꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

요약

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

초록

지난 10 년간에서 미세 꼬마 선 충, 선 충 류 등 작은 동물을 연구에 적용 된 기술과의 정밀 하 게 제어 기능을 제공 하는 편리한 라이브 이미징 플랫폼으로 유용한 증명 실시간으로 실험 조건입니다. 이 문서에서는 개별 웜 WormSpa, 이전에 게시 사용자 지정 미세 장치 채용의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다. 기능을 설명 하기 위해 수행 하는 병원 성 박테리아, 장치에 웜 감염 했다 그리고 면역 반응 유전자와 달걀 누워의 표현의 역학 개인에서 지속적으로 감시 되었다 증거의 원리 실험 동물입니다. 단순한 설계와 동작이 미세 기반 실험 이전 경험을 가진 사용자에 게 적합 합니다. 우리는이 이렇게 잘 정의 된 조건 하에서 생물 학적 과정의 종 적 관찰에 관심이 많은 연구원을 위한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.

서문

환경에서 변화 유도 및 특정 유전자^1,2의 식의 억제를 동반 하는 유전 프로그램의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 운동 변화 조직 같은 동물 및 다른 동물 사이 중 변수를 있을 수 있습니다. 같은 유전 프로그램의 연구는 따라서 개별 동물의 경도 이미징 허용 및 환경 조건의 정확한 동적 제어를 제공 하는 방법에 대 한 호출 합니다.

최근 몇 년 동안, ﹙ 유체 장치 응답 및 작은 동물, 벌레, 파리, 물 곰 그리고 더 많은^3,,45,6,^{를 포함 하 여 행동의 여러 측면을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 7}. 응용 프로그램 포함, 예를 들어 깊은 형질, optogenetic 화학 자극에 응답에 신경 활동의 기록 하 고 운동 등 펌핑^8,,910 모터 동작 추적 ^{, 11}.

미세-기반 접근 개최 지역 microenvironment의 유지 보수를 허용 하는 유연한 디자인의 정확한 동적 제어를 포함 한 환경 신호에 응답의 장기 경도 이미징 혜택을 수 있는 많은 속성 별도 숙소, 및 이미징에 대 한 유리한 속성에 개별 동물. 그러나, 그들의 잘 존재에 불리 한 영향을 최소한의 오랜 시간에 대 한 미세 챔버에 동물을 유지 하는 것은 실험의 실행에서 뿐만 아니라 미세 소자의 디자인에 특별 한 주의 요구 하는 도전입니다.

여기 WormSpa, 꼬마 선 충의 경도 이미징 미세 장치를 사용 하 여를 설명합니다. ⁵ 개별 웜 챔버에 국한 됩니다. 액체와 세균 현 탁 액의 지속적인 낮은 흐름 벌레가 잘 먹이 충분히 좋은 건강을 유지 하 고 스트레스를 완화 하는 활성는 챔버의 구조로 벌레 알을 낳 기를 보장 합니다. 디자인의 단순 하 고 WormSpa의 그들의 자신의 연구 계획에이 장치를 통합 하는 마이크로에 이전 경험을 가진 연구원을 허용 해야 합니다.

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프로토콜

프로토콜 아래 WormSpa⁵, 벌레의 경도 이미징에 대 한 이전 설명 미세 장치를 사용합니다. WormSpa (CAD 파일 요청 시 저자에 게 서 얻을 수 있는 시작)의 제조는 간단 하지만 일부 전문성을 요구 한다. 대부분의 경우, 제작 쉽게 수행할 수 있습니다 핵심 시설에 의해 또는 그러한 서비스를 제공 하는 상업 회사에 의해. 장치를 조작 하는 경우 기능 높이 50 µ m 지정 있는지 확인 하십시오.

1. 실험 설치

1. 전동된 스테이지는 거꾸로 형광 현미경에 미세 장치를 탑재 합니다.
2. 현미경, 가까운 궤도 통을 배치 하지만 뿌리에서 진동 직접 영향을 주지 않습니다 현미경. 예를 들어, 광학 테이블와 접촉 하 게 벽에 고정 하는 선반에 뿌리를 넣어.
3. 궤도 통에 주사기 펌프를 배치 합니다. 테이프는 통에 펌프 흔들어 동안 흔들림 하지 않습니다 있도록.

2입니다. 미세 환경 준비

참고: 동안 실험, 4 개의 주사기 연결 되어있습니다 주사기 튜브를 통해 미세 장치에 그림 1에 설명 된 대로. 이 단계에서는 이러한 주사기의 준비를 설명합니다. 달리 언급 하지 않는 한 그들을 긴장 늦추지 않고 주사기 튜브를 가능한 한 짧게 유지.

1. 콘센트 주사기와 주사기 튜브를 준비 합니다. 이 주사기 ( 그림 1에서 S1) 것입니다 나중 주사기 튜브를 통해 장치를 콘센트에 연결 하 고 장치에서 나오는 액체의 임시 저장을 위해 사용.
   1. 어댑터 바늘만 바늘 (금속 부분)을 유지 하는 20 G x 1/2 인치 주사기 팁의 플라스틱 부분을 제거 하 여 확인 합니다. 펜 치와 플라스틱 및 금속 부품을 보유 하 고 그들을 떨어져 당기 여 그렇게. 바늘에 남은 플라스틱 찌 꺼 분 젠 버너 점화 수 있습니다.
   2. 실험적인 체제의 형상에 따라 바늘 펜 치와 그것의 2 개의 끝을 잡고 구부려. 여기서 설명 하는 디자인에 ~ 110 °의 각도를 구 부리는 그것의 중간에 바늘이 가장 편리 합니다.
   3. 튜브 어댑터 바늘 절반 방법을 연결 합니다. 나머지 절반은 나중에 장치에 연결 합니다. 주사기 튜브 누출 (0.86 m m 내경 및 외경 1.32 m m의 튜브 등) 없이 20 G 주사기 팁과 호환 되어야 한다. 권장된 튜브 길이 50 cm입니다.
   4. 20 G x 1/2 인치 주사기 팁을 통해 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝에 10 mL luer 잠금 주사기를 연결 합니다.
2. 버퍼 입구 주사기를 준비 하 고 튜브 주사기. 이러한 주사기 중 하나 ( 그림 1에서 S2) 액을 사출 흐름을 제어 하 고 장치에 대 한 저수지로 사용 됩니다. 다른 주사기 ( 그림 1에 S3)는 버퍼 교환에 필요한 단계 3.2에 설명 된 대로.
   1. 3-방향 밸브를 직접 10 mL 주사기 luer 잠금 (S2)를 연결 하 고 주사기 튜브 (그림 1)을 통해 같은 밸브에 연결할 다른 주사기 (S3): S3 주사기 팁을 통해 튜브를 연결 하 고 다른 주사기 팁을 통해 밸브에 튜브를 연결.
      참고: 이러한 자료 연결 된 순서 대로 중요 하지 않습니다.
   2. 3-방향 밸브의 나머지 포트에 주사기 튜브를 연결 합니다. 준비 단계 2.1.2, 에서처럼 다른 어댑터 바늘을 바늘 도중 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝.
   3. S3 닫혀 있는 동안 단계 2.2.2에 S2 주사기 튜브 연결 되도록 밸브를 설정 (그림 1).
3. 웜-입구 주사기와 주사기 튜브를 준비 합니다. 이 주사기 ( 그림 1에서 S4) 장치에 벌레를 로드 사용 됩니다.
   1. 10 mL 주사기 luer 잠금 (S4)를 긴 주사기 튜브를 연결 합니다. 로드; 하는 데 사용 하는 액체의 볼륨에서이 관의 길이 결정 예를 들어 100 cm 튜브의 액체의 2 개 mL 이상 지원 (또한, 단계 4.2 참조).
   2. 2.1.2, 단계 에서처럼 또 다른 어댑터 바늘을 준비 하 고 하나의 플러그 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝에 바늘의 절반.
4. 모든 주사기와 튜브 S 매체¹² 두 번 씻어. S-매체, 모든 기포를 제거 하도록 주사기와 튜브를 작성.
5. 장치 콘센트에 콘센트 주사기 튜브를 연결 합니다.
   1. 출구 포트를 주사기 튜브의 끝에 어댑터 바늘에 연결 합니다.
   2. 작은 S-중간 버퍼 입구와 웜 유입 때까지 장치를 채우기 위해 콘센트를 통해 S 매체의 작은 볼륨을 주입.
6. (1/32 인치 직경 스테인리스 못 핀) 핀 벌레 입구를 연결 하는 동안 버퍼 입구 주사기 튜브 장치, 버퍼 입구 포트에 연결 합니다.
7. 장치에 버퍼의 지속적인 흐름을 주사. 주사기 펌프¹³에 버퍼 입구 주사기 S2를 로드 하 고 s 2에서 매체에 지속적으로 장치 3 µ L/분의 유량에 주입 되도록 펌프를 설정.

3. 미세 장치에 박테리아 로드

1. 대장균 OP50 S-중간¹²에 준비 합니다.
   1. 표준 프로토콜에 따라 파운드와 단일 식민지의 50 mL와 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어
   2. 야간 문화 4000 rpm에서 10 분간 원심 하 고 S 매체의 30 mL에 펠 릿을 resuspend.
   3. 5 µ m 주사기 필터를 통해 정지를 필터링 합니다. 600의 광학 밀도 의해 세균성 농도 측정 nm (OD₆₀₀), 3의 세₆₀₀ 농도 조정 하 고. 이 높은 밀도 잘 먹이 벌레를 유지 해야 합니다.
2. OP50 서 스 펜 션 장치에 버퍼를 교환 합니다.
   1. OP50 서 스 펜 션으로 가득 (S5) 깨끗 한 주사기를 준비 합니다. 주사기를 수직으로 잡고 하 고 상단에 모든 공기 방울 수집 여러 번을 누릅니다.
   2. 장치에 연결을 닫습니다 버퍼 입구 주사기의 3 방향 밸브를 설정 하 고 두 개의 주사기, S2 및 S3 연결. 주사기 펌프에서 S2를 분리 합니다.
   3. 밸브에서 s 2를 분리 하 고 S5 밸브에 연결. S5의 상단에 s 3 밸브를 통해 때까지 수집 S3 들어가는 약간 OP50 버퍼의 모든 공기를 밖으로 밀어. 이렇게, 아니 공기 방울이 S5 또는 밸브에 남아 있는지 확인 합니다.
   4. 3-방향 밸브 S3와 S5 사이의 연결을 장치에 연결 하는 S5 원래 위치로 다시 설정. 주사기 펌프에 S5를 로드 합니다. 펌프를 보유 궤도 셰이 커를 켭니다. 약 200 rpm 진동 속도 설정 합니다.
   5. 수 100 µ L/min 흐름 속도 설정 합니다. 새로운 버퍼 장치에서 벌레에 도착 하는 데 걸리는 시간 버퍼 입구 주사기 튜브 (위에서 설명한 튜브와 함께 약 5 분)의 길이에 따라 달라 집니다. 높은 흐름 속도 빠른 버퍼 exchange는 필요한 경우 사용할 수 있습니다.
   6. OP50 버퍼 장치를 통해 확산, 일단 3 µ L/분에 다시 흐름 속도 설정 합니다.

4. 미세 장치에 웜 로드

1. 작은 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브 (650 µ L)를 준비 하 고 100 µ L OP50 서 스 펜 션의 그것을 채우십시오. 주위 전송 20-30 나이 동기화 젊은 성인 벌레 (46 시간 25 ° C에서 L1 애벌레 체포를 게시) NGM (선 충 류 성장 매체) 한 천 배지에서 튜브를 그들에 게 벌레와 함께 하나 하나를 선택 하 여 선택. ¹²표준 프로토콜 따라 나이 동기화를 수행할 수 있습니다.
2. 웜-입구를 채우기 주사기와 주사기 튜브 ( 그림 1에서 S4) OP50 서 스 펜 션. 벌레와 함께 microcentrifuge 관에 액체의 ~ 500 µ L를 삽입할. 웜-입구 주사기 튜브에 벌레와 함께 정지를 그립니다. 주사기 튜브는 충분히 있는지 확인 하십시오 (> 1 m) 그린된 웜 주사기 튜브에 하 고 하지 않는 게 줄곧 주사기 S4.
3. 웜-인렛에 s 4를 연결 합니다. 미세 장치에 웜 유입 주사기 튜브에서 모든 벌레를 주사. S4 및 주사기 튜브를 분리 합니다. 연결 핀 웜 입구.
4. 기계식 펌프 ( 그림 1)에서 버퍼 입구 주사기 S2를 분리 하십시오 하 고 수동으로 제어 s 1과 s 2를 별도 채널에 모든 벌레를 밀어. S 2를 누르면 이동 합니다 벌레는 채널에 동안 s 1을 누르면 반대 방향에서 그들을 이동 합니다. 채널 로드 되 면 각 채널에 벌레 다른 벌레의 항목을 차단 합니다.
5. 웜 2-3 시간 동안 새로운 환경에 적응 하자.

5. 영상 프로토콜 설정

1. 안전 하 게 장치에 있는 모든 벌레를 찾아서 당신의 현미경을 제어 하는 이미지 수집 소프트웨어에 그들의 각각에 대 한 이미지 위치를 설정. 어떤 경우에 유의 (예: 높은 확대를 원하는 또는 작은 CCD 센서와 카메라를 사용 하는 경우) 여러 영상 위치는 각 채널에 대 한 필요.
   참고:이 수동으로 할 수 있습니다, 하는 동안 일부 수집 소프트웨어 패키지 이미지 취해야 한다 위치를 나열 하는 텍스트 파일을 로드할 수 있습니다. 주문 때문에이 위치는 정기적으로 WormSpa에, 사용자는 이러한 목록을 자동으로 생성 하는 작은 스크립트를 (예를 들어, Python 또는 상용 소프트웨어)를 작성할 수 있습니다. 이 스크립트의 정확한 형식 것 수집 소프트웨어 ( 보충 자료 1에서 예를 참조)에 의해 필요한 파일 형식에 따라 달라 집니다.
2. 시간 경과 화상의 필요한 주파수를 설정 합니다. 예를 들어 감염에 면역 유전자 응답의 영상 프레임 당 10 분의 주파수에서 이루어집니다. 모든 시간 지점에서 모든 필요한 채널 (예: 밝은 분야 및 GFP 형광)을 인수 하는 다는 것을 확인 하십시오.

6. 호스트 응답 모나 스 감염으로

참고:이 단계는 호스트 병원 체 상호 작용을 공부에 대 한 특정. 또는, 하나 (biotic 및 abiotic 스트레스, 약물, 신호 분자, 등등)의 다른 환경 단서를 포함 하는 버퍼를 준비할 수 있습니다.

1. 녹 농 균 PA14 SK-중간¹⁴에서 일시 중지를 준비 합니다.
   1. 파운드와 단일 식민지의 50 mL와 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어
   2. 파운드의 50 mL 및 문화의 약 수와 함께 또 다른 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어
   3. 야간 문화 4000 rpm에서 10 분간 원심 하 고 SK-매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 세균 농도 측정 하 고 OD₆₀₀ 농도 조정 = 4.
   4. 깨끗 한 플라스 크에 정지를 전송 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서와 동요 하는 동안 24 시간 동안 25 ° c를 품 어. 이 단계는 표준 분석 결과¹⁴를 죽이고 접시 인큐베이션 단계를 모방 합니다.
   5. 5 µ m 주사기 필터를 통해 정지를 필터링 합니다. 이것은 장치를 막힘에서 세균성 집계를 방지 하기 위해입니다.
2. PA14 서 스 펜 션, 3.2 단계와 같은 절차에 따라 OP50 서 스 펜 션 장치에서를 교체 합니다. 10 시간 동안 이미지 유지입니다.

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결과

(46 시간 게시물 25 ° C에서 L1 애벌레로)¹² 프로토콜에 설명 된 대로 장치에 로드 된 젊은 성인 벌레를 나이 동기화. 벌레는 개별적으로 병원 체에 동물의 응답의 경도 측정을 사용 하면 별도 채널에 위치 했다. 실험 성공 하면 대부분 웜 실험의 기간에 대 한 그들의 채널에 남아 있습니다. 이 경우 개별 벌레의 이미지는 단순히 동물을 적극적으로 찾이 필요?...

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토론

미세 도구 공부 벌레에 여러 혜택을 제공 합니다. PDMS에 이미징 장치 표준 NGM 천 판에 비해 더 높은 영상 품질을 제공 합니다. 대조적으로 전통적인 방법 동물 접시에서 고른 및 이미징 위한 현미경 슬라이드에 장착 된 단일 벌레에서 여러 개의 이미지를 취할 수 있습니다. 또한, 웜 거주 하는 microenvironment 상수 또는 원하는 정확한 환경 구성 및 동물의 응답 사이의 매핑 허용으로 변조 된 보관할 수 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
WormSpa	N/A	N/A	The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-501
Tubing	SCI Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/5	0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip	CMLsupply	901-20-050	20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter	PALL	4650	Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe	Qosina	C3307	10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve	ColeParmer	FF-30600-23	Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin	McMaster-Carr	90145A317	18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube	Corning	CL S3206	0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube