Un modelo de derivación cardiopulmonar de recuperación sin transfusión o agentes inotrópicos en ratas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para describir un modelo de recuperación simple puente cardiopulmonar sin transfusión o agentes inotrópicos en una rata. Este modelo permite el estudio de largo plazo múltiples secuelas órgano de puente cardiopulmonar.

Resumen

Puente cardiopulmonar (CPB) es indispensable en cirugía cardiovascular. A pesar del refinamiento espectacular técnica CPB y dispositivos, complicaciones del multi-órgano CPB relacionados con prolongada aún comprometer el resultado de cirugías cardiovasculares y pueden empeorar la mortalidad y la morbilidad postoperatoria. Modelos animales Recapitulando el uso clínico de CPB permiten la clarificación de los procesos fisiopatológicos que ocurren durante la CEC y facilitan los estudios preclínicos para desarrollar estrategias de protección contra estas complicaciones. Modelos CPB de rata son ventajosos debido a su mayor rentabilidad, convenientes procesos experimentales, métodos de prueba abundante en la genética o los niveles de proteínas y consistencia genética. Pueden ser utilizados para investigar la activación del sistema inmunológico y síntesis de citoquinas proinflamatorias, la activación del complemento y producción de radicales libres de oxígeno. Los modelos de rata se han refinado y poco a poco han tomado el lugar de los modelos de animal de gran tamaño. Aquí, describimos un modelo simple de CPB sin transfusión y/o agentes inotrópicos en una rata. Este modelo de recuperación permite el estudio de largo plazo múltiples secuelas órgano de CPB.

Introducción

En 1953, el Dr. John H. Gibbon Jr. realizó con éxito la primera cirugía cardíaca con CEC¹, y posteriormente se convirtió en una modalidad fundamental en cirugía cardiovascular. Mientras que los dispositivos y técnicas se han refinado notablemente, órganos de múltiples complicaciones relacionadas con el CPB aún comprometen el resultado de cirugías cardiovasculares y pueden afectar la morbilidad y la mortalidad postoperatoria². Daño a los órganos relacionados con el CPB es causada por la activación del sistema inmunológico y síntesis de citoquinas proinflamatorias, la activación del complemento y producción de radicales libres de oxígeno². Su Fisiopatología, sin embargo, ha no se ha aclarado completamente.

Modelos animales Recapitulando el uso clínico de CPB permiten la clarificación de los procesos fisiopatológicos durante y después de la CEC; Esto puede facilitar los estudios preclínicos en el desarrollo de estrategias para evitar estas complicaciones. Desde de Popovic et al. reportada por primera vez un modelo de rata CPB en 1967³, rata CPB modelos se han refinado y poco a poco han tomado el lugar de los modelos de animal de gran tamaño debido a una mayor rentabilidad, procesos experimentales convenientes y una plétora de pruebas de métodos en genética y niveles de proteína. Además, las ratas consanguíneas pueden ser genéticamente idénticas, reducir posibles sesgos biológicos.

Fabre et al. estableció por primera vez un modelo de recuperación que permitió el estudio de largo plazo múltiples secuelas órgano de CPB⁴. Las ventajas de este modelo de supervivencia simple son la flexibilidad (flujo CPB y duración), condición vital estable y reproducibilidad en la inflamación sistémica. Modelos CPB de rata se han convertido en cruciales para la investigación de estrategias terapéuticas que tienen como objetivo prevenir lesión multiorgánica durante CPB⁵, y recientemente se han desarrollado varios modelos para simular situaciones clínicas durante la CEC. De Lange et al. desarrollado un modelo de paro cardíaco, que puede utilizarse para caracterizar las respuestas enzimáticas, genéticas e histológicas relacionados con la lesión del miocardio⁷. Peters et al. arregló el infarto de miocardio y la reperfusión controlada usando un modelo miniatura de CPB para analizar la disfunción del corazón a través de la isquemia focal y lesiones de reperfusión⁸. Jungwirth et al. estableció por primera vez un modelo de la detención circulatoria hipotérmica profunda (DHCA), que puede aclarar la lesión de isquemia y reperfusión global DHCA y soportes potenciales neuroprotectores estrategias⁶. Estudios con DHCA investigan la influencia de la hipotermia, la reperfusión o hemólisis activa señalización de eventos⁹. Hipotermia profunda puede afectar la activación y la inactivación de varias enzimas y vías y los mecanismos siguen siendo desconocido¹⁰. Por otro lado, modelos de fallo cardiaco o corazón isquemia modelos deben utilizarse para investigar lesiones de isquemia y reperfusión corazón. Estos diversos modelos CPB de rata que recapitulan muy humano CPB pueden revelar procesos patológicos relacionados con la CPC y ayudar a mitigar las complicaciones relacionadas con el CPB.

Este protocolo muestra un modelo simple de CPB sin transfusión o agentes inotrópicos en una rata. Este modelo permite el estudio de largo plazo múltiples secuelas órgano de CPB.

Protocolo

Antes del experimento, todas las ratas deberían darse una semana para aclimatarse. Todos los procedimientos quirúrgicos a los animales deben llevará a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (www.nap.edu/catalog/5140.html) u otras normas éticas apropiadas. Protocolos deben ser aprobados por el Comité de bienestar de los animales en la institución correspondiente antes de proceder. Todos los procedimientos posteriores deberán realizarse bajo condiciones asépticas.

1. preparando el circuito de CEC

Nota: Use equipo de protección personal como guantes, gafas y una capa limpia o vestido disponible.

1. Configuración del circuito de CEC
   1. Conectar tubos de policloruro de vinilo con un reservorio venoso, prediseñado para el circuito de CEC y un oxigenador de membrana neonatal modificado como se muestra en la figura 1. Asegúrese de que todas las conexiones estén bien apretadas y no tener fugas de agua.
   2. Establecer un circuito de CEC en el dispositivo de la bomba de rodillo según los protocolos del fabricante.
   3. Mantener la bomba de rodillo sobre una mesa ajustable en altura y ajuste la altura de la mesa a 10 cm por debajo de la mesa experimental.
2. Cebado del circuito de CEC
   1. Mix 12 mL de solución de almidón hidroxietilo con 0,1 mL de heparina y 0,5 mL de solución de bicarbonato de sodio 7% para cebar el circuito de CEC.
   2. Cebar el circuito con 11 mL de la solución de cebado, con el rodillo de la bomba girando suavemente. Poner una aguja de calibre 18 ventilación en el depósito de aire de ventilación.
   3. Golpear el oxigenador de membrana varias veces para deair, con inclinación del oxigenador. Aire debe ser ocultado completamente para evitar la embolia de aire y oxigenación insuficiente. Durante el cebado del circuito, calentar el circuito por una lámpara de calor eléctrico en el depósito.

2. procedimiento antes de CPB

Nota: El campo quirúrgico y dispositivos deben ser desinfectados por alcohol al 70% o un compuesto de amonio cuaternario antes de su uso.

1. Anestesia y entorno animal
   1. Anestesiar una rata con la inhalación de aire mezclado de isoflurano de 3.0% en un vaporizador. La rata en un soporte de la obra e intubar una cánula del calibre 16 en la tráquea. Seguir sus pautas de cuidado de los animales locales con respecto a la dosis de analgesia y la frecuencia (p. ej.
      buprenorfina 0,005 mg/kg s.c.)
      Nota: Las ratas deben en anestesia profunda y pierde reflejos. La respiración debe ser rítmica pero no ser arrestada.
   2. Transferencia de la rata a una mesa de operaciones equipada con una almohadilla de calefacción eléctrica. Iniciar la ventilación mecánica con 8 mL/kg de volumen de marea, una frecuencia respiratoria de 70 ciclos/min y el 30% de fracción de oxígeno inspirado por el sensor de oxígeno.
   3. Mantener la anestesia con isoflurano de 1.5-2.0% y con un adicional de la administración de ketamina/xilacina en iniciación de CPB.
   4. Monitorear la temperatura rectal mediante el uso de la sonda rectal. Mantienen temperatura corporal normotérmico de 37 º C al ajustar la temperatura de la almohadilla de calor y colocando el circuito sobre la lámpara de calor.
   5. La rata en posición supina y las cuatro extremidades se extienden por la fijación con agujas. Monitorizar la frecuencia cardíaca situando la aguja electrodo de ECG al hombro bilateral y abdomen izquierdo. Coloque una gasa húmeda o aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad.
2. Canulación de la
   1. Después de desinfectar la superficie de todo el cuerpo por sprayingby rociar etanol al 70% u otra solución antiséptica, cepille el cabello por una navaja de afeitar en la región inguinal bilateral y región cervical de la derecha. Los anestésicos locales (como la lidocaína) se recomienda antes de realizar la incisión en la piel. Nota: como alternativa, un lavado quirúrgico del sitio de incisión puede ser utilizado en lugar de todo el cuerpo del aerosol de etanol al 70% para evitar una caída en la temperatura corporal.
   2. Haga una incisión en la piel (aproximadamente 5 mm) en la región cervical de la derecha y regiones inguinales bilaterales por tijeras y sin rodeos, disecar los tejidos para exponer la arteria femoral principal derecho. Separe cuidadosamente la arteria de la vena y el nervio cercano. Ligar el final de la arteria femoral común por exposición y seda 4-0 por la tensión.
   3. Cortar la pared arterial (aproximadamente 1 mm) de la arteria femoral común derecha por micro tijeras en dirección perpendicular a la arteria y cuidadosamente canule un catéter intravenoso calibre 24 desde la incisión hasta una profundidad de 1 cm para el monitoreo arterial sistémica presión y análisis de gas presión parcial en sangre arterial.
   4. Administrar heparina sódica (500 UI/kg) del catéter.
   5. Siga los pasos 2.2.2 y 2.2.3 para canule un catéter intravenoso calibre 24 en la arteria femoral común izquierda como una línea de infusión arterial del circuito de CEC.
   6. Inserte un angiocatéter de calibre 17 múltiples orificio de la vena yugular interna derecha y avanzar hacia la aurícula derecha y vena cava inferior (IVC). No empuje el catéter más o menos como el vaso se rompa. Conectar el catéter al circuito de CEC para drenaje venoso.
   7. Cubrir cada región canulado con una gasa húmeda para evitar la contaminación.

3. procedimiento durante la CEC

1. Gas de oxígeno 100% al oxigenador en 0,8 L/min durante la CEC y disminuir la frecuencia respiratoria a 30 ciclos/minuto. La presión parcial de oxígeno arterial se requiere de 200 a 400 mmHg.
2. Al principio del CPB, aumentar la temperatura de la almohadilla de calor a la máxima, 42 ° C, para mitigar la caída inmediata de la temperatura del cuerpo después de la iniciación de la CPB. Ajustar la temperatura a 37 º C cuando la temperatura corporal a 36 ° C.
3. Iniciar el flujo CPB y mantener un ojo en el volumen de la sangre en el reservorio. Un depósito vacío puede causar embolia de aire. Si disminuye el volumen de la sangre en el reservorio, bajar el caudal de la bomba por ajuste de la altura de la tabla, o cambiar la posición del catéter del drenaje. No vuelva a colocar el catéter de drenaje venoso, que puede causar la perforación de la aurícula derecha o arritmia.
4. Aumentar y mantener el flujo de la bomba a 100 mL/kg/min, mientras que la presión arterial media se mantiene a 70 mmHg. Cuando se mantiene la presión adecuada de la sangre, un pequeño volumen de al menos 1 mL en el tanque es aceptable. Si hay menos de 1 mL de la sangre en el reservorio, puede causar una embolia de aire en órganos.
5. Si la presión arterial es inestable, añadir 2-3 mL de la solución de cebado del circuito (puede causar anemia después de la CPB).

4. el procedimiento después de CPB

1. Sujete el tubo de drenaje venoso y retirarlo del circuito. Infundir la sangre restante en el circuito poco a poco a la arteria para mantener la presión arterial.
2. Aumentar la frecuencia respiratoria a 70 ciclos/minuto.
3. Retirar el catéter de drenaje venoso y el catéter arterial izquierdo y ligar el vaso en el sitio proximal y distal.
4. Quite la línea arterial de la arteria femoral derecha 60 min después del final del CPB.
5. Limpiar la herida con solución salina y cerrar la herida con suturas.
6. Acabar con la anestesia y extubar el tubo endotraqueal después de comprobar la respiración espontánea del animal.
7. Administrar líquidos isotónicas estériles calentadas y use una lámpara de calor eléctrico y estera de calor para mantener los animales calientes. Compruebe las condiciones de los animales con frecuencia hasta la recuperación de la anestesia. Proporcionar asistencia respiratoria cuando sea necesario. Nota: Una vez que el animal comienza a moverse, la fuente de calor debe eliminarse de la parte de la jaula para permitir que el animal elija el lado cálido o fresco.
8. Que el animal aparte de la compañía de otros animales hasta que la respiración se recupera completamente. No devolver el animal a la compañía hasta la recuperación completa.
9. Controlar la ingesta de alimentos y agua después de la recuperación de la anestesia y proporcionar un apoyo nutricional apropiado. Administrar analgésicos y verificar si hay signos de incomodidad o dolor.

Resultados

La figura 1 muestra el circuito completo de CPB. Las variables fisiológicas en este modelo se muestran en la figura 2e incluyen temperatura rectal, significan la presión arterial y frecuencia cardiaca. La figura 3 muestra el análisis del gas de sangre arterial durante la CEC, incluyendo la presión parcial de oxígeno arterial, presión parcial de dióxido de carbono arterial, hematocrito, exceso ...

Discusión

En este modelo CPB de rata, el suero y pulmón niveles de expresión de citoquinas inflamatorias y HMGB-1, un factor de transcripción clave regular las respuestas inflamatorias, aumentaron después de CPB. Anteriores estudios clínicos demostraron que la secreción de suero de nivel HMGB-1 está elevada en pacientes sometidos a cirugía cardiovascular¹¹, y el nivel máximo del suero HMGB-1 durante la CEC se asoció con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica más grave y el deterioro de la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Ventilator 7025	Ugo Basile	7025	Ventilator
OxiQuant B	ENVITEC	46-00-0023	Oxygen Sensor
CMA 450 Temperature Controller	CMA	8003759	Temperature Controller
CMA 450 Heating Pad	CMA	8003763
CMA 450 Rectal Probe	CMA	8003761
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLAC06
Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLT0670
IX-214 Data Recorder	iWorx Systems	IWX-214	amplifier
LabScribe software	iWorx Systems		software
Roller pump	Furue Science	Model RP-VT	pump
Happy Cath	Medikit	EB 19G 4HCLs PP	17-gauge multiorifice angiocatheter
SURFLO ETFE I.V. Catheter	Terumo	SR-OX2419CA	24-gauge angiocatheter
Oxygenator	Mera	HPO-002
CPB circuit	Mera	custom-made
Hespander fluid solution	Fresenius Kabi	3319547A4035	Hydroxyethyl starch