基于流式细胞仪的 Zika 病毒疗养血清测定登革热病毒的体外抗体依赖性

摘要

我们描述了一个简单和简单的协议, 以测量抗体依赖性增强感染的 Zika 病毒恢复血清使用登革热病毒报告病毒粒子。

摘要

抗体依赖性增强感染已被证明在登革热病毒发病机制中发挥重要作用。传统的测定抗体或血清能力以增强不允许细胞系感染的方法, 依赖于在培养基中使用病毒输出, 然后用斑块化验来量化感染。最近, 这些化验已经检查了登革热病毒 (DENV) 感染的细胞系使用荧光标记抗体。这两种方法都限制了这些技术的广泛使用。在这里, 我们描述一个简单的体外试验, 使用登革病毒报告病毒微粒 (RVPs), 表达绿色荧光蛋白和 K562 细胞, 以检查抗体依赖性增强 (艾德) DENV 感染的血清, 从恒河猴获得猕猴感染 Zika 病毒后16周 (ZIKV)。这种技术是可靠的, 涉及对细胞的最小操纵, 不涉及使用活复制主管病毒, 并可以执行高吞吐量格式, 以获得定量读数使用流式细胞术。此外, 这种检测可以很容易地适应检查其他黄感染的抗体依赖增强 (艾德), 如黄热病病毒 (YFV), 日本马脑炎病毒 (JEEV), 西尼罗河病毒 (WNV) 等 RVPs 可用。建立测试、分析数据和解释结果的简便性使其对大多数实验室设置非常适合。

引言

抗体依赖性增强 (艾德) 感染是一个过程, 其中部分交叉反应抗体的反应, 由一个血清型的病毒增强吸收另一种血清型病毒, 导致增加病毒复制和病毒血症。艾德已广泛记录在登革热病毒 (DENV) 感染, 其中四主要血清型流行。在患者的一小部分, 艾德与登革热出血热 (DHF) 有关。我们最近表明, Zika 病毒 (ZIKV) 感染引起明显的 DENV 交叉反应抗体应答, 导致 DENV体外, 并可能有助于增强 DENV 病毒血症在体内 1^,2. 抗体依赖性增强检测是评估抗体增强继发感染相关病毒能力的宝贵工具, 并为黄感染的发病机制提供有价值的见解, 并告知疫苗的研制。

这里描述的化验使用 DENV RVPs 和 K562 细胞通常不允许感染。RVPs 是结构上完整的复制不称职的 DENV 病毒粒子, 编码一个亚基因组绿色荧光蛋白 (GFP) 传代, 在一轮复制³后表示。因此, 感染 RVPs 的细胞荧光绿色, 可以通过流式细胞术或显微镜随时检测到。本试验中使用的 RVPs 是从商业来源获得的。但是, 它们可以生成针对其他病毒, 并用于本手稿中描述的化验。同时, K562 细胞是一种 FcγIII 受体表达的白血病细胞系, 与抗体 Fc 区结合, 并在抗体^4,5的亚中和浓度存在时感染。

在调查严重登革热危险因素的研究中广泛使用了艾德测定法, 并描述了体外的机制^6,7,8。在这里描述的艾德化验可以快速和容易地用来确定血清的能力, 以提高体外感染使用 RVPs 和流式细胞术, 与目前使用的其他化验相比, 这需要确定的斑块形成单位 (pfu) 在维罗细胞或抗体染色的感染细胞^{6,7,8,9,10,11}, 这两个都是时间消耗和劳动力密集。

研究方案

用于证明此处描述的议定书的血清样本取自恒河猴, 这些猕猴是根据当地、州和联邦政策在实验室动物护理评估和鉴定协会中所安置和照顾的。国际 (AAALAC) 认证的设施。所有动物实验都经过机构动物护理和使用委员会的审查和批准, 并通过组织分享协议获得样本。

1. 1 天

注: 执行下面描述的所有步骤, 在一个不育层流生物安全柜用于组织培养在 BSL-2 实验室。

1. 在室温下解冻血清样品, 将每个血清样本的100µL 转移到无菌管。在56°C 中, 无论是在水浴中还是在温度可调的 thermomixer 中, 热灭活30分钟。使10倍的血清标本序列稀释从1:1 到 1:1, 000 使用冷 RPMI-10 (RPMI 与10% 胎牛血清)。
2. 将10µL 的连续稀释血清样品转移到无菌96井 V 型底板的每一个井中。包括两套控制井, RPMI-10 只 RVPs, 无血清样本, RPMI-10 无 RVPs, 无血清标本。在 triplicates 中设置每个血清样本和 RPMI-10 控制。
3. 从-80 °c 冰箱中取出 Dengue-1、2、3和 4 RVPs, 并在37摄氏度水浴中解冻。将解冻的 RVPs 立即转移到冰上。获得大约170µL RVPs 为每个血清样品 (10 µL RVPs x 3 井为每个血清稀释 (1:1, 1:10, 1:100, 1:1, 000) 和10µL RVPs x 3 井为每个 RPMI-10 与仅 RVP 控制井)。
4. 吸管10µL RVPs 入96井 V 底板的每个井中, 含有血清样本, 并与 RVPs (无血清) 控制井 RPMI-10。请勿将 RVPs 添加到 RPMI-10 (无血清样本和 RVP) 井。通过吹打上下5–10时间彻底混合。添加10µL 冷 RPMI-10 代替 RVPs 每冷 RPMI-10 (无血清样本和无 RVP) 控制井。
5. 将96井 V 型底板转移到孵化器中, 在 5% CO₂的存在下, 在37摄氏度处孵化出1小时的板材。当96井 V 型底板正在孵化时, 用70% 乙醇清洁生物安全柜的表面, 并运行紫外光15分钟。
6. 从孵化器中移除一个完全汇合的 T75 瓶 K562 细胞, 用不育的5毫升吸管混合细胞, 并将5毫升细胞转移到无菌15毫升锥形管。
   注意: K562 细胞保持在 RPMI-10 和传代 1 x 10⁶/毫升。
7. 通过从无菌15毫升圆锥管中取出10µL 细胞, 并与10µL tryphan 蓝混合, 计算细胞数。使用 hemocytometer 计算单元格, 以确定15毫升圆锥管中的细胞总数。
8. 离心机15毫升圆锥细胞在 ~ 1200 x g 10 分钟, 醒酒上清, 并并用重悬在温暖 RPMI-10 的细胞集中 8万 cells/30 µL 的媒体 (2.66 x¹⁰ 6 细胞/毫升)。
9. 从孵化器 (步骤 1.6) 卸下96井 V 型底板, 将30µL 的 K562 细胞转移到96井 V 底板的每一个井中, 并通过吹打上下5–10时间彻底混合。将96井 V 底板转移到孵化器, 并在 5% CO₂的存在下, 在37摄氏度的情况下孵化出1小时的板材。
10. 孵化1小时后, 从孵化器和离心机中取出96井 V 型底板, 在 1200 x g 处进行5分钟。离心后, 醒酒介质从井中翻转到一个装有10% 漂白剂的容器中。
11. 通过在125µL 的温暖 RPMI-10 中 resuspending 它们, 将它们洗净, 并将其与吸管完全混合, 并将盘子在 1200 x 克上离心5分钟. 醒酒介质时, 将盘子翻转成含有10% 漂白剂的容器。重复这个洗涤步骤两次。
12. 洗涤后, 添加100µL 的温暖 RPMI-10 的每一个井, 混合上下与吸管, 并孵化在37摄氏度48小时的板存在 5% CO₂。

2. 3 天

1. 从孵化器中取出含有100µL 细胞和介质的96井 V 型底板, 并将其移到生物安全柜中。使用多通道吸管, 混合每个井的内容, 并将细胞和介质转移到96井 U 型底板上, 或预先标记5毫升聚丙烯管。
2. 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 用100µL 1% 多聚甲醛 (煤灰) 的96井 V 底板冲洗每一口井, 并将其转移到96井 U 型底板上的相应井中, 或从步骤5中标记为2.1 毫升聚丙烯管, 从而产生最终浓度为0.5% 粉煤灰/井或管。彻底混合使用多通道吸管, 用铝箔盖住盘子, 让它在孵化器里坐30分钟来修复细胞。
3. 准备流式细胞仪 (例如, 请参见材料表), 方法是运行无瑕 K562 单元格来校准侧面和正向散射以及荧光设置。唯一需要的荧光通道是 FL1, 因为 GFP 是唯一从细胞中发出的荧光。从每个样品中获取 ~ 30,000–50,000 细胞。
   注: 任何能够读取单个荧光的流式细胞仪都可用于获取数据, 因为感染 RVPs 的单元格只会由于 GFP 的存在而发出绿色荧光, 并且不需要其他荧光通道。

3. 数据分析

1. 使用任何流式细胞仪分析软件 (见材料表) 分析在流动检测器上获取的数据。
   1. 设置第一个门基于 FSC-A (正散射–区域) vs FSC H (正向散射–高度), 以包括单个单元格, 并排除从分析¹²自动荧光双峰。然后, 基于 SSC (侧向散射-区域) 与 FSC a 的门单线态门控单元, 以排除任何 autofluorescent 碎片。
   2. 分析 ssc-a vs FSC-一个门控细胞的表达的 gfp 基于 SSC-a 与 gfp a。通过在 gfp + 单元格周围设置一个门, 确定 gfp + 细胞对每个稀释血清和控制样本的百分比。
2. 通过将三人三井中 gfp + 细胞的总百分比除以 3, 确定每种血清样品稀释和控制井的 gfp + 细胞的平均百分比。
3. 通过除以血清中 gfp + 细胞的平均百分比来计算感染的褶皱增强, 每个稀释除以 RPMI-10 中 gfp + 细胞的平均百分比与 RVPs (无血清样本) 控制井。
4. 图形折叠增强 (y 轴) 与稀释 (x 轴), 并进行统计分析使用方差后, Tukey 的特殊测试的多比较。

结果

4只恒河猴的血清在感染 ZIKV 16 周后被采集, 并经过测试, 以增强 DENV-1、2、3和 4 K562 细胞感染的潜能。这些动物的峰值病毒血症为 1 x¹⁰ 5 的 ZIKV RNA/毫升血浆在3天后, 感染后, 下降到低于检测限度的水平, 在感染后7天。16周后感染后, 血浆中未发现病毒血症。然后, 对 RVP 进行了分析, 并对所收集的数据进行了研究, 如上述协议所述。

讨论

Flaviviruses, 如 DENV 和 ZIKV, 在其结构和非结构蛋白中都有明显的同源性, 它们产生的抗体相互相互反应^13,14。这些交叉反应抗体反应已被证明, 以增强感染的体内和体外与异种血清或其他相关 flaviviruses^1,2。交叉增强感染的潜力对疾病的管理和疫苗的开发有着重要的影响。

传统的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348