Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

Riepilogo

In questo articolo, dimostriamo live imaging dei singoli vermi che impiegano un dispositivo microfluidico personalizzato. Nel dispositivo, più vermi individualmente sono confinati per separare chambers, permettendo multiplex sorveglianza longitudinale di vari processi biologici.

Abstract

Nell'ultimo decennio, microfluidica tecniche sono state applicate per lo studio di piccoli animali, tra cui il nematode Caenorhabditis eleganse si sono rivelati utili come una comoda piattaforma di imaging live fornendo funzionalità per un controllo preciso di condizioni sperimentali in tempo reale. In questo articolo, dimostriamo live imaging dei singoli vermi che impiegano WormSpa, un dispositivo microfluidico personalizzato precedentemente pubblicato. Nel dispositivo, più vermi individualmente sono confinati per separare chambers, permettendo multiplex sorveglianza longitudinale di vari processi biologici. Per illustrare le funzionalità, abbiamo effettuato esperimenti di prova-de-principio in cui vermi sono stati infettati nel dispositivo con i batteri patogeni, e la dinamica dell'espressione di geni di risposta immunitaria e la deposizione delle uova sono stata monitorata in continuo in individuo animali. Il design semplice e il funzionamento di questo dispositivo lo rendono adatto per utenti con nessuna esperienza precedente con esperimenti basati su microfluidica. Proponiamo che questo approccio sia utile per molti ricercatori interessati nelle osservazioni longitudinali dei processi biologici in condizioni ben definite.

Introduzione

Cambiamenti nelle condizioni ambientali possono portare all'attivazione di programmi genetici accompagnato da induzione e repressione dell'espressione di specifici geni^1,2. Questi cambiamenti cinetici possono essere variabile tra tessuti negli stessi animali e tra animali diversi. Studi di tali programmi genetici pertanto chiamano per metodi che consentono di imaging longitudinale dei singoli animali e forniscono un controllo dinamico preciso delle condizioni ambientali.

Negli ultimi anni, sono stati utilizzati fluidico dispositivi microfabbricati per studiare molti aspetti della risposta e comportamento nei piccoli animali, tra cui vermi, mosche, acqua orsi e altre^{3,4,5,6, 7}. Le applicazioni includono, ad esempio, profonda phenotyping, optogenetica registrazione dell'attività neuronale in risposta a stimoli chimici e il monitoraggio dei comportamenti motori come locomozione e pompaggio^{8,9,10 , 11}.

Gli approcci basati su microfluidici tenere molte proprietà che potrebbero beneficiare di formazione immagine longitudinale a lungo termine della risposta a stimoli ambientali, tra cui controllo dinamico preciso del microambiente locale, design flessibile che permette la manutenzione dei singoli animali in quartieri separati e attributi favorevoli per l'imaging. Tuttavia, mantenere gli animali in una camera di microfluidica per lungo tempo con minimo impatto negativo sulla loro esseri ben è una sfida, che richiede particolare cura nella progettazione del dispositivo microfluidico nonché nell'esecuzione dell'esperimento.

Qui dimostriamo l'uso di WormSpa, un dispositivo microfluidico per formazione immagine longitudinale del Caenorhabditis elegans. ⁵ singoli vermi sono confinati negli alloggiamenti. Un basso flusso costante di liquido e batterica sospensione garantisce che i vermi sono ben nutriti e sufficientemente attivo per mantenere una buona salute e alleviare lo stress, e la struttura delle camere permette di vermi per deporre le uova. La semplicità del design e il funzionamento del WormSpa dovrebbe permettere ai ricercatori con nessuna esperienza precedente in microfluidica per incorporare i propri piani di ricerca di questo dispositivo.

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Protocollo

Il protocollo sottostante utilizza WormSpa⁵, un dispositivo microfluidico precedentemente descritto per l'imaging longitudinale di vermi. Fabbricazione di WormSpa (a partire con i file CAD che possono essere ottenuti dagli autori su richiesta) è semplice, ma richiede alcune competenze. Nella maggior parte dei casi, fabbricazione può essere fatto facilmente da una struttura o da una società commerciale che fornisce tali servizi. Quando fabbricando il dispositivo, assicurarsi di specificare l'altezza delle caratteristiche è di 50 µm.

1. organizzazione sperimentale

1. Montare il dispositivo microfluidico su un microscopio a fluorescenza invertito con un tavolino motorizzato.
2. Posto un agitatore orbitale vicino al microscopio, ma assicurarsi che la vibrazione da shaker non influisce direttamente al microscopio. Ad esempio, inserire nello shaker su un ripiano fissato su una parete che non rende nessun contatto con il tavolo ottico.
3. Posto una pompa a siringa su agitatore orbitale. Nastro della pompa a shaker affinché esso non jiggle mentre si stringono.

2. preparazione dell'ambiente microfluidica

Nota: Durante l'esperimento, quattro siringhe sono collegati al dispositivo microfluidico tramite tubi di siringa, come indicato nella Figura 1. Questo passaggio descrive la preparazione di queste siringhe. A meno che non diversamente specificato, è possibile mantenere le provette di siringa più breve possibile senza che li rende teso.

1. Preparare una siringa di presa e un tubo siringa. Questa siringa (S1 nella Figura 1) successivamente sarà collegata alla presa dell'apparecchio attraverso il tubo siringa e utilizzato per l'archiviazione temporanea di fluido proveniente dal dispositivo.
   1. Rendono un adattatore ago rimuovendo parti in plastica di una punta della siringa 20 x 1/2 pollice, mantenendo solo l'ago (parte metallica). Farlo tenendo le parti in plastica e metallo con una pinza e li separano. Residui di plastica dell'ago possono essere bruciato con un becco Bunsen.
   2. Piegare l'ago secondo la geometria del setup sperimentale tenendo le due estremità con le pinze. Nel disegno qui descritto, piegare l'ago nella sua metà ad un angolo di ~ 110° è più conveniente.
   3. Inserire l'ago di adattatore a metà strada nel tubo. L'altra metà sarà successivamente collegata al dispositivo. Il tubo siringa dovrebbe essere compatibile con una punta della siringa 20 G senza una perdita (ad esempio, tubi con diametro interno di 0,86 mm e diametro esterno di 1,32 mm). La lunghezza del tubo consigliato è ~ 50 cm.
   4. Collegare una siringa da 10 mL a altra estremità del tubo siringa tramite una punta della siringa 20 x 1/2 pollice (aperta).
2. Preparare buffer-ingresso siringhe e tubi a siringa. Uno di queste siringhe (S2 nella Figura 1) è usato come un serbatoio per il liquido che va al dispositivo e per controllare il flusso di iniezione. Altre la siringa (S3 nella Figura 1) è necessario per scambio di buffer, come spiegato nel punto 3.2.
   1. Collegare una siringa luer lock 10 mL (S2) direttamente ad una valvola a 3 vie e un altro siringa (S3) per la stessa valvola tramite un tubo siringa (Figura 1): collegare S3 al tubo tramite una punta della siringa e collegare il tubo alla valvola tramite un'altra punta della siringa.
      Nota: Non importa l'ordine in cui questi materiali sono collegati.
   2. Collegare un tubo siringa alla porta restante della valvola 3 vie. Preparare un altro ago adattatore come descritto al punto 2.1.2 e collegare l'altra estremità (aperta) del tubo siringa l'ago a metà strada.
   3. Posizionare la valvola in modo tale che il tubo siringa al punto 2.2.2 e S2 sono collegati mentre S3 è chiuso (Figura 1).
3. Preparare una siringa di vite senza fine-aspirazione e un tubo siringa. Questa siringa (S4 nella Figura 1) è utilizzato per il caricamento di vermi nel dispositivo.
   1. Collegare un tubo siringa lunga a una siringa luer lock 10 mL (S4). Determinare la lunghezza di questo tubo dal volume del fluido che verrà utilizzato per il caricamento; ad esempio, 100 cm di tubo supporta oltre 2 mL di liquido (vedere anche punto 4.2).
   2. Preparare un altro ago adattatore come descritto al punto 2.1.2 e collegare una metà dell'ago all'estremità (aperta) del tubo siringa.
4. Sciacquare tutte le siringhe e tubi con S-medio¹² due volte. Riempire le siringhe e i tubi con S-medio, avendo cura di eliminare tutte le bolle d'aria.
5. Collegare il tubo di uscita siringa all'uscita del dispositivo.
   1. Inserire l'ago di adattatore all'estremità del tubo siringa alla porta di uscita.
   2. Iniettare un piccolo volume di S-medio attraverso l'uscita per riempire il dispositivo, fino a quando un po ' S-medio esce sia l'ingresso di buffer e l'ingresso del verme.
6. Collegare il tubo di siringa buffer-ingresso alla porta tampone-ingresso del dispositivo, mentre collegando la bocca di vite senza fine con un pin (spina di centraggio in acciaio inox con un diametro di 1/32 di pollice).
7. Iniettare un flusso costante di buffer nel dispositivo. Caricare la siringa di buffer-ingresso S2 su una siringa pompa¹³e impostare la pompa in modo che il mezzo in S2 continuamente viene iniettato il dispositivo ad una portata di 3 µ l/min.

3. caricamento di batteri nel dispositivo microfluidico

1. Preparare Escherichia coli OP50 sospesa in medio-S¹².
   1. A seguito di un protocollo standard, inoculare un pallone da 250 mL con 50 mL di LB e una singola Colonia e incubare per una notte a 37 ° C.
   2. Centrifugare la coltura durante la notte a 4000 giri/min per 10 minuti e risospendere il pellet in 30 mL di medio-S.
   3. Filtrare la sospensione attraverso un filtro per siringa 5 µm. Misurare la concentrazione batterica dalla sua densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) e regolare la concentrazione di un OD₆₀₀ di 3. Questa ad alta densità è necessaria per mantenere i vermi ben nutriti.
2. Scambiare il buffer nel dispositivo con la sospensione di OP50.
   1. Preparare una siringa pulita (S5) riempita con la sospensione di OP50. Tenere la siringa in posizione verticale e toccare più volte per raccogliere tutte le bolle di aria nella parte superiore.
   2. Girare la valvola 3 vie delle siringhe buffer-ingresso per chiudere la connessione al dispositivo e collegare le due siringhe, S2 e S3. Disinnestare S2 da pompa a siringa.
   3. Scollegare la valvola S2 e collegare S5 alla valvola. Spingere fuori tutta l'aria raccolto nella parte superiore della S5 a S3 attraverso la valvola fino a quando un po ' di buffer OP50 entra in S3. In tal modo, assicurarsi che nessuna bolla di aria rimane in S5 o la valvola.
   4. Girare la valvola a 3 vie torna alla posizione originale per chiudere la connessione tra S3 e S5 e connettersi al dispositivo di S5. Carico S5 sulla pompa a siringa. Accendere l'agitatore orbitale che tiene la pompa. Impostare la velocità di agitazione per circa 200 giri/min.
   5. Impostare la portata da 100 µ l/min. Il tempo che necessario per il nuovo buffer di arrivare ai vermi nel dispositivo dipende dalla lunghezza del tubo siringa buffer-ingresso (circa 5 minuti con il tubo sopra descritto). Un più alto tasso di flusso può essere impiegato se è necessario un più rapido scambio di buffer.
   6. Una volta che il buffer OP50 si diffonde in tutto il dispositivo, è possibile impostare la portata indietro a 3 µ l/min.

4. caricamento Worms nel dispositivo microfluidico

1. Preparare un tubo del microcentrifuge piccola associazione basso (650 µ l) e riempirlo con 100 µ l di sospensione OP50. Trasferimento intorno 20-30 sincronizzato di età giovani vermi adulti (46 ore dopo l'arresto larvale L1 a 25 ° C) da una piastra di agar NGM (crescita del nematode medio) al tubo di raccoglierli uno per uno con un verme pick. Età-sincronizzazione può essere fatta seguendo un protocollo standard¹².
2. Riempire la vite senza fine-aspirazione siringa e siringa tube (S4 nella Figura 1) con la sospensione di OP50. Iniettare ~ 500 µ l del fluido nel tubo del microcentrifuge con i vermi. Disegnare la sospensione con i vermi nel tubo siringa vite senza fine-aspirazione. Assicurarsi che il tubo siringa è abbastanza a lungo (> 1 m) e che il worm disegnato soggiornare nel tubo siringa e non fare tutto il senso alla siringa S4.
3. Collegare S4 all'entrata del verme. Iniettare tutti i vermi nel tubo siringa verme-ingresso nel dispositivo microfluidico. Scollegare il tubo siringa e S4. Collegare la bocca di vite senza fine con un pin.
4. Disinnestare la siringa di buffer-ingresso S2 dalla pompa meccanica ( Figura 1) e controllare manualmente la S1 e S2 per spingere tutti i vermi in canali separati. Premendo S2 si muovono vermi nei canali, mentre premendo S1 li sposterà nella direzione inversa. Una volta caricato un canale, il worm in ciascun canale bloccherà l'ingresso di altri worm.
5. Lasciare che il worm al nuovo ambiente per 2-3 ore.

5. creazione di un protocollo di Imaging

1. Trovare tutti i vermi che si trovano in modo sicuro nel dispositivo e impostare una posizione di imaging per ciascuno di essi nel software di acquisizione di immagine che controlla il microscopio. Si noti che in alcuni casi (ad esempio quando si desidera ottenere maggiore ingrandimento, o quando si utilizzano fotocamere con un più piccolo sensore CCD) posizioni multiple di formazione immagine sono necessari per ogni canale.
   Nota: Mentre questo può essere fatto manualmente, alcuni pacchetti di software di acquisizione possono caricare un file di testo che elenca le posizioni dove le immagini dovrebbero essere prese. Poiché queste posizioni vengono ordinate regolarmente in WormSpa, un utente può scrivere un piccolo script (ad esempio, in Python o al software commerciale) che crea automaticamente tale elenco. Il formato preciso di questo script sarebbe dipendono dal formato file previsto dal software di acquisizione (Vedi un esempio in 1 materiale supplementare).
2. Impostare la frequenza richiesta di time-lapse imaging. Ad esempio, formazione immagine della risposta di gene immune all'infezione avviene ad una frequenza di 10 minuti per ogni frame. Assicurarsi che tutti i canali necessari (ad es. bright-field e la fluorescenza di GFP) vengono acquisiti in ogni momento.

6. risposta ospite all'infezione di Pseudomonas

Nota: Questo passaggio è specifico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. In alternativa, si può preparare un buffer che contiene altri stimoli ambientali di interesse (fattori di stress biotici e abiotici, droghe, segnalazione di molecole, ecc.).

1. Preparare Pseudomonas aeruginosa PA14 sospesa in SK-medio¹⁴.
   1. Inoculare un pallone da 250 mL con 50 mL di LB e una singola Colonia e incubare per una notte a 37 ° C.
   2. Inoculare un altro pallone da 250 mL con 50 mL di LB e un'aliquota della cultura e incubare per una notte a 37 ° C.
   3. Centrifugare la coltura durante la notte a 4000 giri/min per 10 minuti e risospendere il pellet in 10 mL di SK-medio. Misurare la concentrazione batterica e regolare la concentrazione di OD₆₀₀ = 4.
   4. Trasferire la sospensione in un pallone pulito e incubare a 37 ° C per 24 ore e a 25 ° C per altre 24 ore mentre si stringono. Questo passaggio imita il passo piatto-incubazione nello standard uccidendo saggio¹⁴.
   5. Filtrare la sospensione attraverso un filtro per siringa 5 µm. Questo è per impedire l'intasamento del dispositivo di aggregazioni batteriche.
2. Sostituire la sospensione OP50 nel dispositivo con la sospensione di PA14, seguendo la procedura descritta al punto 3.2. Tenere imaging per 10 ore.

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Risultati

Vermi adulti giovani età-sincronizzati (46 ore post arresto larvale L1 a 25 ° C)¹² sono stati caricati nel dispositivo, come descritto nel protocollo. I vermi si trovavano individualmente in canali separati, Abilitazione misura longitudinale della risposta degli animali all'agente patogeno. Quando l'esperimento è riuscito, la maggior parte dei worm rimangono nei loro canali per tutta la durata dell'esperimento. In questo caso, immagini di worms individuali sono ...

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Discussione

Strumenti di microfluidica forniscono molteplici vantaggi nello studio di vermi. Imaging in un PDMS dispositivo offre qualità delle immagini superiore rispetto ad una piastra di agar NGM standard. Immagini multiple possono essere assunto da una vite senza fine, in contrasto con i metodi tradizionali in cui gli animali sono raccolte dalla piastra e montati su un vetrino da microscopio per l'imaging. Inoltre, il microambiente in cui si trovano vermi può essere mantenuto costante o modulata come desiderato, permettendo pr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
WormSpa	N/A	N/A	The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-501
Tubing	SCI Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/5	0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip	CMLsupply	901-20-050	20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter	PALL	4650	Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe	Qosina	C3307	10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve	ColeParmer	FF-30600-23	Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin	McMaster-Carr	90145A317	18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube	Corning	CL S3206	0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube