Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Özet

Kapiller isoelectric odaklanarak proteinler ve onların izoformlarının son derece küçük biyolojik örneklerinden detaylı karakterizasyonu etkinleştirme bir antikor tabanlı, vericiyi, yüksek üretilen iş, tekniğidir. Aşağıda bir protokol olarak algılanmasını ve miktar belirli proteinlerin ve onların izoformlarının otomatik ve robotized bir şekilde açıklanmıştır.

Özet

Immunoblotting biyolojik örneklerinden protein karakterizasyonu için birçok laboratuarlarında rutin bir teknik haline gelmiştir. Aşağıdaki iletişim kuralı bir alternatif strateji sağlar, kapiller isoelectric (cIEF), pek çok avantajı ile odaklama için geleneksel immunoblotting karşılaştırıldığında. Bu yordamın tamamı Batı blotting bir ultrathin kılcal içinde gerçekleştiği bir antikor tabanlı, otomatik, hızlı ve nicel bir yöntemdir. Bu teknik bir membran lekesi sıyırma, aktarmak için bir jel gerektirmez veya geleneksel immunoblotting için genellikle gerekli olan filmler, x-ışını. Burada, proteinler onların ücret (isoelectric noktası; pI) göre kullanarak daha az bir microliter ayrılır (400 nL) Toplam protein lysate. Elektroforez sonra proteinler, kapiller duvarları ultraviyole ışık tedavisi, birincil ve ikincil (horseradish peroksidaz (HRP) Birleşik) tarafından takip tarafından immobilize antikor kuluçka bağlantısını aracılığıyla algılandığında, gelişmiş Kemiluminesan (ECL), yakalanan ve bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tarafından kaydedilen bir ışık sinyal üreten. Dijital görüntü analiz edilebilir ve (pik alanı) sayısal yazılım kullanarak. Bu yüksek üretilen iş yordamı 96 örnekleri teker teker işleyebilir; Son derece hassas, protein algılama picogram aralığında olduğunu; ve otomasyon nedeniyle son derece tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Örnekleri (Örneğin, doku örnekleri ve biyopsi) miktarı kısıtlayıcı bir faktör olduğunda tüm bu yönleriyle son derece değerlidir. Teknik uyuşturucu veya antikorlar, biyomarker keşif ve tanılama amacıyla tarama dahil olmak üzere de, daha geniş uygulama alanı vardır.

Giriş

Kapiller isoelectric (cIEF) odaklanarak proteinler onların ücret^1,2,3temel alınarak giderir, kılcal tabanlı otomatik immunoassay olduğunu. Bu son derece tekrarlanabilir ve proteinler ve onların post-translationally değiştirilmiş izoformlarının hızla ve kantitatif çözme yeteneğine sahip olduğunu. Western Blot gibi geleneksel yöntemlerle bir alternatif sunar. Western blot kolayca erişilebilir örnekleri bol proteinlerin varlığı teyit için çok iyi olmakla birlikte; değişkenliği, zaman tüketimi ve doğru Nefelometri tüm mevcut sorunlar, özellikle biyolojik doku örnekleri incelerken. Nitekim, değişkenlik içsel bir sorun western Blot, olarak orada çok sayıda adımları, yükleme ve SDS-sayfa jelleri kaçmaktan, proteinler membran, üzerine transferi gibi çeşitli reaktifleri ile kuluçka dahil (Örn., birincil ve ikincil antikorlar, ECL) ve geliştirme üzerine röntgen filmi⁴. Halen, Batı blotting tekniği dijital kayıt chemiluminescent sinyal (dijital westernler) uygulanması ile gelişiyor. Son zamanlarda, otomatik bir Batı blotting sistem geliştirilmiştir, daha yakışıklı-özgür ve jel içermeyen sistemi olan yani kılcal Batı. Tüm tahlil sistem^3,4örnek plaka (tüm gerekli reaktifler örnekleriyle) yüklenmesini takiben otomatikleştirilmiştir. Araç protein ayırma gibi tüm adımları gerçekleştirir tutuklaması üzerine kapiller duvarı, antikor incubations, proteinlerin farklı adımlar ve geliştirme ve miktar chemiluminescent sinyallerin arasında yıkar. Böylece, burada sunulan cIEF yordam daha yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlar.

Bu yöntem olarak oluşturulan ve proteinler¹EAG'yi sayısal sinyalleri duyarlıdır. Mükemmel tekrarlanabilirlik yüksek hassasiyet bu teknoloji klinik örneklerin analizi için çok kullanışlıdır. Bu tespit yayılımının sonrası translasyonel modifikasyon (Örneğin, farklı fosforile protein izoformlarının) proteinlerin ayırt. Bu teknoloji farklı sinyal yolları^4,5 kanser³yeni tedavi geliştirmeyi amaçlayan klinik çalışmalarda incelemek için başarıyla kullanılmaktadır ve protein biyomarker ve ilaç keşfi için büyük bir potansiyele sahip .

Protokol

1. hücre kültürü, stimülasyon ve lizis

Not: Bu yöntem çok hücre türü ile kullanılabilir. Yöntem göstermek için örnek insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) kullanarak tanımlanır.

1. Kültür HUVECs uygun takviyesi ile endotel hücre bazal ortamda 10 cm Petri yemekleri jelatin kaplı (bkz. Tablo reçetesi) ve ayrıca % 5 FCS, epidermal büyüme faktörü (5 ng/mL), vasküler endotelyal büyüme faktörü içeren (VEGF: 0,5 ng/mL), temel FGF (10 ng/mL), insülin benzeri büyüme faktörü (20 ng/mL), hidrokortizon (0.2 µg/mL) ve askorbik asit (1 µg/mL).
2. Hücreler endotel hücre bazal orta % 1 FCS ve hiçbir büyüme faktörü ek takviye ile gecede açlıktan.
3. Tüm Orta Aspire edin, büyüme faktörleri (açlık orta) olmadan endotel hücre kültür orta 2 mL bir tabak (kontrol) ekleyin, sonra açlık kültür orta 7 min için ikinci bir tabak içinde 2 ml 50 ng/mL VEGF ekleyin.
4. Orta Aspire edin ve hücreleri 2 kez 10 mL oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.
5. Petri yemekler buz üzerinde ve bu adımından itibaren orada kalmalarını sağlamak.
6. 250-400 µL buz soğuk lizis arabellek (Bicine/arkadaşlar; bkz: Malzemeler tablo) içeren sulu proteaz inhibitörü mix ve DMSO inhibitörü mix (fosfataz inhibitörleri; bkz: Malzemeler tablo) her 10 cm plakasına ekleyin. Uygun kapsama sağlamak ve buz üzerinde 10 min için tutmak için plaka girdap.
   Not: 1 x proteaz ve DMSO inhibitörü mix son konsantrasyon olmalıdır.
7. Hücreleri yemek için önceden soğutulmuş microfuge tüp bir hücre kazıyıcı ve transferi ile kazı. Pipet yukarı ve hücreleri parçalayıcı için 5 kat aşağı.
8. Kısaca 4 ° C'de hücreler solüsyon içeren temizleyicide Sonicator aşağıdaki gibi ayarlayın: devir sayısı 5, güç = düşük =, = 5 sn, kapalı = 30 s. Bu adım ve nükleik asitler kırmak için hücreleri parçalayıcı değil dahil edilir.
   Not: Sonication denatürasyon proteinlerin önlemek için hafif olmalıdır.
9. Girdap için 5 tüp s (sürekli değil), 2 s bir zamanda (3 kere) ve buz üzerinde tutun.
10. Santrifüjü 14.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından lysate açıklamak, o zaman hemen süpernatant temiz önceden soğutulmuş microfuge tüp aktarmak.
11. Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil Seti⁴kullanan protein konsantrasyonu ölçmek.
12. Yapmak 10 µL aliquots, ek Kuru buz veya sıvı azot içinde dondurmak ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.

2. numune karışım hazırlama (hesaplama için 150 µL örnek Mix)

1. İlk olarak, DMSO inhibitörü Mix 1 µL ekleyerek bir örnek Dilüent karışım hazırlamak (50 x stok) ve proteaz inhibitörleri (stok 25 x) için örnek seyreltici 47 µL 2 µL (bkz. Tablo malzemeler), böylece DMSO inhibitörleri ve proteaz inhibitörleri son konsantrasyon 1 x olur. Ardından, istenen konsantrasyonları (bkz. Adım 2.3) elde etmek için örnek Dilüent karışımı kullanarak protein lysates oranında seyreltin.
2. 3.325 µL standart merdiven (bkz. Tablo malzemeler60 x stok;) ekleyerek ampholyte/merdiven/proteaz inhibitörü/DMSO inhibitörü karışım hazırlamak proteaz inhibitörü (25 x), DMSO (50 x) inhibitörü 137.675 µL ampholyte Premiks (görmek tablo için 3 µL 6 µL Malzemeler). Girdap tüp en az 15 s, toplam 5 teker s (3 - 4 kez) ve buz üzerinde tutun.
3. Böylece DMSO, proteaz inhibitörleri ve pI standart merdiven son konsantrasyonları olmak 1 X ve kapiller protein son istenen konsantrasyonları ulaşmak adımlar 2,1 ve 2,2 1:3 oranında, çözümlerinden mix (Örneğin, 50 µg/mL kullanılmıştır için Şekil 2).
   Not: Protein konsantrasyonu kılcal ve iyi aynıdır.
4. Örnek Mix 10 µL uygun kuyuya 384-şey plaka tahlil şablon düzeni göre yük (adım 3 ve Şekil 1bakınız) ve plaka buz üzerinde tutun.
5. Seyreltik İlköğretim (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1:500) ve ile antikor seyreltici ikincil antikorlar (1:300) (bkz. Tablo malzeme) ve her kuyuya ikincil antikorların birincil ve 15 µL 10 µL pipet.
   Not: genel olarak, antikorların yüksek konsantrasyon, cIEF deneyleri ile karşılaştırıldığında geleneksel Batı lekesi için gereklidir.
6. Luminol mix ve XDR (1:1 oran; bkz: Malzemeler tablo) birlikte peroksit ve 15 µL her kuyuya pipet.
   Not: Bu çözümleri taze hep kullanmadan önce Mix ve buz üzerinde tutun.
7. Örnekler ve tüm kimyasalları kalenin pipetted sonra 2500 x g 10 dk 4 ° C'de sıvı spin ve baloncuklar kaldırmak için plaka santrifüj kapasitesi. Bubbles hala varsa, bunları el ile ince pipet ucu kullanarak kaldırın.
   Not: örnek veya reaktifler iyi başına 20'den fazla µL yük değil; Aksi takdirde, enstrüman pipet düzgün yıkanmış değil. Kullanım Kılavuzu tüm reaktifler hazırlamak için üretici takip ettiğinizden emin olun.

3. sistem bilgisayar yazılımı (Şekil 1) ile yeni bir tahlil şablon tasarımı

1. Sistem yazılımını açın ve "yeni" Dosya menüsünde'ı tıklatın.
2. Düzen bölmesine git ve yerleri reaktifleri ve örnekleri 384 bir şey plaka için atayın. En fazla 384-şey plaka başına 96 wells için kullanın.
3. Reaktif atama blok bir kuyuda her yerde yapabilirsiniz. 12 kuyu satır bloğunu seçin. Wells, Örneğin, 1-12 veya 13-24, bir blok varsayılan olarak atanır.
4. Düzen bölmesi araç çubuğunun üzerine gidin ve bir boş satır bloğu veya bir örnek, birincil, ikincil veya luminol satır bloğu yerleştirin. Böylece ayırt etmek kolaydır her blok farklı bir renk atanır.
   Not: bir şey tıkladığınızda, siyah bir sınır nerede bölmesinde yeni blok eklenir blok etrafında görülebilir. Bir satır bloğu da silinebilir.
5. İletişim kuralı bölmesine git ve plaka bir reaktif konumu seçin. Sonra örnek sütununda bir hücreyi tıklatın ve açılır menüden reaktif seçin.
6. Bu aynı şekilde reaktif mekanlar için birincil, ikincil ve her döngüsü luminol seçin.
7. Teker teker, birincil veya ikincil antikor sütundaki hücreler'i tıklatın ve gerekirse kuluçka kez değiştirin.
   Not: Giriş notları her döngüsü de eklenebilir.
8. Devir Protokolü bölümünde 'Ekle' düğmesini tıklatarak ekleyin. 1 döngüsü, 4 döngüleri veya tüm döngüleri (en fazla 8 devir protokolü için eklenebilir).
   Not: Bu adımda döngüsü bilgi kopyalayıp mümkündür: bir döngü seçin, Düzenle ve kopyalama ve yapıştırma için gidin.
9. Örnek kimlik Katalog sayılar ve dilutions, vb, Şablon bölmesinde birincil ve ikincil antikorlar gibi bilgileri girin. Bu çalıştırma sonrası çözümleme sırasında yararlıdır isteğe bağlı bir adımdır.
10. Yeni tahlil dosyayı kaydedin. 'Başlat' düğmesini tıklatmadan önce hızlı bir şekilde düzen her şeyin doğru olduğundan emin olmak için kontrol edin.

4. cIEF araç ayarı için iletişim kuralı

1. Kapiller isoelectric odaklama Elektroforez ayırma koşulları ayarlayın. Bunlar 15.000 µW ve 40 dk olmalı ve UV immobilizasyon zaman 80 olmalıdır s. Ancak, UV immobilizasyon zaman 80-140 s aralığı içinde ayarlayabilirsiniz ve faiz protein için optimize edilmiş olması gerekir.
   Not: UV immobilizasyon için bir zaman noktası her döngüsü, ancak her kılcal için ayarlayabilirsiniz.
2. Küme için 150 1-2 yıkama yıkamak s her yıkama (varsayılan) ve birincil antikor kuluçka 120 dk için.
3. Küme için 150 2-2 yıkama yıkamak s her yıkama (varsayılan) ve ikincil antikor kuluçka 60 dk için.
4. Ayarlamak için 150 2 yıkama olmalıdır yıkama 3, s her yıkama (varsayılan).
5. Ne zaman Kemiluminesan tespit edilecektir pozlama süreleri ayarla; Bunlar 30, 60, 120, 240, 490 ve 960 olmalıdır s. Tüm adımları (1-8) tek bir kılcal yapılacaktır.

5. tahlil dosyayı çalıştırma

1. Her şey hazır olduğunda, Başlat'ı tıklatın çalışma başlayacak. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı-ecek-e sevketmek atık su ve anolyte ve catholyte kaynak tepsi yıkama arabellek eklemek için eklemek için kılcal kutusunu doldurmak için kaldırmanızı ve nihayet plaka soğutmalı örnek tepsisine yüklemek için.
   Not: kapağı kapiller kutusundan kaldırmak ama kapağı tahlil plaka kaldırmaz. Kapak plaka üzerinden otomatik olarak gerekli olduğunda araç tarafından kaldırılabilir. Bu reaktif buharlaşma önlemeye yardımcı olur.
2. Birkaç dakika sonra kaçmaya başladı, bilgisayar ekranında bir enstrüman durum çubuğu görüntülenir. Durum iletileri ve ilerleme çubukları gerecin geçerli sahne alanı'na karşılık gelen görülebilir.
   Not: Başlangıçta, aracı her şeyi anolyte ve catholyte ayrılık tepsisine pipette için devam, 12 kılcal ilk bloğunu seçmek, plaka kapak kaldırma ve örnekleri örnekten yerleştirerek önce doğru olup olmadığını kontrol eder kılcal damarlar, plaka ve sonra nihayet Elektroforez için ayırma odasına.
3. ' I tıklatın çalışma Özet ekranı iki bölmeleri görmek için: durum ve ayırma. Kullanıcı-ebilmek görüş çalışma ilerleme ve Elektroforez adım her döngüsü tamamlandığında Filmler (12 kılcal damarlar her döngüsü) ayrılması depolanabilir. Bir kılcal Elektroforez ayrımına gözlemlemek için istenen döngüsü ve sonra Denetim Masası'nda Oynat düğmesini tıklayarak o kılcal için ayrılık filmi oynatın.
4. Çalışma dosyası çalışma tamamlandıktan sonra otomatik olarak saklanır.

6. verileri (Şekil S1) analiz

1. Çalışma dosyasını açın ve analiz ekran sekmesini seçin. Şekil S1Aiçinde seçili kılcal (yani, 4^th kılcal çevriminin 1) (pik) örnek grafikte gösterilen verileri uzaklıktadır.
2. Düzenleme ve sonra analiz (Şekil S1B) tıklatın. Bu aşamada, kullanıcılar pI aralığını değiştirmek, belirli bir deney için uygun pI standart uygulamak, bir tepe uyum ekleyebilir ve bir tepe adını ekleyin.
   Not: pH 5-8 ampholyte kullanarak premix zaman (burada olduğu gibi), kullanmak için önerilen standart merdiven PIS 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 ve 7.3 ile fluorescently etiketli peptidler biriyle ise pH 3-10 Premiks kullanırken, önerilen merdiven bir PIS 4.0 ile , 4.9, 6.0, 6.4 ve 7.3. ²
3. Sonuçlar zirveleri sekmesinde görüntülenir; örnekleri için görüntülenen konumu, pI, pik yüksekliği ve alanı, % alanı, en yüksek genişlik ve sinyal-gürültü (S/H) (Şekil S1C) değerlerdir. Hangi verilerin kullanılacağını seçin ve daha fazla çözümleme için veri verin.
   Not: Veriler yalnızca tepe (Şekil S1C) etiketleme sonra verilebilir.

Sonuçlar

Yeni bir testin tasarım: Bir tahlil plaka Düzen Şekil 1Aile gösterilir. Sonuna kadar 96 wells 384-şey plaka blok 12 Wells (antikor) her koşul için kullanılabilir. Her blok 12 Wells A1-A12 veya A13-A24 başlayabilirsiniz. Renk kodlu satır örnekleri ya da reaktifler birbirinden ayırt etmek izin. Tahlil şablon (Şekil 1B), ilgili bilgi için bu özel tahlil, hangi-ebilmek var olmak kullanılmış sonuç ...

Tartışmalar

Duyarlılık ve kararlılık proteinlerin biyolojik örnekler proteomik araştırma için çok önemli. Hücrelerdeki dakika miktarlarda olan proteinleri tespit etmek mümkün olmakta çok değerli şey. cIEF geliştirilmiş hassasiyet ve proteinler ve onların izoformlarının⁴tespiti için çözünürlük sunabilir.

Bu teknoloji birçok proteomik araştırma raporları^5,6,7' ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	For cIEF used (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementation to MV2 above
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
Ice