Una plataforma de microfluidos para la proyección de imagen Longitudinal en Caenorhabditis elegans

Resumen

En este artículo demostramos en proyección de imagen de gusanos individuales empleando un dispositivo de microfluidos personalizado. En el dispositivo, gusanos varios individualmente se limitan para separar compartimientos, lo que permite vigilancia longitudinal multiplexada de varios procesos biológicos.

Resumen

En la última década, microfluidos técnicas se han aplicado para el estudio de pequeños animales, tales como el nematodo Caenorhabditis elegansy han demostrado ser útiles como plataforma de proyección de imagen vivo conveniente proporciona capacidades para un control preciso de condiciones experimentales en tiempo real. En este artículo demostramos en proyección de imagen de gusanos individuales empleando WormSpa, un dispositivo de microfluidos personalizado publicado previamente. En el dispositivo, gusanos varios individualmente se limitan para separar compartimientos, lo que permite vigilancia longitudinal multiplexada de varios procesos biológicos. Para ilustrar la capacidad, se realizaron experimentos de prueba de principio en que gusanos estaban infectados en el dispositivo con bacterias patógenas, y la dinámica de la expresión de genes de respuesta inmune y la puesta de huevos fueron monitoreada continuamente en individuo animales. El diseño simple y la operación de este dispositivo hacen conveniente para los usuarios sin experiencia previa con experimentos basados en microfluidos. Proponemos que este enfoque sea útil para muchos investigadores interesados en observaciones longitudinales de los procesos biológicos en condiciones bien definidas.

Introducción

Cambios en las condiciones ambientales pueden conducir a la activación de programas genéticos acompañados de inducción y represión de la expresión de genes específicos^1,2. Estos cambios cinéticos puede variar entre los tejidos en los mismos animales y entre diferentes animales. Estudios de los programas genéticos por lo tanto llaman a los métodos que permite la proyección de imagen longitudinal de los individuos y proporcionar control preciso de la dinámico de las condiciones ambientales.

En los últimos años se han utilizado dispositivos fluídicos recientemente para estudiar muchos aspectos de la respuesta y comportamiento en pequeños animales, incluyendo gusanos, moscas, osos de agua y^3,más de^{4,5,6, 7}. Las aplicaciones incluyen, por ejemplo, profundo phenotyping, optogenetic registro de la actividad neuronal en respuesta a estímulos químicos y el seguimiento de comportamientos motores como locomoción y bombeo^{8,9,10 , 11}.

Enfoques basados en microfluidos sostener muchas propiedades que podrían beneficiar a la proyección de imagen longitudinal a largo plazo de respuesta a señales ambientales, incluyendo un control dinámico preciso del microambiente local, diseño flexible que permite el mantenimiento de animales individuales en cuartos separados y los atributos favorables para la proyección de imagen. Sin embargo, mantener los animales en una cámara de microfluidos durante mucho tiempo con el mínimo impacto adverso sobre los seres de bien es un desafío, que requiere particular cuidado en el diseño del dispositivo microfluídico, así como en la ejecución del experimento.

Aquí se demuestra el uso de WormSpa, un dispositivo de microfluidos para la proyección de imagen longitudinal de Caenorhabditis elegans. ⁵ gusanos individuales están confinados en las cámaras. Un flujo constante baja de la suspensión bacteriana y líquido garantiza que gusanos están bien alimentados y suficientemente activa para mantener una buena salud y aliviar el estrés, y la estructura de las cámaras permite gusanos que ponen huevos. La simplicidad del diseño y operación de WormSpa deben permitir a los investigadores sin experiencia previa en microfluídica para incorporar este dispositivo en sus propios planes de investigación.

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Protocolo

El protocolo siguiente utiliza WormSpa⁵, un dispositivo de microfluidos descrito previamente para la proyección de imagen longitudinal de gusanos. Fabricación de WormSpa (a partir de archivos CAD que se pueden obtener de los autores a petición) es sencillo pero requiere algo de experiencia. En la mayoría de los casos, fabricación puede fácilmente hacerse por un centro base o por una empresa comercial que proporciona tales servicios. Cuando la fabricación del dispositivo, asegúrese de especificar que la altura de las características es de 50 μm.

1. experimental configuración

1. Monte el dispositivo de microfluidos en un microscopio de fluorescencia invertido con una platina motorizada.
2. Coloque un agitador orbital cerca del microscopio, pero asegúrese de que la vibración de la coctelera no afecta directamente al microscopio. Por ejemplo, poner el vibrador en un estante fijado en una pared que no hace ningún contacto con la mesa óptica.
3. Coloque una bomba de la jeringuilla en el agitador orbital. Cinta de la bomba a la coctelera para que no agitan agitando.

2. preparación del entorno de microfluidos

Nota: Durante el experimento, cuatro jeringas están conectadas al dispositivo de microfluidos vía los tubos de jeringa, como se indica en la figura 1. Este paso describe la preparación de estas jeringas. Se indique lo contrario, mantener los tubos de jeringa tan cortos como sea posible sin lo que tensa.

1. Preparar una jeringa de toma y un tubo de la jeringa. Esta jeringa (S1 en la figura 1) será más tarde a la salida del dispositivo a través del tubo de la jeringa y utilizado para el almacenamiento temporal del líquido que sale del dispositivo.
   1. Hacer una aguja adaptador quitando las piezas de plástico de una punta de la jeringa de 20 x 1/2 pulgada, manteniendo sólo la aguja (la parte metálica). Lo hacen manteniendo las piezas de plástico y de metal con pinzas y tirando de ellos aparte. Residuo plástico de la aguja puede ser quemado con un mechero de Bunsen.
   2. Doblar la aguja según la geometría de la disposición experimental mientras sostiene sus dos extremos con pinzas. En el diseño descrito aquí, es más conveniente doblar la aguja en su centro un ángulo de ~ 110°.
   3. Conecte la aguja adaptador la mitad en el tubo. La otra mitad más tarde va a ser conectada en el dispositivo. El tubo de la jeringa debe ser compatible con una punta de la jeringa de 20 G sin una pérdida (por ejemplo, tubería con diámetro interno de 0,86 mm y diámetro externo de 1,32 mm). La longitud del tubo recomendado es de 50 cm.
   4. Conecte una jeringa de 10 mL luer-lock al otro extremo del tubo de la jeringa a través de una punta de la jeringa de 20 x 1/2 pulgada (abierto).
2. Preparación buffer entrada jeringas y tubos de jeringa. Una de estas jeringas (S2 en la figura 1) se utiliza como reservorio para el líquido que va en el dispositivo y para controlar el flujo de inyección. La otra jeringa (S3 en la figura 1) se requiere para cambio de tampón, como se explica en el paso 3.2.
   1. Conecte la jeringa de 10 mL luer-lock (S2) directamente a una válvula de 3 vías y otra jeringa (S3) a la misma válvula a través de un tubo de la jeringa (figura 1): Conecte S3 al tubo mediante una punta de la jeringa y conectar el tubo a la válvula por otra punta de la jeringa.
      Nota: No importa el orden en que estos materiales están conectados.
   2. Conecte un tubo de la jeringa al puerto restante de la válvula de 3 vías. Preparar otra aguja adaptador como en el paso 2.1.2 y conecte la aguja medio en el otro extremo (libre) del tubo de la jeringa.
   3. Ponga la válvula de tal manera que el tubo de la jeringa en el paso 2.2.2 y S2 están conectados mientras que S3 está cerrado (figura 1).
3. Preparar una jeringa de gusano-entrada y un tubo de la jeringa. Esta jeringa (S4 en la figura 1) se utiliza para la carga de gusanos en el dispositivo.
   1. Conecte un tubo largo de jeringa a jeringa de 10 mL luer-lock (S4). Determinar la longitud de este tubo del volumen del líquido que se utilizará para la carga; por ejemplo, 100 cm de la tubería soporta más 2 mL de líquido (también, vea el paso 4.2).
   2. Preparar otra aguja adaptador como en el paso 2.1.2 y enchufe a una mitad de la aguja al otro extremo del tubo de jeringa (abierto).
4. Enjuague todas las jeringas y tubos con medio S¹² dos veces. Llene las jeringas y los tubos con medio de S, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire.
5. Conecte el tubo de salida de la jeringa a la salida del dispositivo.
   1. Conecte la aguja adaptador en el extremo del tubo de la jeringa en el orificio de salida.
   2. Inyectar un pequeño volumen de medio de S a través de la toma para llenar el dispositivo, hasta que un poco S-medio sale de la entrada del buffer y la entrada del gusano.
6. Conecte el tubo de jeringa buffer entrada al puerto de entrada de buffer del dispositivo, mientras conectas la entrada del gusano con un pasador (perno de pasador de acero inoxidable con un diámetro de 1/32 de pulgada).
7. Inyectar un flujo constante de buffer en el dispositivo. Cargue la jeringa buffer entrada S2 en un jeringa bomba¹³y ajustar la bomba de tal forma que el medio en el S2 se inyecta continuamente en el dispositivo con un caudal de 3 μl/min.

3. carga de bacterias en el dispositivo de microfluidos

1. Preparar OP50 de Escherichia coli en medio S¹².
   1. Siguiendo un protocolo estándar, inocule un frasco de 250 mL con 50 mL de LB y una sola Colonia e incubar durante una noche a 37 ° C.
   2. Centrifugue la cultura durante la noche a 4000 rpm durante 10 minutos y resuspender el precipitado en 30 mL de medio de S.
   3. Filtrar la suspensión a través de un filtro de jeringa de 5 μm. Medir la concentración bacteriana por su densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) y ajustar la concentración a un OD₆₀₀ de 3. Esta alta densidad es necesaria para mantener bien alimentado a los gusanos.
2. Intercambiar el buffer en el dispositivo con la suspensión OP50.
   1. Preparar una jeringa limpia (S5) con la suspensión OP50. Sostenga la jeringa en posición vertical y pulse varias veces para recoger todas las burbujas de aire en la parte superior.
   2. Gire la válvula de 3 vías de las jeringas de entrada búfer para cerrar la conexión con el dispositivo y conectar las dos jeringas, S2 y S3. Desenganche el S2 de la bomba de jeringa.
   3. Desconecte el S2 de la válvula y conecte S5 a la válvula. Expulsar todo el aire recogido en la parte superior del S5 S3 a través de la válvula hasta un poco del búfer OP50 va en S3. Al hacerlo, asegúrese de que ninguna burbuja de aire queda en S5 o la válvula.
   4. Gire la válvula de 3 vías a la posición original para cerrar la conexión entre S3 y S5 y conectarse al dispositivo de S5. S5 de carga en la bomba de jeringa. Encender el agitador orbital que contiene la bomba. Ajustar la velocidad de agitación a aproximadamente 200 rpm.
   5. Fijar el caudal a ser 100 μl/min. El tiempo que tarda el nuevo búfer llegar a los gusanos en el dispositivo depende de la longitud del tubo de la jeringa del buffer de entrada (alrededor de 5 minutos con el tubo descrito anteriormente). Una mayor tasa de flujo se puede emplear si se requiere un cambio de buffer más rápido.
   6. Una vez que el buffer OP50 se disemina por todo el dispositivo, fijar el caudal a 3 μl/min.

4. carga de gusanos en el dispositivo de microfluidos

1. Preparar un tubo de microcentrífuga de atascamiento bajo pequeño (650 μL) y llenarlo con 100 μl de suspensión OP50. Transferir alrededor de 20-30 joven edad-que sincronizados recoger gusanos adultos (46 horas post detención larvas L1 a 25 ° C) de una placa de agar de la NGM (medio de cultivo nematodos) al tubo de ellos escogiendo uno a uno con un gusano. Edad-sincronización puede hacerse siguiendo un protocolo estándar de¹².
2. Llenar la entrada de gusano jeringa y jeringa tubo (S4 en la figura 1) con la suspensión OP50. Inyecte ~ 500 μl del líquido en el tubo de microcentrífuga con gusanos. Dibujar la suspensión con gusanos en el tubo de jeringa de gusano-entrada. Asegúrese de que el tubo de la jeringa es lo suficientemente larga (> 1 m) y que gusanos dibujadas en el tubo de la jeringa y no hacen todo el camino a la jeringa S4.
3. Conecte el S4 a la entrada del gusano. Inyectan todos los gusanos en el tubo de la jeringa de gusano-entrada en el dispositivo de microfluidos. Desconecte el S4 y el tubo de la jeringa. Conecte la entrada del gusano con un alfiler.
4. Desconectar la jeringa del buffer entrada S2 de la bomba mecánica ( figura 1) y controlar manualmente S1 y S2 para empujar todos los gusanos en canales separados. Presionando S2 se mueven gusanos en los canales, mientras que presionar S1 se moverá en la dirección contraria. Una vez cargado un canal, el gusano en cada canal bloqueará la entrada de otros gusanos.
5. Permite gusanos ajustar al nuevo ambiente durante 2-3 horas.

5. establecer un protocolo de la proyección de imagen

1. Encontrar todos los gusanos que están situados firmemente en el dispositivo y establecer una posición de la proyección de imagen para cada uno de ellos en el software de adquisición de imagen que controla su microscopio. Tenga en cuenta que en algunos casos (por ejemplo, cuando se desea mayor aumento, o cuando se usan cámaras con un sensor CCD más pequeño) múltiples posiciones de proyección de imagen se requieren para cada canal.
   Nota: Mientras que esto puede hacerse manualmente, algunos paquetes de software de adquisición pueden cargar un archivo de texto que muestra las posiciones donde deben tomarse imágenes. Desde estas posiciones se ordenan regularmente en WormSpa, un usuario puede escribir un pequeño script (por ejemplo, en Python o software comercial) que crea automáticamente dicha lista. El formato exacto de este script depende el formato esperado por el software de adquisición (véase un ejemplo en 1 Material complementario).
2. Fijar la frecuencia deseada de la proyección de imagen de Time-lapse. Por ejemplo, proyección de imagen del gene inmune ante la infección se realiza a una frecuencia de 10 minutos por capítulo. Asegúrese de que todos los canales necesarios (por ejemplo, de campo claro y la fluorescencia de GFP) se adquieren en cada momento.

6. el anfitrión respuesta a la infección por Pseudomonas

Nota: Este paso es específico para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Alternativomente, uno puede preparar un buffer que contiene otras señales ambientales de interés (factores de estrés bióticos y abióticos, drogas, señalización de moléculas, etc.).

1. Preparar PA14 de Pseudomonas aeruginosa en medio SK¹⁴.
   1. Inocular un frasco de 250 mL con 50 mL de LB y una sola Colonia e incubar durante una noche a 37 ° C.
   2. Inocular en otro matraz de 250 mL con 50 mL de LB y una alícuota de la cultura e incubar durante una noche a 37 ° C.
   3. Centrifugue la cultura durante la noche a 4000 rpm durante 10 minutos y resuspender el precipitado en 10 mL de medio de SK. Medir la concentración bacteriana y ajustar la concentración de OD₆₀₀ = 4.
   4. Trasvasar la suspensión a un matraz limpio e incubar a 37 ° C durante 24 horas y a 25 ° C durante 24 horas agitando. Este paso imita el paso de incubación de la placa en el estándar matando ensayo¹⁴.
   5. Filtrar la suspensión a través de un filtro de jeringa de 5 μm. Esto es para evitar agregados bacterianos obstruyan el dispositivo.
2. Reemplazar la suspensión OP50 en el dispositivo con la suspensión de PA14, siguiendo el mismo procedimiento como en el paso 3.2. Mantener la proyección de imagen de 10 horas.

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Resultados

Gusanos adultos jóvenes edad sincronizado (46 horas post detención larvas L1 a 25 ° C)¹² fueron cargados en el dispositivo, como se describe en el protocolo. Los gusanos fueron situados individualmente en canales separados, permitiendo la medición longitudinal de la respuesta de los animales al patógeno. Cuando el experimento tiene éxito, la mayoría gusanos permanecen en sus canales para la duración del experimento. En este caso, se toman imágenes de los g...

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Discusión

Herramientas de microfluidos proporcionan múltiples beneficios en el estudio de gusanos. Proyección de imagen en un PDMS dispositivo ofrece mayor calidad de imagen en comparación con una placa de agar estándar de NGM. Varias imágenes se pueden tomar de un solo gusano, a diferencia de métodos tradicionales en que animales son recogidos de la placa y montados en un portaobjetos para la proyección de imagen. Además, el microambiente en el cual residen gusanos se puede mantener constante o modulado según se desee, p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
WormSpa	N/A	N/A	The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-501
Tubing	SCI Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/5	0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip	CMLsupply	901-20-050	20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter	PALL	4650	Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe	Qosina	C3307	10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve	ColeParmer	FF-30600-23	Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin	McMaster-Carr	90145A317	18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube	Corning	CL S3206	0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube