 한 시 약으로 부 화 (예., 기본 및 보조 항 체, ECL), x 선 필름⁴에 개발. 현재, 서쪽 더 럽 히 기술 chemiluminescent 신호 (디지털 westerns)의 디지털 기록의 구현 개선 이다. 최근, 자동화 된 서쪽 더 럽 히 시스템 개발 되었습니다, 즉 모 세관 서 부, 보다 핸 즈 프리 하 고 젤 무료 시스템입니다. 전체 분석 결과 시스템^3,4에 샘플 플레이트 (샘플 모든 필요한 시 약을)의 로드에 따라 자동입니다. 악기는 단백질 분리 등 모든 단계를 수행 합니다 다른 단계, 그리고 개발 및 정량화 chemiluminescent 신호 사이 모 세관 벽, 항 체 외피 단백질의 동원 정지 세척. 따라서, 여기에 제시 된 cIEF 절차는 높은 해상도 감도 제공 합니다.

이 메서드는 중요 한 신호를 생성 고 단백질¹의 picograms에서 측정할 수 있습니다. 우수한 재현성 높은 감도이 기술을 임상 샘플의 분석을 위해 매우 유용 하다. 그것은 수 탐지 뿐 아니라 단백질의 포스트 번역 상 수정 (예: 다른 phosphorylated 단백질 isoforms) 구별. 이 기술을 성공적으로 사용 되었습니다 다른 신호 통로^4,5 암³, 새로운 치료제 개발을 목표로 하는 임상 연구를 해 부하 고 단백질 바이오 마커 및 약물 발견에 대 한 큰 가능성이 있다 .

프로토콜

1. 세포 문화, 자극, 및 세포의 용 해

참고:이 방법은 많은 세포 유형으로 사용할 수 있습니다. 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)를 사용 하 여 설명 되어 있습니다.

1. 적절 한 보충과 내 피 세포 기저 매체에서 10 cm 배양 접시 젤라틴 코팅에 HUVECs 문화 ( 재료의 표참조), 또한 5 %FCS, 표 피 성장 인자 (5 ng/mL), 혈관 내 피 성장 인자를 포함 하 고 (VEGF: 0.5 ng/mL), 기본적인 FGF (10 ng/mL), 인슐린과 같은 성장 인자 (20 ng/mL), 하이드로 코 티 손 (0.2 µ g/mL), 및 의약품 (1 µ g/mL).
2. 내 피 세포 기저 매체 1 %FCS 더 성장 인자 보충 보충 셀 밤새 굶 어.
3. 모든 매체를 발음, 한 접시 (제어), 내 피 세포 성장 인자 (기아 매체) 없이 문화 매체의 2 개 mL를 추가 다음 7 분에 대 한 두 번째 접시에 기아 문화 매체의 2 ml에서 50 ng/mL VEGF를 추가 합니다.
4. 매체를 발음 하 고 셀 10 mL 실내 온도 PBS로 2 회 세척.
5. 페 트리 접시 얼음에는 앞으로이 단계에서 거기에서 그들을 계속 확인 합니다.
6. 각 10 cm 접시를 얼음 차가운 세포의 용 해 버퍼 (Bicine/챕 스; 참조 테이블의 재료) 포함 수성 protease 억제제 믹스와 DMSO 억제제 믹스 (인산 가수분해 효소 억제제; 참조 테이블의 재료) 250-400 µ L를 추가 합니다. 적절 한 범위를 보장 하 고 얼음에 10 분 동안 계속 접시를 소용돌이 친다.
   참고: 효소와 DMSO 억제제 믹스의 최종 농도 1 x 이어야 한다.
7. 미리 냉장된 microfuge 관에 셀 스 크레이 퍼와 전송 접시에서 셀 다쳤어요. 최대 플라스틱 하 고 세포를 lyse 5 번 아래로.
8. 짧게 4 ° c.에 셀 sonicate sonicator를 다음과 같이 설정: 사이클의 수 = 5, 전원 = 낮음, = 5 초, 30 = s. 이 단계는 휴식 핵 산 및 세포를 lyse을 포함.
   참고: 쥡니다 단백질의 변성을 방지 하기 위해 가벼운 해야 합니다.
9. 소용돌이 관 5 s (아니 지속적으로), 2 번 (3 번), 얼음에 계속에 s.
10. 4 ° C에서 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리에 의해 lysate 명확히 다음 즉시 깨끗 한 미리 냉장된 microfuge 관에는 상쾌한을 전송 합니다.
11. Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 실험 키트⁴를 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다.
12. 만들기 10 µ L aliquots, 스냅 드라이 아이스 나 액체 질소를 고정 하 고 사용까지-80 ° C에서 저장.

2. 샘플 혼합 준비 (150 µ L 샘플 혼합 계산)

1. 먼저, DMSO 억제제 믹스의 1 µ L을 추가 하 여 샘플 희석제 믹스를 준비 (50 x 재고) 및 47 µ L의 샘플 희석제를 protease 억제제 (25 x 재고)의 2 µ L ( 재료의 표참조), 그렇게 DMSO 억제제와 프로 테아 제 억제제의 최종 농도 1 x가 된다. 다음, 단백질 lysates 샘플 희석제 믹스를 사용 하 여 (단계 2.3 참조) 원하는 농도를 희석.
2. 표준 3.325 µ L 사다리 ( 테이블의 자료; 60 x 재고 참조) 추가 하 여 ampholyte/사다리/protease 억제제/DMSO 억제제 믹스를 준비 protease 억제제 (25 x), 137.675 µ L ampholyte 프리 믹스 (참조 테이블의에 DMSO (50 x) 억제제의 3 µ L의 6 µ L 재료). 소용돌이 관 최소 15 s 총, 5 한 번에 s (3-4 회), 얼음에 계속.
3. DMSO, protease 억제제, 및 pI 표준 사다리의 마지막 농도 1 X, 되 고 모 세관에 있는 단백질 최종 원하는 농도 도달 2.1과 2.2를 1:3 비율에서 단계에서 솔루션을 혼합 (예를 들어, 50 µ g/mL 사용 되었다 그림 2)입니다.
   참고: 모 세관에 잘 단백질 농도가 같습니다.
4. 384 잘 플레이트 분석 결과 템플릿 레이아웃에 따라 적절 한 우물에 샘플 혼합의 10 µ L 로드 (단계 3과 그림 1참조) 얼음에 플레이트를 유지 하 고.
5. 희석 주 (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) 및 2 차 항 체 (1:300) 항 체 희석 액 ( 재료의 표참조)의 각 음에 이차 항 체의 기본 및 15 µ L 10 µ L 플라스틱 및.
   참고: 일반적으로, 항 체의 높은 농도 기존의 서양 오 점 비교 분석 실험 cIEF 필요 합니다.
6. Luminol 믹스 및 XDR (1:1 비율, 참조 테이블의 재료)를 함께 과산화와 각 우물에 15 µ L 플라스틱.
   참고: 사용 하기 전에 때마다 이러한 솔루션 신선한을 혼합 하 고 얼음에 계속.
7. 일단 샘플 및 모든 시 약은 접시에 pipetted는, 액체를 회전 하 고 거품을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 2500 x g에서 격판덮개 원심. 거품은 아직도 존재 하는 경우 얇은 피 펫 팁을 사용 하 여 수동으로 제거.
   참고: 샘플 또는 잘; 당 약 20 µ L를 로드 하지 마십시오 그렇지 않으면, 악기 피펫으로 제대로 세척 될 수 없습니다. 모든 시 약을 준비 하는 제조 업체에서 사용 설명서를 확인 합니다.

3. 시스템 소프트웨어 (그림 1) 새로운 분석 결과 서식 파일을 디자인

1. 시스템 소프트웨어를 열고 파일 메뉴에서 "새로 만들기"를 클릭 합니다.
2. 레이아웃 창으로 이동한 시 약 및 384 잘 판에 샘플에 대 한 위치를 지정 합니다. 최대 384-잘 접시 당 96 웰 스의 최대 사용.
3. 시 약 할당 블록에서 잘 곳을 클릭 하 여 확인 합니다. 12 우물의 행 블록을 선택 합니다. 웰 스, 예를 들어, 1-12 또는 13-24, 기본적으로 블록으로 할당 됩니다.
4. 레이아웃 창 도구 모음에 이동한 빈 행 블록 또는 샘플, 기본, 보조 또는 luminol 행 블록을 삽입 합니다. 그래서 그들은 쉽게 차별화 하 각 블록 다른 색을 할당 합니다.
   참고: 지금까지 우물을 클릭 하면에 검은색 테두리 창에서 새 블록 삽입 될 위치가 블록 주위 볼 수 있습니다. 행 블록 또한 삭제할 수 있습니다.
5. 프로토콜 창에가 고 접시에 시 약 위치를 선택 하십시오. 그런 다음 샘플 열에서 셀을 클릭 하 고 드롭다운 메뉴에서 시를 선택 합니다.
6. 이 같은 방식 기본, 보조, 시 약 위치 및 각 사이클 luminol 선택 합니다.
7. 주 또는 보조 항 열에 한 번에 하나씩 셀을 클릭 하 고 필요한 경우 부 화 시간을 변경.
   참고: 각 사이클 항목 노트 추가할 수도 있습니다.
8. 프로토콜 섹션의 '추가' 버튼을 클릭 하 여 주기를 추가 합니다. 1 사이클, 4 사이클, 또는 모든 사이클 (8 사이클의 최대 프로토콜에 추가 될 수 있습니다).
   참고: 복사 하 고이 단계에서 주기 정보를 붙여 가능 하다: 한 주기를 선택, 편집, 복사 및 붙여넣기로 이동.
9. 1 차 및 이차 항 체 그들의 카탈로그 및 희석, 번호 등, 템플릿 창에서의 정체성 같은 샘플에 대 한 정보를 입력 합니다. 실행된 후 분석 중에 유용 선택적 단계입니다.
10. 새로운 분석 결과 파일을 저장 합니다. '시작' 버튼을 클릭 하기 전에 신속 하 게 모든 올바른지 확인 레이아웃을 확인 합니다.

4입니다. 프로토콜 cIEF 악기 설정에 대 한

1. 모 세관 전자 초점 전기 영동 분리 조건을 설정 합니다. 이러한 15000 µW 및 40 분 이어야 하 고 UV 동원 정지 시간 80 이어야 한다 s. 그러나, UV 동원 정지 시간 80-140 s의 범위 내에서 설정할 수 있습니다 그리고 관심사의 단백질에 대 한 최적화를 할 수 있습니다.
   참고: 각 모 세관 아니지만 각 사이클 UV 동원 정지에 대 한 시간 포인트를 설정할 수 있습니다.
2. 세트 150에 대 한 1 ~ 2 세척, 세척 s 각 세척 (기본값), 그리고 120 분에 대 한 1 차적인 항 체 외피.
3. 세트 150 2 2 세척, 세척 s 각 세척 (기본값), 그리고 60 분에 대 한 2 차 항 체 외피.
4. 워시 3, 150 2 세척 되어야 설정 s 각 세척 (기본값).
5. 설정 노출 시간 때 화학 감지 될 것 이다; 이 30, 60, 120, 240, 490, 그리고 960 해야 s. 모든 단계 (1-8) 단일 모 세관에서 수행 될 것 이다.

5. 분석 결과 파일을 실행

1. 모든 준비가 되 면, 시작을 클릭 실행 하려면. 소프트웨어 물 및 모 세관 상자, anolyte 및 catholyte 리소스 트레이 워시 버퍼를 추가 하려면 추가 리필 낭비를 제거 하 라는 메시지가 나타납니다 그리고 마지막으로 냉각된 샘플 트레이 접시를.
   참고: 모 세관 상자에서 뚜껑을 제거 하지만 분석 결과 접시에서 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 접시에서 뚜껑 때 필요한 악기에 의해 자동으로 제거할 수 있습니다. 이 시 약 증발을 방지할 수 있습니다.
2. 몇 분 후에 실행 시작 했다, 악기 상태 표시줄은 컴퓨터 화면에 표시 됩니다. 상태 메시지 및 진행률 표시줄 해당 악기의 현재 단계를 볼 수 있습니다.
   참고: 처음, 악기 확인 다 분리 쟁반으로 anolyte와 catholyte를 플라스틱으로 진행 12 모세의 첫 번째 블록을 따기, 접시의 뚜껑을 제거 하 고 샘플에서 샘플을 배치 하기 전에 정확한 플레이트는 모세 혈관으로 그리고 마지막으로 전기 이동 법 별거 챔버로.
3. 볼 두 개의 창이 실행된 요약 화면에서 클릭: 상태 및 분리. 사용자 실행된 진행률을 볼 수 있으며 각 사이클의 전기 이동 법 단계가 완료 되 면 분리 (각 주기의 12 모세 혈관)의 영화를 저장할 수 있습니다. 에 모 세관 전기 이동 법 별거를 관찰, 그 모 세관에 대 한 분리 영화 원하는 주기 그리고 컨트롤 패널에서 재생 버튼을 클릭 하 여 재생 합니다.
4. 실행된 파일 실행 완료 시 자동으로 저장할 수 있습니다.

6. 분석 데이터 (그림 s 1)

1. 실행된 파일을 열고 분석 화면 탭을 선택 합니다. 그림 S1A, (봉우리) 샘플 그래프에 표시 되는 데이터는 선택한 모 세관 (즉, 1 주기에서 4^번째 모 세관)에서입니다.
2. 편집 그리고 분석 (그림 S1B)를 클릭 합니다. 이 단계에서 사용자가 변경할 수 pI 범위, 주어진된 실험에 대 한 적절 한 pI 표준 적용, 피크 맞는 추가 있으며 피크 이름을 추가.
   참고: pH 5-8 ampholyte를 사용 하 여 (같은 경우 여기) 공기로 때 사용 권장된 표준 사다리 4.9, 6.0, 6.4, 7.0과 7.3의 pIs와 붙일 레이블된 펩 티 드와 하나 이며 pH 3-10 프리 믹스를 사용 하면 권장된 사다리 4.0의 pIs와 하나 4.9, 6.0, 6.4 및 7.3. ²
3. 봉우리 탭에 표시 됩니다. 샘플에 대 한 표시 하는 값은 위치, pI, 피크 높이 및 지역, % 영역, 피크 폭, 및 신호를 잡음 (S/N) (그림 S1C). 를 사용 하려면 데이터를 선택 하 고 추가 분석을 위해 데이터를 내보낼.
   참고: 데이터만 피크 (그림 S1C) 라벨 후 내보낼 수 있습니다.

결과

디자인의 새로운 분석 결과: 분석 결과 플레이트 레이아웃 그림 1A에 표시 됩니다. 극대, 96 웰 스 384-잘 접시 12 웰 스의 블록에서에서 각 조건 (항 체)에 대 한 사용할 수 있습니다. 12 우물의 각 블록 A1-A12 또는 A13-A24에서 시작할 수 있습니다. 색상 코드 행 하나 다른 샘플 또는 시 약을 구별할 수 있습니다. 분석 결과 서식 파일 (

토론

감도 및 단백질의 해상도 proteomic 연구 생물 학적 샘플에 대 한 중요 한 있습니다. 셀에 분 수량에 존재 하는 단백질을 감지할 수 있게 되 고 큰 가치가 있다. cIEF는 향상 된 감도 단백질과 그들의 isoforms⁴의 검출에 대 한 해상도 제공할 수 있습니다.

이 기술은 많은 proteomic 연구 보고서^5,,67에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	For cIEF used (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementation to MV2 above
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
Ice