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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans cet article, nous démontrons imagerie direct des individuels vers employant un dispositif microfluidique personnalisé. Dans l’appareil, vers plusieurs sont individuellement limités afin de séparer les compartiments, qui permettent des multiplexe surveillance longitudinale des divers processus biologiques.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, microfluidique techniques ont été appliquées à l’étude des petits animaux, y compris le nématode Caenorhabditis eleganset sont sont avérés utiles comme une plate-forme d’imagerie live pratique offrant des capacités pour un contrôle précis de la conditions expérimentales en temps réel. Dans cet article, nous démontrons imagerie direct des individuels vers employant WormSpa, un dispositif microfluidique personnalisé précédemment publiés. Dans l’appareil, vers plusieurs sont individuellement limités afin de séparer les compartiments, qui permettent des multiplexe surveillance longitudinale des divers processus biologiques. Pour illustrer la capacité, nous avons effectué des expériences de démonstration du principe dans lequel les vers ont été infectés dans l’appareil avec des bactéries pathogènes, et la dynamique de l’expression des gènes de la réponse immunitaire et la ponte ont été surveillée en continu, en particulier animaux. La conception simple et le fonctionnement de cet appareil le rendent approprié pour les utilisateurs qui n’ont aucune expérience avec des expériences axées sur la microfluidique. Nous proposons que cette approche sera utile pour beaucoup de chercheurs intéressés aux observations longitudinales des processus biologiques dans des conditions bien définies.

Introduction

Changements dans des conditions environnementales peuvent mener à l’activation de programmes génétiques accompagnée d’induction et de la répression de l’expression de gènes spécifiques1,2. Ces changements cinétiques peuvent être variable chez les tissus chez les mêmes animaux et entre les différents animaux. Études de tels programmes génétiques par conséquent appellent des méthodes qui permettent l’imagerie longitudinale de chaque animal et fournissent un contrôle dynamique précis des conditions environnementales.

Ces dernières années, des dispositifs fluidiques microfabriques ont été utilisés pour étudier les nombreux aspects de la réponse et le comportement chez de petits animaux, y compris les vers, les mouches, les ours de l’eau et plus3,4,5,6, 7. Les applications comprennent, par exemple, phénotypage profonde, optogenetic d’enregistrement de l’activité neuronale en réponse à des stimuli chimiques et le suivi des comportements moteurs tels que de la locomotion et pompage8,9,10 , 11.

Approches axées sur la microfluidique détiennent de nombreuses propriétés qui pourraient bénéficier à long terme imagerie longitudinale de la réponse aux signaux environnementaux, y compris un contrôle dynamique précis du microenvironnement local, conception flexible qui permet le maintien de la des animaux dans des quartiers séparés et les attributs favorables pour l’imagerie. Cependant, maintenir les animaux dans une chambre de microfluidique pendant une longue période avec un impact minimal indésirable sur leur bien-être est un défi qui demande une attention particulière à la conception du dispositif microfluidique, ainsi que dans l’exécution de l’expérience.

Nous démontrons l’utilisation de WormSpa, un dispositif microfluidique pour l’imagerie longitudinale de Caenorhabditis elegans. 5 vers individuels sont confinés dans les chambres. Un faible débit constant de suspension liquide et bactérienne garantit que les vers sont bien nourris et suffisamment actif pour rester en bonne santé et réduire le stress, et permet à la structure des chambres vers à pondre des œufs. La simplicité de la conception et l’exploitation de WormSpa devraient permettre des chercheurs qui n’ont aucune expérience en microfluidique à intégrer ce dispositif de leurs propres plans de recherche.

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Protocole

Le protocole ci-dessous utilise WormSpa5, un dispositif microfluidique décrite précédemment pour l’imagerie longitudinale de worms. Fabrication de WormSpa (à partir des fichiers CAO qui peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande) est simple mais nécessite une certaine expertise. Dans la plupart des cas, la fabrication peut être faite facilement par une installation de base ou par une entreprise commerciale qui fournit ces services. Lorsque la fabrication du dispositif, assurez-vous de spécifier que la hauteur des caractéristiques est de 50 µm.

1. expérimental

  1. Monter le dispositif microfluidique sur un microscope à fluorescence inversé avec une platine motorisée.
  2. Placer un agitateur orbital proche du microscope, mais veillez à ce que la vibration de l’agitateur n’affecte pas directement le microscope. Par exemple, mettre le vibreur sur un plateau fixé sur un mur qui ne fait aucun contact avec la table optique.
  3. Placez un pousse-seringue sur l’agitateur orbital. Scotchez le shaker de la pompe afin qu’il ne pas se trémousser en agitant.

2. préparation de l’environnement de la microfluidique

Remarque : Pendant l’expérience, quatre seringues sont connectés au dispositif microfluidique par des tubes de seringue, tel qu’indiqué dans la Figure 1. Cette étape décrit la préparation de ces seringues. Sauf mention contraire, garder les lampes de seringue aussi courts que possible sans les rendre tendue.

  1. Préparez une seringue de sortie et un tube de la seringue. Cette seringue (S1 à la Figure 1) sera plus tard branché sur la prise de l’appareil par le tube de la seringue et utilisé pour le stockage temporaire du liquide qui sort de l’appareil.
    1. Faire une aiguille adaptateur en enlevant les pièces en plastique d’une seringue de 20 x 1/2 pouce, gardant seulement l’aiguille (la partie métallique). Le faire en tenant les pièces en plastique et en métal avec des pinces les latéralement. Résidu de plastique sur l’aiguille peut être brûlé avec un bec Bunsen.
    2. Plier l’aiguille selon la géométrie de l’expérimental tout en maintenant ses deux extrémités avec une pince. Dans la conception décrite ici, la courbure de l’aiguille en son milieu à un angle de ~ 110° est plus pratique.
    3. Branchez l’aiguille de l’adaptateur à mi-chemin dans le tube. L’autre moitié sera plus tard être branché à l’appareil. Le tube de la seringue doit être compatible avec une seringue de 20 G sans une fuite (par exemple, les tubes avec un diamètre intérieur de 0,86 mm et un diamètre extérieur de 1,32 mm). La longueur de tube recommandé est de ~ 50 cm.
    4. Connecter une seringue de 10 mL luer-lock à l’autre extrémité (ouverte) du tube seringue via une seringue de 20 x 1/2 pouce.
  2. Préparer les seringues de tampon d’arrivée et de seringues des tubes. Un de ces seringues (S2 à la Figure 1) est utilisé comme un réservoir pour le liquide qui va dans le dispositif et pour contrôler le débit d’injection. Autre la seringue (S3 dans la Figure 1) est requis pour l’échange de la mémoire tampon, comme expliqué dans l’étape 3.2.
    1. Connectez une seringue luer-lock de 10 mL (S2) directement sur un robinet à 3 voies et une autre seringue (S3) à la vanne même via un tube de la seringue (Figure 1) : Branchez le S3 au tube via une seringue et le tube sur la vanne via un autre embout de la seringue.
      Remarque : L’ordre dans lequel ces matériaux est connectés est sans importance.
    2. Raccorder un tube de la seringue au port restant de la vanne 3 voies. Préparez une autre aiguille adaptateur comme au point 2.1.2 et branchez l’autre extrémité (ouverte) du tube de la seringue de l’aiguille à mi-chemin.
    3. Régler la soupape de telle sorte que le tube de la seringue à l’étape 2.2.2 et S2 sont connectés alors que S3 est fermé (Figure 1).
  3. Préparez une seringue de ver-entrée et un tube de la seringue. Cette seringue (S4 à la Figure 1) est utilisé pour charger les vers dans l’appareil.
    1. Raccorder un tube long de seringue à une seringue de luer lock 10 mL (S4). Déterminer la longueur de ce tube sur le volume du fluide qui sera utilisé pour le chargement ; par exemple, 100 cm de tube prend en charge plus de 2 mL de liquide (voir aussi, l’étape 4.2).
    2. Préparer une autre aiguille adaptateur comme au point 2.1.2 et branchez une moitié de l’aiguille à l’autre extrémité (ouverte) du tube de la seringue.
  4. Rincez toutes les seringues et tubes avec S-moyenne12 deux fois. Remplir les seringues et les tubes de S-medium, en prenant soin d’enlever toutes les bulles d’air.
  5. Connecter le tuyau de sortie seringue à la sortie de l’appareil.
    1. Branchez l’aiguille de l’adaptateur à l’extrémité du tube de la seringue pour l’orifice de sortie.
    2. Injecter un petit volume de S-moyenne par le biais de la prise pour remplir l’appareil, jusqu'à ce qu’un petit S-moyenne sort aussi bien l’entrée de la mémoire tampon et l’entrée du ver.
  6. Connecter le tuyau de la seringue tampon-prise sur le port de tampon d’arrivée de l’appareil, tout en branchant le ver-entrée avec une épingle (goupille de serrage en acier inoxydable d’un diamètre de 1/32 de pouce).
  7. Injecter un flux constant de mémoire tampon dans l’appareil. Chargez la seringue de la mémoire tampon d’arrivée S2 sur une seringue pompe13et mettre la pompe de telle sorte que le milieu en S2 est continuellement injecté dans l’appareil à un débit de 3 µL/min.

3. chargement de bactéries dans le dispositif microfluidique

  1. Préparer les Escherichia coli OP50 suspendu en S-moyenne de12.
    1. Suite à un protocole standard, inoculer un ballon de 250 mL avec 50 mL de LB et une seule colonie et incuber une nuit à 37 ° C.
    2. Centrifuger la culture nuitée à 4000 tr/min pendant 10 minutes et Resuspendre le culot dans 30 mL de S-milieu.
    3. La suspension filtrer sur un filtre de seringue de 5 µm. Mesurer la concentration de bactéries par sa densité optique à 600 nm (OD600) et ajuster la concentration à une OD600 de 3. Cette densité élevée est nécessaire pour garder les vers bien nourris.
  2. Échange de la mémoire tampon dans le dispositif avec la suspension OP50.
    1. Préparez une seringue propre (S5) remplie avec la suspension OP50. Tenez la seringue verticalement et tapoter plusieurs fois pour recueillir toutes les bulles d’air en haut.
    2. Tournez la vanne 3 voies des seringues tampon-entrée pour fermer la connexion à l’appareil et branchez les deux seringues, S2 et S3. Rester en S2 le pousse-seringue.
    3. Débrancher le S2 de la valve et S5 à la valve. Faire sortir tout l’air recueillie dans la partie supérieure de la S5 à S3 à travers la valve jusqu'à ce qu’un peu de la mémoire tampon OP50 passe en S3. Pour ce faire, assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne reste en S5 ou la valve.
    4. Tournez la vanne 3 voies à la position d’origine pour fermer la connexion entre S3 et S5 et connecter S5 à l’appareil. Télécharger S5 sur le pousse-seringue. Allumez l’agitateur orbital qui maintient la pompe. Régler la vitesse d’agitation à environ 200 tr/min.
    5. Régler le débit à 100 µL/min. Le temps que nécessaire pour la nouvelle mémoire tampon arriver à la worms dans l’appareil dépend de la longueur du tampon d’arrivée seringue tube (environ 5 minutes avec le tube décrit ci-dessus). Un débit plus élevé peut être utilisé si un échange plus rapide de tampon est requis.
    6. Une fois que le tampon OP50 se répand dans l’appareil, régler le débit à 3 µL/min.

4. chargement de Worms dans le dispositif microfluidique

  1. Préparer un tube de microcentrifuge de liaison faible petit (650 µL) et remplissez-le avec 100 µL de suspension OP50. Transfert autour de 20-30 synchronisé âge jeune pick de vers adultes (46 heures après l’arrestation de larves L1 à 25 ° C) d’une boîte de gélose NGM (milieu de croissance nématode) au tube en les choisissant un par un avec un ver. Âge-synchronisation peut se faire suite à un protocole standard de12.
  2. Remplir à l’entrée du ver-seringue et seringue tube (S4 à la Figure 1) avec la suspension OP50. Injecter ~ 500 µL du liquide dans le tube de microcentrifuge avec worms. Dessiner la suspension avec vers dans le tube de seringue ver-entrée. Assurez-vous que le tube de la seringue est assez longue (> 1 m) et que dessiné vers restent dans le tube de la seringue et ne pas faire tout le chemin à la seringue S4.
  3. Se connecter à S4 au ver-d’eau. Injecter tous les vers dans le tube de seringue ver-entrée dans le dispositif microfluidique. Déconnectez le S4 et le tube de la seringue. Brancher l’entrée-ver avec une épingle.
  4. Débrayer la seringue de la mémoire tampon d’arrivée S2 de la pompe mécanique ( Figure 1) et contrôler manuellement les S1 et S2 pour pousser tous les vers dans les canaux distincts. Appuyant sur S2 se déplaceront vers dans les canaux, tout en appuyant sur S1 eux se déplace dans le sens inverse. Une fois qu’un canal est chargé, le ver dans chaque canal se bloque l’entrée des autres vers.
  5. Permet dajuster worms au nouvel environnement pendant 2-3 heures.

5. mise en place d’un protocole d’imagerie

  1. Trouver tous les vers qui sont solidement intégrés à l’appareil et définir une position d’imagerie pour chacun d’eux dans le logiciel d’acquisition image qui contrôle votre microscope. Notez que dans certains cas (par exemple lorsque vous souhaitez un grossissement supérieur ou lors de l’utilisation de caméras avec un petit capteur CCD) postes d’imagerie multiples sont nécessaires pour chaque canal.
    Remarque : Même si cela peut se faire manuellement, certains paquets de logiciels d’acquisition peuvent charger un fichier texte qui répertorie les postes où les images doivent être prises. Étant donné que ces postes sont régulièrement classés en WormSpa, un utilisateur peut écrire un petit script (par exemple, en Python ou des logiciels commerciaux) qui crée automatiquement une telle liste. Le format précis de ce script dépend le format de fichier attendu par le logiciel d’acquisition (voir un exemple dans 1 de matériel supplémentaire).
  2. Définissez la fréquence requise de l’imagerie Time-lapse. Par exemple, l’imagerie de la réponse immunitaire de gène à l’infection se fait à une fréquence de 10 minutes par image. Assurez-vous que tous les canaux nécessaires (p. ex. lumineux-zone et la fluorescence GFP) sont acquis à chaque instant.

6. l’hôte de réponse à l’infection par Pseudomonas

Remarque : Cette étape est spécifique pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Alternativement, on peut préparer une mémoire tampon qui contient les autres signaux environnementaux d’intérêt (facteurs de stress biotiques et abiotiques, médicaments, signalisation des molécules, etc.).

  1. Préparer les Pseudomonas aeruginosa PA14 suspendu dans SK-médium14.
    1. Ensemencer un ballon de 250 mL avec 50 mL de LB et une seule colonie et incuber une nuit à 37 ° C.
    2. Ensemencer un autre flacon de 250 mL avec 50 mL de LB et une partie aliquote de la culture et incuber une nuit à 37 ° C.
    3. Centrifuger la culture nuitée à 4000 tr/min pendant 10 minutes et Resuspendre le culot dans 10 mL de SK-milieu. Mesurer la concentration bactérienne et ajuster la concentration d’OD600 = 4.
    4. Transférer la suspension dans un ballon propre et incuber à 37 ° C pendant 24 heures et à 25 ° C pendant 24 heures en agitant. Cette étape imite l’étape d’incubation plaque dans la norme tuant test14.
    5. La suspension filtrer sur un filtre de seringue de 5 µm. Il s’agit pour empêcher des agrégats bactériens de boucher l’appareil.
  2. Remplacer la suspension OP50 dans le dispositif avec la suspension de PA14, suivant la même procédure que dans l’étape 3.2. Garder l’imagerie pendant 10 heures.

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Résultats

Âge-synchronisée jeunes adultes vers (46 heures après arrestation larve L1 à 25 ° C)12 ont été chargés dans l’appareil, tel que décrit dans le protocole. Les vers se trouvaient individuellement dans des canaux séparés, ce qui permet de mesure longitudinale de la réponse des animaux à l’agent pathogène. Quand l’expérience est réussie, la plupart vers restent dans leurs rainures pour la durée de l’expérience. Dans ce cas, les images de worms...

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Discussion

Microfluidique outils offrent plusieurs avantages dans l’étude de worms. Imagerie dans un PDMS dispositif offre une meilleure qualité d’imagerie par rapport à une norme gélose NGM. Plusieurs images peuvent provenir d’un seul ver, contrairement aux méthodes traditionnelles dans lesquelles les animaux est cueillies sur la plaque et montée sur une lame de microscope pour l’imagerie. En outre, le microenvironnement dans lequel résident les vers peut être maintenu constant ou modulé comme vous le souhaitez, p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par la National Science Foundation, par le biais de subventions PHY-1205494 et MCB-1413134 (EL) et par la 2017R1D1A1B03035671 de subvention National Research Foundation of Korea (KSL).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
WormSpaN/AN/AThe CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound MicroscopeZeissAxioObserver Z1An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE-501
TubingSCI Scientific Commodities Inc.BB31695-PE/50.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe TipCMLsupply901-20-05020 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe FilterPALL4650Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
SyringeQosinaC330710 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way ValveColeParmerFF-30600-23Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel PinMcMaster-Carr90145A31718-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge TubeCorningCL S32060.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube

Références

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