Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

Resumo

Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais empregando um dispositivo microfluidic personalizado. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos.

Resumo

Na última década, microfluidic técnicas foram aplicadas para estudar pequenos animais, incluindo o nematódeo Caenorhabditis elegans, em provaram útil como uma plataforma de imagem ao vivo conveniente, fornecendo recursos para o controle preciso de condições experimentais em tempo real. Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais, empregando o WormSpa, um dispositivo microfluidic personalizado anteriormente publicada. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos. Para ilustrar o recurso, realizamos experimentos de prova de princípio em que minhocas foram infectadas no dispositivo com bactérias patogênicas e a dinâmica da expressão de genes de resposta imune e postura de ovos foram monitorada continuamente no indivíduo animais. O design simples e operação deste dispositivo torná-lo adequado para usuários sem experiência anterior com experimentos microfluidic-baseado. Propomos que esta abordagem será útil para muitos pesquisadores interessados nas observações longitudinais de processos biológicos, sob condições bem definidas.

Introdução

Mudanças nas condições ambientais podem levar a ativação de programas genéticos, acompanhado por indução e repressão da expressão de genes específicos^1,2. Essas alterações cinéticas podem ser variável entre tecidos nos mesmos animais e entre animais diferentes. Estudos de tais programas genéticos, portanto, chamar para métodos que permitem a imagem longitudinal de animais individuais e fornecem controle dinâmico preciso das condições ambientais.

Nos últimos anos, microfabricated fluídico dispositivos têm sido usados para estudar muitos aspectos da resposta e comportamento em pequenos animais, incluindo vermes, moscas, água ursos e mais^{3,4,5,6, 7}. As aplicações incluem, por exemplo, fenotipagem profunda, optogenetic gravação de atividade neuronal em resposta a estímulos químicos e monitoramento de comportamentos motor, tais como locomoção e bombeamento^{8,9,10 , 11}.

Abordagens baseadas em microfluidic segurar muitas propriedades que poderiam beneficiar a longo prazo de imagem longitudinal da resposta a sinais ambientais, incluindo controle dinâmico preciso do microambiente local, design flexível que permite a manutenção de cada animal em quartos separados e atributos favoráveis para a imagem latente. No entanto, manter animais em uma câmara de microfluidic por um longo tempo com o mínimo impacto adverso sobre seus seres bem é um desafio que requer uma atenção especial no projeto do dispositivo microfluidic, bem como na execução do experimento.

Aqui vamos mostrar o uso de WormSpa, um dispositivo microfluidic para imagem longitudinal de Caenorhabditis elegans. ⁵ vermes individuais estão confinados em câmaras. Um baixo fluxo constante de suspensão bacteriana e líquido garante que vermes são bem alimentados e suficientemente ativo para manter a boa saúde e aliviar o estresse, e a estrutura das câmaras permite vermes para pôr ovos. A simplicidade do projeto e operação de WormSpa devem permitir que os investigadores com nenhuma experiência anterior em microfluídica para incorporar este dispositivo em seus próprios planos de pesquisa.

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Protocolo

O protocolo abaixo usa WormSpa⁵, um dispositivo microfluidic descritas anteriormente para a imagem latente longitudinal de vermes. Fabricação de WormSpa (começando com arquivos de CAD que podem ser obtidos os autores mediante solicitação) é simples, mas requer alguma experiência. Na maioria dos casos, fabricação pode prontamente ser feita por uma instalação de núcleo ou por uma empresa comercial que fornece esses serviços. Quando o dispositivo de fabricação, certifique-se de especificar que a altura das características 50 µm.

1. experimental Setup

1. Monte o dispositivo microfluidic em um microscópio de fluorescência invertido com um palco motorizado.
2. Coloque um agitador orbital perto do microscópio, mas certifique-se que a vibração do agitador não afeta diretamente o microscópio. Por exemplo, colocar o agitador em uma prateleira fixada em uma parede que faz sem contato com a tabela de óptica.
3. Coloca uma bomba de seringa no agitador orbital. Fita da bomba para o agitador para que ele não jiggle agitando.

2. preparação do ambiente microfluídicos

Nota: Durante o experimento, quatro seringas estão ligadas ao dispositivo microfluidic através de tubos de seringa, conforme descrito na Figura 1. Este passo descreve a preparação destas seringas. A não ser mencionado, caso contrário, manter os tubos de seringa tão curtos quanto possível sem torná-los tenso.

1. Prepare uma seringa de saída e um tubo de seringa. Esta seringa (S1 na Figura 1) será mais tarde conectados à tomada do dispositivo através do tubo de seringa e usado para armazenamento temporário de líquido saindo do dispositivo.
   1. Fazer uma agulha de adaptador, removendo as peças de plástico de uma ponta de seringa de 20 x 1/2 polegada, mantendo apenas a agulha (parte metálica). Fazê-lo, mantendo as peças de plástico e de metal com um alicate e separá-los. Resíduo plástico restante na agulha pode ser queimado com um bico de Bunsen.
   2. Dobre a agulha de acordo com a geometria da instalação experimental, mantendo suas duas extremidades com um alicate. No projeto descrito aqui, dobrar a agulha em seu meio para um ângulo de ~ 110° é mais conveniente.
   3. Conecte a agulha do adaptador a meio caminho do tubo. A outra metade será mais tarde conectada no dispositivo. O tubo da seringa deve ser compatível com uma ponta de seringa de 20 G sem um vazamento (por exemplo, um tubo com diâmetro interno de 0,86 mm e diâmetro externo de 1,32 mm). O comprimento do tubo recomendado é ~ 50 cm.
   4. Conecte uma seringa luer-lock de 10 mL para a outra extremidade (aberta) do tubo seringa através de uma ponta de seringa de 20 x 1/2 polegada.
2. Preparar amortecedor-entrada seringas e tubos de seringa. Dentre essas seringas (S2 na Figura 1) é usado como um reservatório para o líquido que entra no aparelho e para controlar o fluxo de injeção. A outra seringa (S3 na Figura 1) é necessária para troca de amortecedor, conforme explicado no passo 3.2.
   1. Conectar uma seringa de 10ml luer-lock (S2) diretamente a uma válvula de 3 vias e conectar outra seringa (S3) para a mesma válvula através de um tubo de seringa (Figura 1): S3 conectar-se ao tubo através de uma ponta de seringa e ligar o tubo para a válvula através de uma outra ponta de seringa.
      Nota: Não importa a ordem em que esses materiais estão conectados.
   2. Conecte um tubo de seringa à porta restante da válvula de 3 vias. Prepare outra agulha adaptador como na etapa 2.1.2 e conecte a outra extremidade (aberta) do tubo seringa a agulha na metade do caminho.
   3. Conjunto da válvula, tal que o tubo de seringa na etapa 2.2.2 e S2 estão ligados enquanto S3 é fechado (Figura 1).
3. Prepare uma seringa de worm-entrada e um tubo de seringa. Esta seringa (S4 na Figura 1) é usado para carregar vermes no dispositivo.
   1. Conecte um tubo de seringa longa uma seringa de 10ml luer-lock (S4). Determinar o comprimento deste tubo do volume do fluido que será usado para o carregamento; por exemplo, 100 cm de tubo suporta mais de 2 mL de líquido (consulte também o passo 4.2).
   2. Prepare outra agulha adaptador como na etapa 2.1.2 e ligar um meia da agulha para a outra extremidade (aberta) do tubo seringa.
4. Lave todas as seringas e tubos com S-médio¹² duas vezes. Encha as seringas e os tubos com S-meio, tendo o cuidado de remover todas as bolhas de ar.
5. Conecte o tubo de saída da seringa à saída do dispositivo.
   1. Conecte a agulha do adaptador na extremidade do tubo seringa à porta de saída.
   2. Injete um pequeno volume de S médio através da saída para encher o dispositivo, até um pouco S médio saia tanto a entrada da reserva e a entrada de verme.
6. Conecte o tubo de seringa de tampão-entrada à porta de entrada de buffer do dispositivo, enquanto obstruindo a entrada de verme com um pino (pino de passador de aço inoxidável com um diâmetro de 1/32 de polegada).
7. Injete um fluxo constante de buffer do dispositivo. Carregar a seringa de tampão-entrada S2 para uma bomba de seringa¹³e conjunto da bomba tal que a média em S2 é injectada continuamente o dispositivo com um caudal de 3 µ l/min.

