JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы демонстрируем живых изображений отдельных червей, используя microfluidic пользовательского устройства. В устройстве несколько червей, индивидуально ограничиваются отдельные камеры, позволяя мультиплексированных продольной наблюдения различных биологических процессов.

Аннотация

В течение последнего десятилетия microfluidic методы были применены для изучения малых животных, в том числе нематоды Caenorhabditis elegansи доказали свою полезность как удобный живой платформа отображения информации, предоставляя возможности для точного управления экспериментальных условиях в режиме реального времени. В этой статье мы демонстрируем живых изображений отдельных червей, используя WormSpa, ранее опубликованных пользовательских microfluidic устройство. В устройстве несколько червей, индивидуально ограничиваются отдельные камеры, позволяя мультиплексированных продольной наблюдения различных биологических процессов. Чтобы проиллюстрировать возможности, мы провели доказательства принцип экспериментов в которых червей были инфицированы в устройстве с патогенных бактерий, и динамики экспрессии генов иммунной реакции и откладки непрерывно контролируются в отдельных животных. Простая конструкция и эксплуатация данного устройства делают его пригодным для пользователей без предыдущего опыта с на основе microfluidic экспериментов. Мы предлагаем, что такой подход будет полезным для многих исследователей, заинтересованных в продольных наблюдения биологических процессов при четко определенных условиях.

Введение

Изменения в условиях окружающей среды может привести к активации генетических программ сопровождается индукции и подавление экспрессии определенных генов1,2. Эти кинетическая изменения могут быть переменной среди тканей, в том же животных и между различными животными. Исследования таких генетических программ поэтому призываем методов, которые позволяют продольной томографии отдельных животных и точный динамический контроль состояния окружающей среды.

В последние годы microfabricated оптимизированных устройств были использованы для изучения многих аспектов реакции и поведения в мелких животных, в том числе червей, мух, медведи воды и более3,4,5,6, 7. Приложения включают, например, глубоко фенотипирование, optogenetic запись активности нейронов в ответ на химические стимулы и отслеживание моторного поведения локомоции и насосных8,9,10 , 11.

Подходы, основанные на microfluidic провести множество свойств, которые могли бы пользу долгосрочных продольной томографии реакции на экологические сигналы, включая точный динамический контроль местных микроокружения, гибкий дизайн, который позволяет ведение отдельных животных в отдельных помещениях и благоприятные атрибуты для изображений. Однако поддержание животных в камере microfluidic долгое время с минимальное отрицательное воздействие на их хорошо существ является проблемой, которая требует определенного ухода в дизайн microfluidic устройства, а также в выполнении эксперимента.

Здесь мы продемонстрировать использование WormSpa, microfluidic устройством для продольной томографии Caenorhabditis elegans. 5 индивидуальных червей ограничены в камерах. Постоянный низкий поток жидкости и бактериальных подвеска гарантирует, что черви являются хорошо кормят и достаточно активным, чтобы поддерживать хорошее здоровье и облегчить стресс, и структура камер позволяет червей откладывают яйца. Простота конструкции и эксплуатации WormSpa должны позволить исследователи с нет предыдущего опыта работы в микрофлюидика включения этого устройства в свои собственные исследовательские планы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Ниже протокол использует WormSpa5, ранее описанные microfluidic устройством для продольной томографии червей. Изготовление WormSpa (начиная с CAD-файлов, которые могут быть получены от авторов по запросу) проста, но требует некоторых знаний. В большинстве случаев изготовление легко может быть сделано путем основной объект или коммерческая компания, которая предоставляет такие услуги. При изготовлении устройство, убедитесь указать, что высота функции — 50 мкм.

1. Экспериментальная установка

  1. Смонтируйте устройство microfluidic на Перевернутый флуоресценции микроскоп с моторизованного столика.
  2. Место орбитальный шейкер недалеко от Микроскоп, но убедитесь, что вибрации от шейкер непосредственно не затрагивают Микроскоп. Например положите шейкер на полке на стене, что делает никаких контактов с таблицей оптических.
  3. Место шприцевый насос на орбитальный шейкер. Лента насоса в шейкер, таким образом, чтобы он не трясти при встряхивании.

2. Подготовка Microfluidic окружающей среды

Примечание: Во время эксперимента, четыре шприцы подключены к устройству microfluidic через шприц-тюбиков, как указано на рисунке 1. Этот шаг описывается подготовка этих шприцы. Если не указано иное, держите как можно более коротким шприц-тюбиков без их тугой.

  1. Подготовки шприц розетки и трубку от шприца. Этот шприц (S1 на рис. 1) будет позже подключен к розетке устройства через трубку от шприца и используется для временного хранения жидкости выходит из устройства.
    1. Сделайте иглы адаптер, удалив пластиковые части кончика шприца 20 G x 1/2 дюйма, сохраняя только иглы (металлические части). Сделать это, удерживая пластиковых и металлических деталей с помощью плоскогубцев и потянув их друг от друга. Оставшиеся пластиковые остатка на иглу можно сгореть с помощью горелки Бунзена.
    2. Согните иглы по геометрии экспериментальной установки удерживая ее два концы плоскогубцами. В конструкции, описанные здесь изгиб иглы в его середине угол ~ 110° является наиболее удобным.
    3. Подключите адаптер иглы половину пути в трубу. Другая половина позднее быть подключен к устройству. Шприц трубка должна быть совместима с кончик шприца 20 G без утечки (например, трубопровод с внутренним диаметром 0.86 мм и наружным диаметром 1.32 мм). Рекомендуется трубки длиной ~ 50 см.
    4. Подключите шприц 10 мл luer-lock в другой (открытый) конец шприца трубки через кончик шприца 20 G x 1/2 дюйма.
  2. Подготовка буфера входе шприцы и шприц трубы. Один из этих шприцы (S2 на рис. 1) используется как резервуар для жидкости, которая идет в устройство и управлять потоком инъекции. Другие шприц (S3 на рис. 1) требуется для буфера обмена, как описано в шаге 3.2.
    1. Подключите шприц 10 мл luer-lock (S2) непосредственно к 3-ходового клапана а другой шприц (S3) к же клапан через трубку от шприца (рис. 1): Подключите S3 на трубу через кончик шприца, а трубка к клапану через другой наконечник шприца.
      Примечание: Порядок, в котором соединены эти материалы не имеет значения.
    2. Подключите трубку от шприца в оставшихся порт 3-ходового клапана. Подготовить еще один адаптер иглу как шаг 2.1.2 и вставьте иглу на полпути в другой (открытый) конец трубку от шприца.
    3. Установите клапан, таким образом, что трубку от шприца в шаге 2.2.2 и S2 связаны в то время как S3 закрыт (рис. 1).
  3. Подготовки шприц червь входе и трубку от шприца. Этот шприц (S4 на рис. 1) используется для загрузки червей в устройство.
    1. Соединить трубки длиной шприц шприц 10 мл luer-lock (S4). Определить длину этой трубки от объема жидкости, которая будет использоваться для загрузки; Например, 100 см трубка поддерживает более 2 мл жидкости (см. также, шаг 4.2).
    2. Подготовить еще один адаптер иглу как шаг 2.1.2 и подключите один половине к другой (открытый) конец шприца трубки иглы.
  4. Промойте все шприцы и труб с S-средний12 дважды. Заполните шприцы и трубы с S-средний, заботясь, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
  5. Подключите отводной трубки шприц к розетке устройства.
    1. Подключите адаптер иглы в конце трубки шприц на выходе порт.
    2. Внедрить небольшой объем S-средний через выход заполнить устройство, пока немного S-средний приходит из входного буфера и входе червя.
  6. Подключите в буфер-шприц трубку к буфер впускное отверстие устройства, во время подключения червь вход с PIN-код (из нержавеющей стали штифт диаметром 1/32 дюйма).
  7. Inject постоянного потока буфера в устройство. Загрузить S2 буфера входе шприца насоса шприца13и установить насос, таким образом, что средний в S2 непрерывно вводят в устройство со скоростью потока 3 мкл/мин.

3. Загрузка бактерий в Microfluidic устройства

  1. Подготовка ОР50 Escherichia coli , приостановлено в S-средний12.
    1. После стандартного протокола прививать 250 мл флакон с 50 мл LB и единую колонию и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Центрифуга ночь культуры при 4000 об/мин в течение 10 минут и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл S-средний.
    3. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр подвеска. Измерить бактериальных концентратов, ее оптическая плотность 600 Нм (OD600) и регулировка концентрации ОД600 3. Это высокая плотность требуется держать червей хорошо кормят.
  2. Обмен буфера в устройство с ОР50 подвеской.
    1. Подготовки шприц чистый (S5), заполнены с ОР50 подвеской. Возьмите шприц вертикально и коснитесь его несколько раз, чтобы собрать все пузырьки воздуха в верхней.
    2. Поверните клапан 3-полосная буфера входе шприцев закрыть подключение к устройству и подключить два шприцы, S2 и S3. Освободите S2 от шприцевой насос.
    3. Отключите S2 от клапана и подключите S5 на клапан. Вытолкнуть весь воздух, собранных на верхней части S5 S3 через клапан до тех пор, пока немного ОР50 буфера переходит в S3. Поступая таким образом, убедитесь, что нет пузырьков воздуха остается в S5 или клапан.
    4. Включение 3-ходовой клапан обратно в исходное положение, чтобы закрыть соединение между S3 и S5 и подключить к устройству S5. Загрузите S5 шприцевой насос. Включите орбитальный шейкер, который держит насос. Установите пожимая скорость около 200 об/мин.
    5. Установите скорость потока быть 100 мкл/мин. Время, необходимое для нового буфера приехать червей в устройстве зависит от длины буфера-шприц трубку (около 5 минут с трубки, описанной выше). Выше скорость потока может использоваться, если требуется быстрее буфера обмена.
    6. Как только буфер ОР50 распространяется по всему устройство, установите скорость потока обратно в 3 мкл/мин.

4. Загрузка червей в Microfluidic устройства

  1. Подготовить небольшой низкий привязки microcentrifuge трубки (650 мкл) и заполнить его с 100 мкл суспензии ОР50. Перевод около 20-30 синхронизированы возраст молодых взрослых червей (46 часов после L1 личиночной арест при 25 ° C) из плиты агара NGM (нематоды роста среднего) на трубу, выбирая их по одному с червь выбрать. Возраст синхронизации может быть сделано после стандартного протокола12.
  2. Заполните червь входе шприц и шприц трубки (S4 на рис. 1) с ОР50 подвеской. Inject ~ 500 мкл жидкости в пробки microcentrifuge с червями. Нарисуйте подвеска с червями в шприц-трубку червя. Убедитесь, что трубка шприц достаточно долго (> 1 м) и Рисованные червей остаться в трубку от шприца и не сделать всю дорогу до шприца S4.
  3. Подсоедините S4 червь входу. Внедрить все черви в шприц-трубку червя в microfluidic устройство. Отключите S4 и трубку от шприца. Подключите червь вход с PIN-код.
  4. Разъединение буфера входе шприц S2 от механического насоса ( рис. 1) и вручную управлять S1 и S2, чтобы подтолкнуть все черви в отдельные каналы. Нажатие S2 будет двигаться червей в каналы, при нажатии S1 будет переместить их в обратном направлении. После загрузки канала, червь в каждом канале будет блокировать запись других червей.
  5. Пусть черви приспособиться к новой среде для 2-3 часа.

5. Настройка протокола изображений

  1. Найти все черви, которые надежно расположены в устройстве и набор изображений позицию для каждого из них в приобретение изображений программное обеспечение, которое контролирует ваш Микроскоп. Обратите внимание, что в некоторых случаях (например когда требуется увеличение, или при использовании камеры с ПЗС сенсор меньшего размера) для каждого канала требуются несколько изображений позиции.
    Примечание: Хотя это может быть сделано вручную, некоторые приобретение пакетов программного обеспечения можно загрузить текстовый файл, который содержит список позиций, где изображения должны быть приняты. Поскольку эти позиции отсортированы регулярно в WormSpa, пользователь может написать небольшой скрипт (например, Python или коммерческого программного обеспечения), который автоматически создает такой список. Точный формат этого сценария будет зависеть предусмотрено приобретение программного обеспечения (см. пример в дополнительный материал 1) формат файла.
  2. Установите необходимую частоту покадровой съемки. Например изображения генов иммунной реакции на инфекции осуществляется с частотой 10 минут каждого кадра. Убедитесь, что все необходимые каналы (например ярко поле и флуоресценции GFP) приобретаются в каждый момент времени.

6. принимающие ответ синегнойной инфекции

Примечание: Этот шаг специфичен для изучения взаимодействия хост патогена. Кроме того можно подготовить буфер, содержащий другие экологические сигналы интереса (биотических и абиотических факторов стресса, наркотики, сигнальные молекулы, и т.д.).

  1. Подготовка PA14 Pseudomonas aeruginosa , приостановлено в SK-средний14.
    1. 250 мл флакон с 50 мл LB и единую колонию прививок и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Прививок еще 250 мл флакон с 50 мл фунтов и Алиготе культуры и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    3. Центрифуга ночь культуры при 4000 об/мин в течение 10 минут и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл SK-средний. Измерить бактериальных концентратов и регулировка концентрации ОД600 = 4.
    4. Передать чистую колбу подвеска и инкубировать при 37 ° C в течение 24 часов и при 25 ° C для еще 24 часов при встряхивании. Этот шаг имитирует пластины инкубации шаг в стандарте убийство пробирного14.
    5. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр подвеска. Это необходимо для предотвращения бактериального агрегатов от засорения устройство.
  2. Замените PA14 подвеска, следуя той же процедуре, как и в шаге 3.2 ОР50 подвеска в устройстве. Сохранять изображения на 10 часов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Возраст синхронизированы молодых взрослых червей (46 часов пост личиночной арест L1 при 25 ° C)12 были загружены в устройство, как описано в протоколе. Черви индивидуально были расположены в отдельных каналов, позволяя продольной измерение реакции животных на...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Microfluidic инструменты обеспечивают многочисленные преимущества в изучении червей. Изображений в PDMS устройство обеспечивает более высокое качество изображения по сравнению с стандартной плиты агар NGM. Несколько изображений могут быть взяты из одного червя, в отличие от традиционных мето...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано национального научного фонда через гранты PHY-1205494 и MCB-1413134 (EL) и Национальный исследовательский фонд Кореи Грант 2017R1D1A1B03035671 (KSL).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
WormSpaN/AN/AThe CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound MicroscopeZeissAxioObserver Z1An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE-501
TubingSCI Scientific Commodities Inc.BB31695-PE/50.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe TipCMLsupply901-20-05020 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe FilterPALL4650Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
SyringeQosinaC330710 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way ValveColeParmerFF-30600-23Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel PinMcMaster-Carr90145A31718-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge TubeCorningCL S32060.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube

Ссылки

  1. Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
  2. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  3. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
  4. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
  5. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  6. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998(2014).
  7. Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670(2017).
  8. Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
  9. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
  10. Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862(2016).
  11. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221(2017).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
  14. Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
  15. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  16. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183(2006).
  17. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
  19. Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
  20. Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
  21. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
  22. Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
  23. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  24. Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345(2013).
  25. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
  26. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  27. Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
  28. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены