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  • 引言
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摘要

在本文中, 我们演示了使用自定义微流控装置的单个蠕虫的实时成像。在该装置中, 多个蠕虫单独局限于单独的分庭, 允许多路纵向监测各种生物过程。

摘要

在过去十年中, 微流控技术已被应用于研究小动物, 包括线虫秀丽线虫, 并证明是有用的, 作为一个方便的实时成像平台提供能力, 精确控制实验条件的实时性。在本文中, 我们演示了使用 WormSpa, 以前发布的自定义微流控装置的单个蠕虫的实时成像。在该装置中, 多个蠕虫单独局限于单独的分庭, 允许多路纵向监测各种生物过程。为了说明这种能力, 我们进行了实验验证, 其中蠕虫感染了致病细菌, 并连续监测免疫应答基因和产卵的表达动态动物。该设备的简单设计和操作使其适合于以往没有经验的微流控实验的用户。我们建议, 这种方法将是有益的, 许多研究人员感兴趣的纵向观察生物过程在明确的条件下。

引言

环境条件的变化可能导致基因程序的激活, 同时诱导和抑制特定基因的表达1,2。这些动态变化可能是不同的组织之间的相同的动物和动物之间。因此, 对这种基因计划的研究要求采用允许对个别动物进行纵向成像的方法, 并提供精确的动态控制环境条件。

近年来, microfabricated 射流装置已被用来研究小动物的反应和行为的许多方面, 包括蠕虫, 苍蝇, 水熊和更多的3,4,5,6, 7。例如, 应用包括深分型、optogenetic 记录神经元活动以响应化学刺激和跟踪马达行为, 如运动和泵浦 8, 9, 10,11。

基于微流控的方法拥有许多性能, 可以帮助对环境线索的长期纵向成像, 包括对局部微环境的精确动态控制, 灵活的设计, 使维护单独的动物在分开的处所和有利属性为成像。然而, 在微流控腔中维持动物很长一段时间, 对他们的良好生命有最小的不利影响是一个挑战, 这需要特别小心的设计, 微流控装置和在执行实验。

在这里, 我们演示了使用 WormSpa, 一个微流控装置的纵向成像的秀丽线虫。5单个蠕虫被限制在腔室中。恒定的低流量的液体和细菌悬浮, 保证蠕虫是良好的喂养和足够活跃, 以保持良好的健康和缓解压力, 和结构的商会允许蠕虫产卵。WormSpa 的设计和操作的简单性应该允许研究人员没有在微流体的经验, 把这一装置纳入他们自己的研究计划。

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研究方案

下面的协议使用 WormSpa5, 以前描述的微流控器用于对蠕虫进行纵向成像。WormSpa 的制作 (从 CAD 文件开始, 可以根据要求从作者获得) 是简单的, 但需要一些专门知识。在大多数情况下, 制造可以很容易地由核心设施或提供此类服务的商业公司完成。在制作设备时, 请确保指定特征的高度为50µm。

1. 实验设置

  1. 将微流控装置安装在具有机动化阶段的倒置荧光显微镜上。
  2. 将一个轨道振动筛靠近显微镜, 但要确保振动筛的振动不会直接影响显微镜。例如, 将振动筛放在固定在墙上的搁板上, 使其与光学表没有接触。
  3. 将注射器泵放在轨道振动筛上。将泵带到振动筛上, 使其在晃动时不摇晃。

2. 微流控环境的制备

注: 在实验中, 四注射器通过注射器管连接到微流控装置, 如图 1所述。这一步描述了这些注射器的制备。除非另有提及, 保持注射器管尽可能短, 而不使其绷紧。

  1. 准备一个出口注射器和一个注射器管。此注射器 (图 1中的 S1) 稍后将通过注射器管连接到设备的出口, 并用于临时存储从设备中流出的液体。
    1. 通过去除20克 x 1/2 英寸注射器尖端的塑料部件来制作适配器针, 只保留针 (金属部分)。这样做, 通过持有的塑料和金属的部分钳子和拉他们分开。针上残留的塑料残渣可以用本生燃烧器烧掉。
    2. 根据实验装置的几何形状弯曲针头, 同时用钳子握住两端。在这里描述的设计中, 弯曲的针在它的中间到一个角度的〜110°是最方便的。
    3. 将适配器针插入到管子的一半。另一半稍后将插入设备。注射器管应与20克无泄漏的注射器尖端兼容 (例如, 油管内径为0.86 毫米, 外径为1.32 毫米)。推荐的管长为50厘米。
    4. 通过20克 x 1/2 英寸的注射器尖, 将10毫升鲁尔锁注射器连接到注射器管的另一端 (打开) 端。
  2. 准备缓冲入口注射器和注射器管。其中一个注射器 (在图 1中的 S2) 被用作进入设备并控制注入流的流体的蓄水池。另一个注射器 (图 1中的 S3) 是缓冲区交换所必需的, 如步骤3.2 所述。
    1. 将10毫升鲁尔锁注射器 (S2) 直接连接到3通阀, 并通过注射器管将另一注射器 (S3) 连接到同一阀门上 (图 1): 通过注射器尖端连接 S3 到管, 并通过另一个注射器提示连接到阀门的管。
      注: 这些材料的连接顺序无关紧要。
    2. 将注射器管连接到3路阀门的剩余端口。在步骤2.1.2 中准备另一个适配器针, 并将针插入到注射器管的另一端 (打开) 端。
    3. 设置阀门, 使步骤2.2.2 和 S2 中的注射器管在 S3 关闭时连接 (图 1)。
  3. 准备一个蠕虫入口注射器和一个注射器管。此注射器 (图 1中的 S4) 用于将蠕虫加载到设备中。
    1. 连接一个长的注射器管到一个10毫升鲁尔锁注射器 (S4)。从将用于装货的液体体积中确定该管的长度;例如, 100 厘米的油管支持超过2毫升的液体 (也见步骤 4.2)。
    2. 在步骤2.1.2 中准备另一个适配器针, 并将一针的一半插入注射器管的另一端 (打开) 端。
  4. 用 s-介质12冲洗所有注射器和油管两次。用 s-介质填充注射器和管子, 注意去除所有气泡。
  5. 将插座注射器管连接至设备插座。
    1. 将注射器管末端的适配器针插入插座端口。
    2. 通过插座注入少量的 s-介质, 以填满设备, 直到从缓冲入口和蠕虫入口中取出一点 s-介质。
  6. 将缓冲入口注射器管连接到设备的缓冲入口端口, 同时用一个销 (不锈钢定位销, 直径为1/32 英寸) 堵塞蜗杆入口。
  7. 向设备中注入恒定的缓冲区流。将缓冲入口注射器 S2 到注射器泵上13, 并设置泵, 使 S2 中的介质连续注入到设备中, 流速为3µL/分钟。

3. 将细菌装入微流控装置

  1. 准备大肠杆菌 OP50 悬浮在 s-中等的 12中。
    1. 按照标准的协议, 接种一个250毫升瓶与50毫升磅和一个单一的殖民地, 并孵化过夜37摄氏度。
    2. 离心机的隔夜文化在 4000 rpm 10 分钟, 并并用重悬颗粒在30毫升的 s-培养基。
    3. 通过5µm 注射器过滤器过滤悬浮液。以 600 nm (od600) 的光学密度测量细菌浓度, 并将浓度调整为 OD600 3。这种高密度是为了保持蠕虫的良好喂养。
  2. 将设备中的缓冲区与 OP50 暂停交换。
    1. 准备一个干净的注射器 (S5), 填充 OP50 悬浮液。垂直地按住注射器, 多次敲击, 收集顶部的气泡。
    2. 打开缓冲入口注射器的3路阀, 关闭与设备的连接, 并连接两个注射器、S2 和 S3。从注射器泵中脱离 S2。
    3. 从阀门上拔下 S2 并将 S5 连接至阀门。把所有在 S5 顶部收集的空气推到 S3 通过阀门, 直到 OP50 的缓冲区进入 S3。在这样做的时候, 确保没有气泡留在 S5 或阀门。
    4. 将3路阀门恢复到原来的位置, 以关闭 S3 和 S5 之间的连接, 并将 S5 连接到设备。将 S5 加载到注射器泵上。打开支撑泵的轨道振动筛。将震动速度设置为大约 200 rpm。
    5. 将流量设置为100µL/分钟。新缓冲区到达设备中的蠕虫所需的时间取决于缓冲入口注射器管的长度 (大约5分钟, 上面描述的油管)。如果需要更快的缓冲交换, 则可以使用更高的流量。
    6. 一旦 OP50 缓冲区在整个设备中传播, 将流速率设置回3µL/分钟。

4. 将蠕虫装入微流控装置

  1. 准备一个小的低结合离心管 (650 µL), 并填补它与100µL OP50 悬浮。转移大约 20-30 年龄同步的年轻成人蠕虫 (46 小时后 L1 幼虫拘捕在25°c) 从 NGM (线虫生长培养基) 琼脂板到管通过采摘他们一个与蠕虫采摘。可以在标准协议12之后执行年龄同步。
  2. 用 OP50 悬浮液填充蠕虫入口注射器和注射器管 (在图 1中的 S4)。将500µL 的液体注入离心管中。用蠕虫将悬浮液抽出到蠕虫入口注射器管中。请确保注射器管足够长 (> 1 米), 并使被拉的蠕虫留在注射器管, 并没有使所有的方式对注射器 S4。
  3. 将 S4 连接到蠕虫入口。将蠕虫入口注射器管中的所有蠕虫注入微流控装置。拔下 S4 和注射器管。用大头针将蠕虫入口堵塞。
  4. 从机械泵 (图 1) 中松开缓冲入口注射器 S2, 并手动控制 S1 和 S2, 将所有蠕虫推入不同的通道。按下 S2 将蠕虫移动到通道中, 而按下 S1 将移动它们的反向方向。一旦加载了通道, 每个通道中的蠕虫就会阻止其他蠕虫的进入。
  5. 让蠕虫适应新的环境 2-3 小时。

5. 建立成像协议

  1. 查找安全位于设备中的所有蠕虫, 并在控制您的显微镜的图像采集软件中为它们各自设置一个成像位置。请注意, 在某些情况下 (例如当需要更高的放大倍数时, 或者在使用较小的 CCD 传感器的摄像机时), 每个通道都需要多个成像位置。
    注意: 虽然可以手动完成此操作, 但某些购置软件包可以加载一个文本文件, 其中列出了应该拍摄图像的位置。由于这些位置是在 WormSpa 中定期订购的, 因此用户可以编写一个小的脚本 (例如Python 或商业软件中的) 来自动创建这样的列表。此脚本的精确格式取决于购置软件所需的文件格式 (请参见辅助材料 1中的示例)。
  2. 设置所需的延时成像频率。例如, 对感染的免疫基因反应的成像是以每帧10分钟的频率进行的。确保所有必要的通道 (例如明亮字段和 GFP 荧光) 都在每个时间点获得。

6. 寄主对铜绿假单胞菌感染的反应

注意: 这一步是专门研究寄主-病原体相互作用的。或者, 你可以准备一个缓冲区, 其中包含其他感兴趣的环境提示 (生物和非物质的压力源, 药物, 信号分子,等等)。

  1. 准备铜绿假单胞菌 PA14 悬浮在 SK 中14中。
    1. 接种一个250毫升的烧瓶, 50 毫升磅和一个单一的殖民地, 并孵化过夜37摄氏度。
    2. 接种另一250毫升的烧瓶, 50 毫升磅和整除的文化, 并在37摄氏度一夜之间孵化。
    3. 离心机的隔夜文化在 4000 rpm 10 分钟, 并并用重悬颗粒在10毫升的 SK 培养基。测量细菌浓度并将浓度调整为 OD600 = 4。
    4. 将悬浮液转移到干净的瓶子上, 在37摄氏度时孵育24小时, 在25摄氏度时晃动24小时。这一步模仿标准杀戮化验中的板块孵化步骤14。
    5. 通过5µm 注射器过滤器过滤悬浮液。这是为了防止细菌聚集堵塞设备。
  2. 按照与步骤3.2 相同的步骤, 将设备中的 OP50 悬浮液替换为 PA14 悬架。保持成像10小时。

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结果

年龄同步的年轻成人蠕虫 (46 小时后 L1 幼虫拘捕在25°c)12已加载到设备中, 如协议中所述。蠕虫单独位于单独的渠道, 使动物对病原体的反应进行纵向测量。当实验成功时, 大多数蠕虫在实验期间仍留在其通道中。在这种情况下, 单个蠕虫的图像只是通过将其通道放置在成像路径中, 从而避免了主动定位该动物的需要。图 2A

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讨论

微流控工具为研究蠕虫提供了多种好处。与标准的 NGM 琼脂平板相比, 在一台聚甲基硅器件中成像具有更高的成像质量。多个图像可以从一个单一的蠕虫, 与传统的方法, 在这些动物是从板块采摘和安装在显微镜幻灯片的成像。此外, 蠕虫所驻留的微环境可以保持恒定或根据需要进行调制, 允许在环境的构成和动物的反应之间进行精确的映射。

在这里, 我们演示了如何通过一个自...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了国家科学基金会的支持, 通过赠款 PHY-1205494 和 MCB-1413134 (EL) 和韩国国家研究基金会 2017R1D1A1B03035671 (库特勒)。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
WormSpaN/AN/AThe CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound MicroscopeZeissAxioObserver Z1An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE-501
TubingSCI Scientific Commodities Inc.BB31695-PE/50.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe TipCMLsupply901-20-05020 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe FilterPALL4650Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
SyringeQosinaC330710 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way ValveColeParmerFF-30600-23Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel PinMcMaster-Carr90145A31718-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge TubeCorningCL S32060.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube

参考文献

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