3. carregar as bactérias para o dispositivo Microfluidic

1. Prepare-se Escherichia coli OP50 suspendido em S-médio¹².
   1. Na sequência de um protocolo padrão, inocular um balão de 250 mL com 50 mL de LB e uma única colônia e incubar durante uma noite a 37 ° C.
   2. Centrifugar a cultura durante a noite a 4000 rpm por 10 minutos e resuspenda o pellet em 30 mL de meio-de-S.
   3. Filtre a suspensão através de um filtro de seringa de 5 µm. Medir a concentração bacteriana por sua densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) e ajustar a concentração de uma OD₆₀₀ de 3. Esta alta densidade é necessária para manter os vermes bem alimentados.
2. Troca o buffer no dispositivo com a suspensão de OP50.
   1. Prepare uma seringa limpa (S5) preenchida com a suspensão de OP50. Segurar a seringa verticalmente e bata-o várias vezes para recolher todas as bolhas de ar no topo.
   2. Gire a válvula de 3 vias de seringas de tampão-entrada para fechar a conexão para o dispositivo e conecte as duas seringas, S2 e S3. Desengate o S2 da bomba de seringa.
   3. Desconecte a válvula-S2 e S5 se conectem a válvula. Expulsar todo o ar coletado no topo da S5 S3 através da válvula até um pouco de buffer OP50 entra S3. Ao fazer isso, certifique-se de que nenhuma bolha de ar permanece em S5 ou a válvula.
   4. Gire a válvula de 3 vias para a posição original para fechar a conexão entre S3 e S5 e conectar o dispositivo a S5. S5 de carga sobre a bomba de seringa. Ligue o agitador orbital que prende a bomba. Defina a velocidade de agitação para cerca de 200 rpm.
   5. Defina a taxa de fluxo ser 100 µ l/min. O tempo que leva para o novo buffer chegar para os vermes no dispositivo depende do comprimento do tubo seringa reserva-entrada (cerca de 5 minutos com a tubagem descrito acima). Uma maior taxa de fluxo pode ser empregada se uma troca de amortecedor mais rápida é necessária.
   6. Uma vez que o buffer OP50 se espalha por todo o dispositivo, defina a taxa de fluxo para 3 µ l/min.

4. carregar vermes no dispositivo Microfluidic

1. Prepare um pequena ligação baixa microcentrifuga tubo (650 µ l) e preenchê-lo com 100 µ l de suspensão de OP50. Transferência em torno de 20-30 jovens de idade-sincronizado pegar germes adultos (46 horas após a detenção larval de L1 a 25 ° C) de uma placa de ágar NGM (meio de crescimento nemátodes) ao tubo por pegá-los um por um com um verme. Idade-sincronização pode ser feito na sequência de um protocolo padrão¹².
2. Preencher o worm-entrada da seringa e seringa do tubo (S4 na Figura 1) com a suspensão de OP50. Injete ~ 500 µ l do fluido dentro do tubo de microcentrifugadora com vermes. Desenhe a suspensão com vermes no tubo de seringa de worm-entrada. Certifique-se que o tubo da seringa é longa o suficiente (> 1 m) e que vermes desenhadas fiquem no tubo de seringa e não fazem todo o caminho até a seringa S4.
3. Conecte o S4-entrada do worm. Injete o dispositivo microfluidic todos os vermes no tubo de seringa de worm-entrada. Desconecte o S4 e o tubo de seringa. Conecte a entrada de verme com um alfinete.
4. Desencaixe a seringa de tampão-entrada S2 da bomba mecânica ( Figura 1) e controlar manualmente S1 e S2 para empurrar todos os vermes em canais separados. Pressionar S2 moverá vermes os canais, enquanto pressionar S1 irá movê-los na direção inversa. Uma vez que um canal é carregado, o verme em cada canal irá bloquear a entrada de outros worms.
5. Deixe vermes ajustar ao novo ambiente, por 2-3 horas.

5. criação de um protocolo de imagem

1. Encontrar todos os vermes que localizam-se firmemente no dispositivo e definir uma posição de imagem para cada um no software de aquisição de imagem que controla seu microscópio. Observe que em alguns casos (por exemplo, quando se deseja uma ampliação maior, ou quando utilizar câmeras com um sensor CCD menor) múltiplas posições de imagem são necessárias para cada canal.
   Nota: Enquanto isso pode ser feito manualmente, alguns pacotes de software de aquisição podem carregar um arquivo de texto que lista as posições onde as imagens devem ser tomadas. Desde que estas posições são ordenadas regularmente em WormSpa, um usuário pode escrever um pequeno script que cria automaticamente uma lista desse tipo (por exemplo, em Python ou software comercial). O formato preciso desse script depende do formato de arquivo esperado pelo software de aquisição (veja um exemplo no Material complementar 1).
2. Defina a frequência necessária da imagem latente de lapso de tempo. Por exemplo, imagem latente da resposta de gene imune à infecção é feito com uma frequência de 10 minutos por quadro. Certifique-se de que todos os canais necessários (por exemplo, brilhante-campo e a fluorescência de GFP) são adquiridos em cada ponto de tempo.

6. host resposta à infecção de Pseudomonas

Nota: Este passo é específico para estudar interações patógeno-hospedeiro. Alternativamente, um pode preparar um buffer que contém outras pistas ambientais de interesse (estresses bióticos e abióticos, drogas, sinalização moléculas, etc.).

1. Prepare-se Pseudomonas aeruginosa PA14 suspendido no SK-médio¹⁴.
   1. Inocular um balão de 250 mL com 50 mL de LB e uma única colônia e incubar durante uma noite a 37 ° C.
   2. Inocular o outro balão de 250 mL com 50 mL de LB e uma alíquota da cultura e incubar durante uma noite a 37 ° C.
   3. Centrifugar a cultura durante a noite a 4000 rpm por 10 minutos e resuspenda o pellet em 10 mL de SK-médio. Medir a concentração bacteriana e ajustar a concentração de OD₆₀₀ = 4.
   4. A suspensão de transferência para um balão limpo e incubar a 37 ° C por 24 horas e a 25 ° C, durante 24 horas e agitando. Esta etapa imita a etapa de incubação-placa na norma de ensaio¹⁴a matar.
   5. Filtre a suspensão através de um filtro de seringa de 5 µm. Isso é para evitar agregados bacterianos de obstruir o dispositivo.
2. Substitua a suspensão PA14, seguindo o mesmo procedimento como no passo 3.2 a suspensão OP50 no dispositivo. Manter a imagem por 10 horas.

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Resultados

Idade-sincronizado em vermes de adultos jovens (46 horas pós prisão larval de L1 a 25 ° C)¹² foram carregados no dispositivo, conforme descrito no protocolo. Individualmente, os vermes estavam localizados em canais separados, permitindo a medição longitudinal da resposta dos animais ao patógeno. Quando a experiência for bem sucedida, a maioria dos vermes permanecem em seus canais para a duração do experimento. Neste caso, imagens de worms individuais são ...

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Discussão

Microfluidic ferramentas fornecem vários benefícios no estudo de vermes. Imaging em um PDMS dispositivo oferece maior qualidade de imagem em comparação com uma placa de ágar padrão NGM. Várias imagens podem ser tomadas a partir de um único verme, em contraste com os métodos tradicionais em que os animais são colhidos a partir da placa e montados sobre uma lâmina de microscópio para a imagem latente. Além disso, o microambiente no qual residem vermes pode ser mantido constante ou modulado conforme desejado, p...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
WormSpa	N/A	N/A	The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-501
Tubing	SCI Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/5	0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip	CMLsupply	901-20-050	20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter	PALL	4650	Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe	Qosina	C3307	10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve	ColeParmer	FF-30600-23	Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin	McMaster-Carr	90145A317	18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube	Corning	CL S3206	0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube