Um modelo de recuperação de Bypass cardiopulmonar sem transfusão ou inotrópicos em ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever um modelo de recuperação simples extracorpórea sem transfusão ou inotrópicos em um rato. Este modelo permite o estudo de longo prazo várias sequelas de órgão de bypass cardiopulmonar.

Resumo

Extracorpórea (CEC) é indispensável em cirurgia cardiovascular. Apesar da dramático refinamento de técnica de CEC e dispositivos, órgãos várias complicações relacionadas à prolongada CPB ainda comprometer o resultado de cirurgias cardiovasculares e podem piorar mortalidade e morbidade pós-operatória. Modelos animais, recapitulando o uso clínico do CPB permitem o esclarecimento dos processos fisiopatológicos que ocorrem durante a CEC e facilitam estudos pré-clínicos para desenvolver estratégias de proteção contra estas complicações. Modelos do rato CPB são vantajosos por causa da sua maior relação custo-eficácia, processos experimentais convenientes, abundantes métodos de ensaio para a genética ou níveis de proteína e consistência genética. Eles podem ser usados para investigar a ativação do sistema imunológico e síntese de cytokines proinflammatory, ativação de elogio e produção de radicais livres de oxigênio. Os modelos do rato foram refinados e gradualmente tomaram o lugar dos modelos de animal-grande. Aqui, descrevemos um modelo simples de CEC sem transfusão e/ou inotrópicos em um rato. Esse modelo de recuperação permite que o estudo de longo prazo múltiplas sequelas de órgão do CPB.

Introdução

Em 1953, o Dr. John H. Gibbon Jr realizou com sucesso a primeira cirurgia cardíaca usando CPB¹, e posteriormente tornou-se uma modalidade essencial em cirurgia cardiovascular. Enquanto as técnicas e os dispositivos foram dramaticamente refinados, órgãos várias complicações relacionadas à CPB ainda comprometem o resultado de cirurgias cardiovasculares e podem afetar de morbidade e mortalidade pós-operatória². Danos nos órgãos relacionados ao CPB é causado pela ativação do sistema imunológico e síntese de cytokines proinflammatory, ativação de elogio e produção de radicais livres de oxigênio². Sua fisiopatologia, no entanto, não foi totalmente elucidada.

Modelos animais, recapitulando o uso clínico do CPB permitem o esclarecimento dos processos fisiopatológicos durante e após a CEC; Isto pode facilitar estudos pré-clínicos no desenvolvimento de estratégias para evitar estas complicações. Desde Popovic et al. relatada pela primeira vez um modelo do rato CPB em 1967³, rato CPB modelos foram refinados e gradualmente tomaram o lugar dos modelos de animal grande, devido ao maior custo-efetividade, processos experimentais convenientes e uma infinidade de métodos de teste genético e níveis de proteína. Além disso, ratos puras podem ser geneticamente idênticos, reduzindo possíveis enviesamentos biológicos.

Fabre et al. primeiro estabeleceu um modelo de recuperação que permitiu o estudo de longo prazo várias sequelas de órgão de CPB⁴. As vantagens deste modelo de sobrevivência simples são a flexibilidade (CPB fluxo e duração), condições vitais estáveis e reprodutibilidade em inflamações sistêmicas. Modelos do rato CPB tornaram-se cruciais para a investigação de estratégias terapêuticas que visam prevenir lesões de vários órgãos durante a CEC⁵, e recentemente foram desenvolvidos vários modelos para simular as situações clínicas durante a CEC. De Lange et al. desenvolveu um modelo de parada cardíaca, que pode ser usado para caracterizar as respostas enzimáticas, genéticas e histológicas relacionadas com lesão miocárdica⁷. Peters et al. arranjado o infarto do miocárdio e reperfusão controlada usando um modelo em miniatura do CPB para analisar a disfunção do coração através da isquemia focal e reperfusão lesão⁸. Jungwirth et al. primeiro estabeleceu um modelo de fundo circulatória hipotérmica (DHCA), que pode elucidar a lesão de isquemia e reperfusão global por DHCA e suporta potencial neuroprotetor estratégias⁶. Estudos utilizando DHCA investigam a influência da hipotermia, reperfusão, e/ou acionadas por hemólise sinalização eventos⁹. Hipotermia profunda pode afetar a ativação e inativação de várias enzimas e vias e os mecanismos permanecem desconhecidas¹⁰. Por outro lado, modelos de parada cardíaca ou modelos de isquemia do coração devem ser usados para investigar a isquemia e reperfusão lesão de coração. Esses vários modelos CPB rato que recapitular altamente humano CEC podem revelar processos patológicos relacionados à CEC e ajudar a atenuar as complicações relacionadas à CEC.

Este protocolo demonstra um modelo simples de CEC sem transfusão ou inotrópicos em um rato. Este modelo permite o estudo de longo prazo várias sequelas de órgão do CPB.

Protocolo

Antes do experimento, todos os ratos devem ser dada uma semana para se aclimatar. Devem efectuar-se de todos os procedimentos cirúrgicos em animais de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (www.nap.edu/catalog/5140.html) ou outras orientações éticas adequadas. Os protocolos devem ser aprovados pelo Comité de bem-estar animal na instituição apropriada antes de prosseguir. Todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados em condições assépticas.

1. preparar o circuito de CEC

Nota: Usar equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, óculos e um casaco limpo ou vestido descartável.

1. Instalação de circuito CEC
   1. Conecte os tubos de policloreto de vinila com um reservatório venoso, pré-concebidos para circuito de CEC e um oxigenador de membrana neonatal modificados conforme mostrado na Figura 1. Verifique todas as conexões estão apertadas e não vaza água.
   2. Defina um circuito de CEC para o dispositivo de bomba do rolo de acordo com os protocolos do fabricante.
   3. Mantenha a bomba de roletes sobre uma mesa regulável em altura e ajustar a altura da tabela 10 cm abaixo da mesa experimental.
2. Escorva do circuito de CEC
   1. Mix 12 mL de solução de amido hidroxietílico com 0,1 mL de heparina e 0,5 mL de solução de bicarbonato de sódio de 7% para aprontar o circuito de cec.
   2. Prime do circuito com 11 mL de solução de escorva, com o rolo de bomba girando suavemente. Colocar uma agulha de calibre 18 ventilação no reservatório de ar de ventilação.
   3. Atingido o oxigenador de membrana várias vezes para deair, com inclinação do oxigenador. Ar deve ser obscurecida completamente para evitar a embolia gasosa e oxigenação insuficiente. Durante a preparação do circuito, calor do circuito por uma lâmpada de calor elétrico definido sobre o reservatório.

2. procedimento antes CPB

Nota: O campo cirúrgico e dispositivos devem ser desinfectados por álcool 70% ou um composto de amónio quaternário antes do uso.

1. Anestesia e criação de animais
   1. Anestesia um rato com inalação de ar 3,0% de isoflurano misturado em um vaporizador. Definir o rato em um posto de trabalho e entubar uma cânula de calibre 16 para a traqueia. Siga suas orientações de cuidados de animais locais sobre analgesia dosagem e frequência (por exemplo
      buprenorfina 0,005 mg/kg s.c.)
      Nota: Os ratos devem ser em anestesia profunda e perder reflexos. A respiração deve ser rítmica, mas não ser presa.
   2. Transferi o rato para uma mesa de operação, equipada com uma almofada de aquecimento elétrico. Inicie a ventilação mecânica com 8 mL/kg de volume corrente, uma frequência respiratória de 70 ciclos/min e 30% da fração inspirada de oxigênio monitorada pelo sensor de oxigênio.
   3. Manter a anestesia com isoflurano 1,5-2,0% e com uma administração adicional de cetamina/xilazina na iniciação do CPB.
   4. Monitore a temperatura retal usando a sonda rectal. Manter normotérmico temperatura de 37 ° C, ajuste a temperatura da almofada do calor e colocando o circuito a lâmpada de calor.
   5. Definir o rato na posição supina e esticar os quatro membros, fixando com agulhas. Monitore a frequência cardíaca, definindo a agulha de eletrodo de ECG para o ombro bilateral e esquerda do abdômen. Coloque uma gaze úmida ou aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar ressecamento.
2. Canulação
   1. Após a desinfecção da superfície de todo o corpo por sprayingby pulverização etanol a 70% ou outra solução anti-séptica, raspe o cabelo por uma lâmina de barbear na região inguinal bilateral e região cervical direita. Anestésicos locais (como lidocaína) deve ser usados antes de fazer a incisão de pele. Nota: como alternativa, um matagal cirúrgica do local da incisão pode ser usada em vez de todo o corpo de spray de etanol a 70% para evitar uma queda na temperatura do corpo.
   2. Incise a pele (cerca de 5 mm) na região cervical direita e regiões inguinais bilaterais por tesouras e sem rodeios, dissecar os tecidos para expor a artéria femoral direita principal. Separe a artéria cuidadosamente a veia e o nervo nas proximidades. Ligam-se ao final da artéria femoral comum por 4-0 de seda e exposição pela tensão.
   3. Cortar a parede arterial (aproximadamente 1 mm) da artéria femoral direita comum por micro tesouras em direção perpendicular à artéria e cuidadosamente Canule um cateter de calibre 24 intravenosa da incisão a uma profundidade de 1 cm para monitoramento arterial sistêmica pressão e analisando a pressão parcial de gás no sangue arterial.
   4. Administra de sódio heparina (500 UI/kg) do cateter.
   5. Siga os passos 2.2.2 e 2.2.3 para Canule um cateter intravenoso de calibre 24 na artéria femoral comum esquerda como uma linha de infusão arterial para o circuito de cec.
   6. Insira um calibre 17 multi orifício angiocatheter na veia jugular interna direita e avançá-lo para o átrio direito e veia cava inferior (VCI). Não empurre o cateter mais ou menos como o vaso pode quebrar facilmente. Conecte o cateter ao circuito da CEC para drenagem venosa.
   7. Cobrir cada região canulado com uma gaze úmida para evitar a contaminação.

3. procedimento durante a CEC

1. Entregar o gás de oxigênio de 100% para o oxigenador em 0,8 L/min durante a CEC e diminuir a taxa respiratória de 30 ciclos/min. A pressão parcial arterial de oxigênio é necessária de 200 a 400 mmHg.
2. No início da CEC, aumente a temperatura do calor pad ao máximo, 42 ° c, para atenuar a queda imediata da temperatura do corpo após início da CEC. Ajustar a temperatura ambiente de 37 ° C, quando a temperatura do corpo voltar a 36 ° C.
3. Cuidadosamente, iniciar o fluxo do CPB e ficar de olho no volume de sangue no reservatório. Um reservatório vazio pode causar embolia gasosa. Se diminui o volume do sangue no reservatório, diminuir o fluxo da bomba ajustando a altura da tabela, ou alterando a posição do cateter de drenagem. Não re-Posicione o cateter de drenagem venosa, que pode facilmente causar perfuração do átrio direito e/ou arritmia.
4. Aumentar e manter o fluxo da bomba em 100 mL/kg/min, enquanto a pressão arterial média é mantida a 70 mmHg. Quando a pressão arterial adequada é mantida, um pequeno volume de pelo menos 1 mL no reservatório é aceitável. Se há menos de 1 mL de sangue no reservatório, pode causar uma embolia aérea em órgãos.
5. Se a pressão arterial é instável, adicione 2-3 mL da solução de escorva para o circuito (pode causar anemia após a CEC).

4. procedimento após a CEC

1. Fixar o tubo de drenagem venosa e removê-lo do circuito. Infundi o sangue restante no circuito gradualmente à artéria para manter a pressão arterial.
2. Aumente a taxa respiratória de 70 ciclos/min.
3. Remover o cateter de drenagem venosa e o cateter arterial esquerdo e, em seguida, ligam o navio no site proximal e distal.
4. Remova a linha arterial da artéria femoral direita 60 min após o término da CEC.
5. Limpar a ferida com soro fisiológico e feche a ferida com suturas.
6. Acaba com a anestesia e os tubos do tubo endotraqueal após verificar a respiração espontânea do animal.
7. Administrar fluidos isotônicos estéril aquecidos e usar um tapete de calor e lâmpada de aquecimento elétrico para aquecer os animais. Verifique as condições do animal frequentemente até a recuperação da anestesia. Fornece suporte respiratório quando necessário. Nota: Uma vez que o animal começa a se mover, a fonte de calor deve ser removida da parte da gaiola para permitir que o animal que escolher o lado quente ou frio.
8. Manter o animal além de companhia de outros animais até que recupere totalmente à respiração. Não retornam o animal para a empresa até recuperação completa.
9. Verificar a ingestão de alimentos e água após a recuperação da anestesia e fornecer suporte nutricional adequado. Administrar analgésicos e verificar se há sinais de desconforto ou dor.

Resultados

A Figura 1 mostra todo o circuito de cec. As variáveis fisiológicas neste modelo são mostradas na Figura 2e incluem a temperatura retal, significa a pressão arterial e frequência cardíaca. A Figura 3 mostra as análises de gás de sangue arterial durante a CEC, incluindo a pressão parcial de oxigênio arterial, pressão parcial de dióxido de carbono arterial, hematócrito, excesso de base, ex...

Discussão

Neste modelo de CEC de rato, os soro e pulmão níveis de expressão de citocinas inflamatórias e HMGB-1, um fator de transcrição chave regulamenta as respostas inflamatórias, aumentaram dramaticamente após a CEC. Estudos clínicos anteriores mostraram que a secreção de soro de nível HMGB-1 é elevada em pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular¹¹, e o pico do nível de HMGB-1 soro durante a CEC foi associado com a síndrome de resposta inflamatória sistêmica mais grave e deficiên...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Ventilator 7025	Ugo Basile	7025	Ventilator
OxiQuant B	ENVITEC	46-00-0023	Oxygen Sensor
CMA 450 Temperature Controller	CMA	8003759	Temperature Controller
CMA 450 Heating Pad	CMA	8003763
CMA 450 Rectal Probe	CMA	8003761
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLAC06
Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLT0670
IX-214 Data Recorder	iWorx Systems	IWX-214	amplifier
LabScribe software	iWorx Systems		software
Roller pump	Furue Science	Model RP-VT	pump
Happy Cath	Medikit	EB 19G 4HCLs PP	17-gauge multiorifice angiocatheter
SURFLO ETFE I.V. Catheter	Terumo	SR-OX2419CA	24-gauge angiocatheter
Oxygenator	Mera	HPO-002
CPB circuit	Mera	custom-made
Hespander fluid solution	Fresenius Kabi	3319547A4035	Hydroxyethyl starch