Un modello di esclusione cardiopolmonare di recupero senza trasfusione o agenti inotropi in ratti

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere un modello di recupero semplice bypass cardiopolmonare senza trasfusione o agenti inotropi in un ratto. Questo modello permette lo studio di lungo termine le conseguenze dell'esclusione cardiopolmonare multiple-organo.

Abstract

Esclusione cardiopolmonare (CPB) è indispensabile in chirurgia cardiovascolare. Nonostante la drammatica raffinatezza della tecnica di CPB e dispositivi, le complicazioni del multi-organo CPB correlati alla prolungata ancora compromettere il risultato di interventi chirurgici cardiovascolari e può peggiorare la mortalità e la morbosità postoperatoria. Modelli animali ricapitolare l'uso clinico di CPB consentono il chiarimento dei processi fisiopatologici che si verificano durante CPB e facilitano studi pre-clinici per sviluppare strategie di protezione contro queste complicazioni. Modelli del ratto CPB sono vantaggiose a causa della loro maggiore economicità, convenienti processi sperimentali, metodi di prova abbondante presso la genetica o i livelli della proteina e consistenza genetica. Sono utilizzabili per indagare l'attivazione del sistema immunitario e la sintesi di citochine proinfiammatorie, complimento attivazione e produzione di radicali liberi dell'ossigeno. I modelli di ratto sono stati raffinati e hanno gradualmente preso il posto dei modelli animale di grandi dimensioni. Qui, descriviamo un semplice modello CPB senza trasfusione e/o agenti inotropi in un ratto. Questo modello di recupero permette lo studio di lungo termine più sequele di organo di CPB.

Introduzione

Nel 1953, Dr. John H. Gibbon Jr. ha effettuato con successo il primo ambulatorio cardiaco utilizzando CPB¹, e divenne in seguito una modalità essenziale in chirurgia cardiovascolare. Mentre le tecniche e i dispositivi sono stati drammaticamente raffinati, multi-organo complicazioni legate alla CPB ancora compromettono il risultato di interventi chirurgici cardiovascolari e possono influenzare la morbilità e la mortalità postoperatoria². Danno d'organo relativi CPB è causato da attivazione del sistema immunitario e la sintesi di citochine proinfiammatorie, complimento attivazione e produzione di radicali liberi di ossigeno². La relativa patofisiologia, tuttavia, completamente non è stato delucidato.

Modelli animali ricapitolare l'uso clinico di CPB abilitare la chiarificazione dei processi patofisiologici durante e dopo CPB; Questo può facilitare studi pre-clinici nello sviluppo di strategie per evitare queste complicazioni. Dal Popovic et al. in primo luogo segnalato un modello di ratto CPB nel 1967³, ratto CPB modelli sono state perfezionate e hanno gradualmente preso il posto dei modelli animale di grandi dimensioni a causa di una maggiore economicità, convenienti processi sperimentali e una pletora di metodi di test genetici e livelli della proteina. Inoltre, ratti innati possono essere geneticamente identici, riducendo possibili pregiudizi biologici.

Fabre et al. in primo luogo stabilito un modello di recupero che ha permesso lo studio di lungo termine più sequele di organo di CPB⁴. I vantaggi di questo modello di semplice sopravvivenza sono la flessibilità (CPB portata e durata), stabile condizione vitale e riproducibilità nella infiammazione sistemica. Modelli del ratto CPB sono diventati cruciali per lo studio di strategie terapeutiche che mirano a prevenire lesioni multi-organo durante CPB⁵, e recentemente sono stati sviluppati vari modelli per la simulazione di situazioni cliniche durante CPB. De Lange et al. sviluppato un modello di arresto cardiaco, che può essere utilizzato per caratterizzare le risposte enzimatiche, genetiche ed istologiche legate alla lesione del miocardio⁷. Peters et al. ha organizzato l'infarto miocardico e reperfusion controllato utilizzando un modello CPB miniaturizzato per analizzare la disfunzione del cuore attraverso la focale di ischemia e riperfusione pregiudizio⁸. Jungwirth et al. in primo luogo stabilito un modello di arresto circolatorio ipotermico profondo (DHCA), che può delucidare la ferita di ischemia e riperfusione globale di DHCA e supporti potenziale neuroprotective strategie⁶. Gli studi che utilizzano DHCA studiare l'influenza di ipotermia, riperfusione, e/o emolisi-innescato segnalazione eventi⁹. L'ipotermia profonda può influenzare l'attivazione e inattivazione di enzimi diversi e le vie e i meccanismi rimangono sconosciuti¹⁰. D'altra parte, modelli di arresto cardiaco o modelli di ischemia del cuore devono essere utilizzati per indagare la lesione cardiaca ischemia e riperfusione. Questi diversi modelli CPB ratto che ricapitolano altamente CPB umano possono rivelare processi patologici correlati a CPB e ridurre il rischio complicanze CPB.

Questo protocollo viene illustrato un semplice modello CPB senza trasfusione o agenti inotropi in un ratto. Questo modello consente lo studio di lungo termine più sequele di organo di CPB.

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Protocollo

Prima dell'esperimento, tutti i ratti dovrebbero essere dato una settimana di acclimatare. Tutte le procedure chirurgiche su animali devono avvenire in conformità con la guida per la cura e uso di animali da laboratorio (www.nap.edu/catalog/5140.html) o altri orientamenti etici appropriati. Protocolli dovrebbero essere approvati dal comitato di benessere degli animali presso l'istituzione appropriata prima di procedere. Tutte le successive procedure devono essere eseguite in condizioni asettiche.

1. preparazione CPB circuito

Nota: Indossare indumenti protettivi, compresi guanti, occhiali e un cappotto pulito o un abito USA e getta.

1. Set-up del circuito CPB
   1. Collegare i tubi di cloruro di polivinile con un serbatoio venoso, predefinito per il circuito CPB e un ossigenatore a membrana neonatale modificate come mostrato in Figura 1. Garantire tutti i collegamenti siano ben stretti e non una perdita di acqua.
   2. Impostare un circuito CPB per il dispositivo di pompa a rulli secondo i protocolli del produttore.
   3. Tenere la pompa roller su un tavolo regolabile in altezza e regolare l'altezza del tavolo a 10 cm sotto la scrivania sperimentale.
2. Innesco del circuito CPB
   1. Mix 12 mL di soluzione di amido idrossietilico con 0,1 mL di eparina e 0,5 mL di soluzione di bicarbonato di sodio del 7% per l'innesco circuito CPB.
   2. Caricare il circuito con 11 mL della soluzione di adescamento, con il rullo di pompa delicatamente rotante. Inserire un ago di calibro 18 ventilazione il serbatoio per l'aria di ventilazione.
   3. Colpito più volte l'ossigenatore a membrana a deair, con inclinazione l'ossigenatore. Aria deve essere oscurata completamente per evitare l'embolia gassosa e l'ossigenazione insufficiente. Durante l'innesco del circuito, riscaldare il circuito di una lampada di calore elettrico impostare sul serbatoio.

2. la procedura prima di CPB

Nota: Il campo chirurgico e dispositivi devono essere disinfettate con alcol al 70% o un ammonio quaternario prima dell'uso.

1. Anestesia e impostazione degli animali
   1. Anestetizzare un ratto con inalazione del 3,0% isoflurane-misto aria in un vaporizzatore. Impostare il topo su un banco da lavoro e intubare una cannula di calibro 16 nella trachea. Seguire le vostre linee guida locale cura degli animali per quanto riguarda l'analgesia dosaggio e frequenza (ad es.
      buprenorfina 0,005 mg/kg s.c.)
      Nota: Ratti devono essere presso l'anestesia profonda e perdere i riflessi. La respirazione deve essere ritmica, ma non essere arrestata.
   2. Trasferire il ratto un tavolo operatorio con un rilievo di riscaldamento elettrico. Iniziare la ventilazione meccanica con 8 mL/kg di volume corrente, un ritmo respiratorio di 70 cicli/min e il 30% della frazione di ossigeno inspirato monitorati dal sensore dell'ossigeno.
   3. Mantenere l'anestesia con isoflurano 1.5-2.0% e con una somministrazione supplementare di chetamina/xilazina all'inizio di CPB.
   4. Monitorare la temperatura rettale utilizzando la sonda rettale. Mantenere la temperatura corporea normotermica di 37 ° C Regolazione della temperatura del pad termico e inserendo il circuito sopra la lampada di calore.
   5. Impostare il ratto in posizione supina e tratto quattro membra fissando con aghi. Monitorare la frequenza cardiaca impostando l'ago elettrodo ECG alla spalla bilaterale e sinistra dell'addome. Posizionare una garza umida o applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza.
2. Inserimento di una canula
   1. Dopo la disinfezione la superficie di tutto il corpo di sprayingby di spruzzatura etanolo al 70% o un'altra soluzione antisettica, radersi i capelli da un rasoio sulla regione inguinale bilaterale e regione cervicale di destra. Anestetici locali (quali lidocaina) deve essere utilizzati prima di effettuare l'incisione cutanea. Nota: come un'alternativa, uno scrub chirurgico del sito di incisione può essere utilizzata invece di tutto il corpo spray di etanolo al 70% per evitare un calo di temperatura corporea.
   2. Incidere la pelle (circa 5 mm) presso le regioni inguinale bilaterale e la regione cervicale di destra di forbici e senza mezzi termini sezionare i tessuti per esporre il proprio principale dell'arteria femorale. Separare l'arteria attentamente dalla vena e nervo nelle vicinanze. Legare all'estremità dell'arteria femorale comune di seta dall'esposizione e 4-0 dalla tensione.
   3. Tagliare la parete arteriosa (circa 1mm) dell'arteria femorale comune di destra da micro-forbici in direzione perpendicolare all'arteria e attentamente incannulare un catetere endovenoso 24-calibro dall'incisione ad una profondità di 1 cm per monitoraggio arterioso sistemico pressione e analisi della pressione parziale di gas nel sangue arterioso.
   4. Amministrare eparina sodica (500 UI/kg) dal catetere.
   5. Seguire i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 a incannulare un catetere endovenoso 24-calibro in arteria femorale comune di sinistra come una linea di infusione arteriosa per il circuito CPB.
   6. Inserire un angiocatheter multi-orifizio 17 calibri nella vena giugulare interna destra e farlo avanzare nell'atrio destro e vena cava inferiore (IVC). Non spingere il catetere più o meno come il vaso può rompere facilmente. Collegare il catetere al circuito CPB per drenaggio venoso.
   7. Coprire ogni regione cannulate con una garza umida per evitare la contaminazione.

3. procedura durante CPB

1. Fornire il 100% ossigeno gas per l'ossigenatore a 0,8 L/min durante CPB e diminuzione della frequenza respiratoria a 30 cicli/min. La pressione parziale dell'ossigeno arterioso è necessaria da 200 a 400 mmHg.
2. All'inizio di CPB, aumentare l'impostazione di temperatura del calore pad per la massima, 42 ° C, per attenuare l'immediato calo della temperatura corporea dopo l'inizio di CPB. Regolare l'impostazione della temperatura a 37 ° C quando la temperatura corporea ritorna a 36 ° C.
3. Attentamente, iniziare il flusso CPB e tenere d'occhio il volume del sangue nel serbatoio. Un serbatoio vuoto può causare embolia gassosa. Se il volume del sangue nel serbatoio diminuisce, abbassare il flusso della pompa regolando l'altezza della tabella, o cambiando la posizione del catetere di drenaggio. Non riposizionare il catetere di drenaggio venoso, che potrebbe facilmente causare la perforazione dell'atrio di destra e/o aritmia.
4. Aumentare e mantenere il flusso della pompa a 100 mL/kg/min, mentre la pressione sanguigna media è mantenuta a 70 mmHg. Quando la pressione sanguigna appropriata viene mantenuta, un piccolo volume di almeno 1 mL nel serbatoio è accettabile. Se c'è meno di 1 mL di sangue nel serbatoio, può causare un'embolia in organi.
5. Se la pressione sanguigna è instabile, è possibile aggiungere 2-3 mL della soluzione di innesco del circuito (può causare l'anemia dopo il CPB).

4. procedura dopo CPB

1. Fissare il tubo di drenaggio venoso e rimuoverlo dal circuito. Infondere il sangue rimanente nel circuito gradualmente all'arteria per mantenere la pressione sanguigna.
2. Aumento della frequenza respiratoria a 70 cicli/min.
3. Rimuovere il catetere di drenaggio venoso e il catetere arterioso sinistro, poi legare la nave nel sito prossimale e distale.
4. Rimuovere la linea arteriosa dall'arteria femorale destra 60 min dopo la fine del CPB.
5. Pulire ogni ferita con soluzione fisiologica e chiudere la ferita con punti di sutura.
6. Terminare l'anestesia ed Estubare il tubo endotracheale dopo aver controllato la respirazione spontanea dell'animale.
7. Somministrare fluidi isotoniche sterile riscaldati e utilizzare un calore mat e la lampada di calore elettrico per tenere caldi gli animali. Verificare le condizioni dell'animale frequentemente fino al recupero dall'anestesia. Fornire supporto respiratorio quando richiesto. Nota: Una volta che l'animale comincia a muoversi, la fonte di calore deve essere rimosso da parte della gabbia per permettere all'animale di scegliere il lato caldo o freddo.
8. Tenere l'animale a parte la compagnia di altri animali fino a quando la respirazione riacquista completamente. Non restituire l'animale alla società fino al completo recupero.
9. Controllare l'assunzione di cibo e acqua dopo il recupero dall'anestesia e fornire un adeguato supporto nutrizionale. Somministrare analgesici e verificare eventuali segni di disagio o dolore.

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Risultati

La figura 1 Mostra l'intero circuito CPB. Le variabili fisiologiche in questo modello sono illustrate nella Figura 2e comprendono la temperatura rettale, dire la pressione arteriosa e frequenza cardiaca. La figura 3 Mostra l'analisi di gas del sangue arterioso durante CPB, tra cui la pressione parziale dell'ossigeno arterioso, la pressione parziale di anidride carbonica arteriosa, ematocrito, l'ecces...

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Discussione

In questo modello CPB del ratto, del polmone e del siero i livelli di espressione di citochine infiammatorie e HMGB-1, un fattore di trascrizione che regolano le risposte infiammatorie, drammaticamente aumentata dopo CPB. Precedenti studi clinici hanno mostrato che la secrezione di siero di HMGB-1 livello è elevata nei pazienti sottoposti a chirurgia cardiovascolare¹¹, e il livello di picco del siero HMGB-1 durante CPB è stato associato con la sindrome infiammatoria sistematica di risposta più ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Ventilator 7025	Ugo Basile	7025	Ventilator
OxiQuant B	ENVITEC	46-00-0023	Oxygen Sensor
CMA 450 Temperature Controller	CMA	8003759	Temperature Controller
CMA 450 Heating Pad	CMA	8003763
CMA 450 Rectal Probe	CMA	8003761
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLAC06
Disposable BP Transducer	ADInstruments	MLT0670
IX-214 Data Recorder	iWorx Systems	IWX-214	amplifier
LabScribe software	iWorx Systems		software
Roller pump	Furue Science	Model RP-VT	pump
Happy Cath	Medikit	EB 19G 4HCLs PP	17-gauge multiorifice angiocatheter
SURFLO ETFE I.V. Catheter	Terumo	SR-OX2419CA	24-gauge angiocatheter
Oxygenator	Mera	HPO-002
CPB circuit	Mera	custom-made
Hespander fluid solution	Fresenius Kabi	3319547A4035	Hydroxyethyl starch