无输血或强心剂剂的大鼠心肺旁路移植模型

摘要

在这里, 我们提出一个协议来描述一个简单的恢复心肺旁路模型没有输血或强心剂剂的大鼠。该模型可用于体外循环术后长期多脏器后遗症的研究。

摘要

体外循环 (CPB) 在心血管手术中是必不可少的。尽管体外循环技术和设备的戏剧性改良, 多脏器并发症与长期体外循环仍然影响心血管手术的结果, 并可能恶化的术后发病率和死亡率。动物模型综述的临床应用可以澄清在体外循环期间发生的病理生理过程, 并促进临床前期研究, 以制定预防这些并发症的战略。大鼠体外循环模型是有利的, 因为他们更大的成本效益, 方便的实验过程, 丰富的测试方法在基因或蛋白质水平, 和遗传一致性。它们可用于调查免疫系统激活和促炎性细胞因子的合成, 赞美活化和氧自由基的产生。大鼠模型已被提炼, 并逐渐取代了大型动物模型。在这里, 我们描述一个简单的体外循环模型, 没有输血和/或强心剂剂的老鼠。这种恢复模式允许研究体外循环的长期多器官后遗症。

引言

在 1953年, 约翰·小长臂猿成功地使用了 CPB¹进行了第一次心脏手术, 随后它成为心血管外科的基本形态。虽然这些技术和设备已大为完善, 但与体外循环有关的多脏器并发症仍会损害心血管手术的结果, 并可能影响术后发病率和死亡率²。与体外循环有关的器官损害是由免疫系统活化和促炎细胞因子的合成、赞美活化和氧自由基的产生而引起的²。然而, 它的病理生理学尚未完全阐明。

动物模型综述的临床应用, 使对体外循环期间和之后的病理生理过程的澄清;这可以促进临床前研究, 以制定战略, 以避免这些并发症。自从鲍佩维奇et al。第一次报告了鼠体外循环模型在 1967年³, 大鼠体外循环模型已经完善, 并已逐渐取代大型动物模型, 由于更大的成本效益, 方便的实验过程, 和大量的测试方法在遗传和蛋白质水平。此外, 近亲繁殖的大鼠可以遗传相同, 减少可能的生物偏见。

Fabre et al。首先建立了恢复模型, 允许对 CPB 的长期多器官后遗症进行研究⁴。这种简单的生存模式的优点是灵活性 (体外循环流量和持续时间), 稳定的生命条件, 和重现性的系统性炎症。大鼠体外循环模型已成为研究预防体外循环⁵中多脏器损伤的治疗策略的关键, 最近开发了各种模拟体外循环临床情况的模型。De 兰格et al。建立了心脏骤停模型, 可用于描述与心肌损伤有关的酶、遗传和组织学反应⁷。彼得斯et al。采用小型化体外循环模型进行心肌梗死和控制再灌注, 通过局灶性缺血再灌注损伤分析心脏功能障碍⁸。Jungwirth et al。首先建立了深低温循环骤停 (DHCA) 模型, 它可以阐明 DHCA 的全球缺血再灌注损伤, 支持潜在神经保护策略⁶。研究使用 DHCA 调查体温过低, 再灌注和/或溶血触发信号事件的影响⁹。深低温可能会影响各种酶和通路的活化和失活, 而机制仍然未知的¹⁰。另一方面, 心脏骤停模型或心脏缺血模型必须用于研究缺血再灌注心脏损伤。这些不同的大鼠体外循环模型, 高度重述人类体外循环可能揭示与体外循环有关的病理过程, 并有助于缓解与体外循环相关的并发症。

该协议说明了一个简单的体外循环模型, 没有输血或强心剂剂的大鼠。该模型可用于研究体外循环的长期多脏器后遗症。

研究方案

在实验之前, 所有的老鼠都应该得到一个星期的适应。所有动物的外科手术都应按照《动物护理和使用指南》 (www.nap.edu/catalog/5140.html) 或其他适当的道德准则进行。议定书应由动物福利委员会在适当的机构批准, 然后再继续。所有后续的程序必须在无菌条件下执行。

1. 准备体外循环电路

注: 佩戴个人防护用品, 包括手套、眼镜、清洁大衣或一次性长袍。

1. 体外循环电路的设置
   1. 将聚氯乙烯管与静脉储层连接, 预先设计为体外循环电路, 以及改良的新生儿膜肺, 如图 1所示。确保所有连接紧密, 不要漏水。
   2. 根据制造商的协议, 将体外循环电路设置到滚筒泵装置。
   3. 将滚筒泵保持在高度可调节的工作台上, 并将工作台的高度调整到实验台下面的10厘米处。
2. 体外循环电路的启动
   1. 将12毫升羟乙基淀粉溶液与0.1 毫升肝素和0.5 毫升7% 碳酸氢钠溶液混合在一起启动体外循环电路。
   2. 以11毫升的启动溶液为主要电路, 用泵辊轻轻旋转。把18口径的排气针放进储气库中。
   3. 打膜肺几次到 deair, 与倾斜的肺。空气必须完全遮蔽, 以避免空气栓塞和氧合不足。在电路启动过程中, 通过设置在储层上的电热灯加热电路。

2. 体外循环前的程序

注: 使用前应用70% 酒精或季铵盐化合物消毒手术现场和器械。

1. 麻醉和动物设置
   1. 麻醉一只在蒸发器中吸入3.0% 异氟醚混合空气的老鼠。把老鼠放在工作架上, 然后将16口径的套管插管到气管里。按照您当地的动物护理指南, 关于镇痛剂量和频率 (如:
      丁丙诺啡0.005 毫克/千克)
      注意: 老鼠必须在深度麻醉和失去反射。呼吸应该是有节奏的, 但不能被逮捕。
   2. 将老鼠转到装有电热垫的手术台上。启动机械通气, 8 毫升/千克的潮汐量, 呼吸速率为70循环/分钟, 30% 的灵感氧分数监测的氧气传感器。
   3. 用 1.5-2.0% 异氟醚维持麻醉, 并在体外循环启动时增加对氯胺酮/甲苯噻嗪的管理。
   4. 用直肠探头监测直肠温度。通过调整热垫的温度并将电路置于散热灯上, 保持常温37摄氏度的体温。
   5. 将大鼠仰卧位, 用针固定四肢。通过将心电图电极针设置为双侧肩和左腹, 对心率进行监测。放一条湿润的纱布或在眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。
2. 插管
   1. 通过 sprayingby 喷雾70% 乙醇或另一种防腐溶液对全身表面进行消毒后, 在两侧腹股沟区和右颈部区域剃须剃刀毛。局部麻醉药 (如利多卡因) 应在进行皮肤切口前使用。注: 作为一种替代方法, 可使用切口部位的外科擦洗, 而不是全身喷雾70% 乙醇, 以避免体温下降。
   2. 用剪刀切开皮肤 (大约5毫米) 在双侧腹股沟区域和右颈部区域, 并坦率地解剖组织以暴露右侧的主股动脉。从附近的静脉和神经仔细地分离动脉。结扎在股动脉末端由4-0 丝和紧张暴露。
   3. 用微剪刀垂直向动脉切开右股动脉壁 (约1毫米), 并仔细 cannulate 24 口径静脉导管, 从切口到深度1厘米以监测全身动脉。动脉血中气体分压的压力和分析。
   4. 从导管中管理肝素钠 (500 磅/千克)。
   5. 按照步骤2.2.2 和 2.2.3 cannulate 24 口径静脉导管进入左股动脉, 作为体外循环回路的动脉输液线。
   6. 将17口径的多孔 angiocatheter 插入右颈内静脉, 并将其推进右心房和下腔静脉。不要用力推导管, 因为容器很容易折断。将导管连接到体外循环回路进行静脉引流。
   7. 用湿纱布覆盖每个空心区域以避免污染。

3. 体外循环期间的程序

1. 在体外循环期间, 将100% 氧气气体送到肺, 0.8 升/分, 将呼吸率降低到30周/分钟。动脉氧分压需要从200到 400 mmHg。
2. 在体外循环开始时, 将热垫的温度设置提高到最大值42摄氏度, 以减轻体外循环后体温的立即下降。当体温恢复到36摄氏度时, 将设定温度调整到37摄氏度。
3. 小心地启动体外循环流程, 密切关注水库中血液的体积。空的水库可能导致空气栓塞。如果储层中的血液体积减少, 通过调整工作台高度或改变引流导管的位置来降低泵流量。不要重新定位静脉引流导管, 这可能容易导致右心房穿孔和/或心律失常。
4. 增加并保持泵的流量为100毫升/千克/分钟, 而平均血压维持在 70 mmHg。当保持适当的血压时, 水库中至少有1毫升的小容积是可以接受的。如果水库中的血液少于1毫升, 则可能导致器官发生空气栓塞。
5. 如果血压不稳定, 增加2-3 毫升的启动方案的电路 (它可能导致贫血后, 体外循环)。

4. 体外循环后的程序

1. 钳住静脉引流管, 并将其从电路中取出。将血液中的剩余血逐渐注入动脉以维持血压。
2. 将呼吸率提高到70周/分钟。
3. 取出静脉引流导管和左动脉导管, 然后结扎近端和远端部位的血管。
4. 在体外循环结束后, 从右股动脉取出60分钟的动脉线。
5. 用生理盐水清洗伤口, 缝合伤口。
6. 检查动物的自发性呼吸, 结束麻醉, extubate 气管管。
7. 管理加热不育的等渗液, 并使用热垫和电热灯保持动物的温暖。经常检查动物的病情, 直到从麻醉中恢复。必要时提供呼吸支持。注意: 一旦动物开始走动, 热源应该从笼子的一部分移走, 让动物选择温暖或凉爽的一面。
8. 使动物远离其他动物的公司, 直到呼吸完全恢复。在完全恢复之前, 不要将动物退回公司。
9. 检查从麻醉恢复后的食物和水摄入量, 并提供适当的营养支持。管理止痛药, 检查是否有不适或疼痛的迹象。

结果

图 1显示整个 CPB 电路。该模型中的生理变量显示在图 2中, 包括直肠温度、平均动脉血压和心率。图 3显示了体外循环期间的动脉血气分析, 包括动脉氧的分压, 动脉二氧化碳的分压, 红细胞积血, 碱过量, 血清钾的表达, 氢的电位。在整个手术过程中, 心率和平均动脉压力是稳定的。由于吸血量引起的血液稀?...

讨论

在大鼠体外循环模型中, 体外循环后, 炎症细胞因子和 HMGB-1 的血清和肺表达水平是调节炎症反应的关键转录因子, 显著增加。以往的临床研究表明, 在心血管手术患者中, HMGB-1 水平的血清分泌增加了¹¹, 体外循环期间血清 HMGB-1 水平与更严重的全身炎症反应综合征有关。体外循环后肺氧合功能障碍¹²。此外, 血清 HMGB-1 水平是一种独立的生物标志物, 用于预测重症肺?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Ventilator 7025	Ugo Basile	7025	Ventilator
OxiQuant B	ENVITEC	46-00-0023	Oxygen Sensor
CMA 450 Temperature Controller	CMA	8003759	Temperature Controller
CMA 450 Heating Pad	CMA	8003763
CMA 450 Rectal Probe	CMA	8003761
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLAC06
Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLT0670
IX-214 Data Recorder	iWorx Systems	IWX-214	amplifier
LabScribe software	iWorx Systems		software
Roller pump	Furue Science	Model RP-VT	pump
Happy Cath	Medikit	EB 19G 4HCLs PP	17-gauge multiorifice angiocatheter
SURFLO ETFE I.V. Catheter	Terumo	SR-OX2419CA	24-gauge angiocatheter
Oxygenator	Mera	HPO-002
CPB circuit	Mera	custom-made
Hespander fluid solution	Fresenius Kabi	3319547A4035	Hydroxyethyl starch