A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

Resumo

Descreveremos um protocolo simples e fácil para medição de reforço dependente de anticorpo da infecção por Zika vírus soro convalescente usando partículas virais da Dengue vírus repórter.

Resumo

Realce dependente de anticorpo da infecção foi mostrado para jogar um papel importante na patogênese viral de Dengue. Os ensaios tradicionais que medem a capacidade dos anticorpos ou soro para aumentar a infecção em linhas celulares impermissible têm invocado usando saída viral na mídia seguida de ensaios de placa para quantificar a infecção. Mais recentemente, estes ensaios examinaram a infecção por vírus (DENV) Dengue em linhas celulares usando anticorpos fluorescente etiquetados. Ambas as abordagens têm limitações que restringem o uso generalizado destas técnicas. Aqui, descrevemos um ensaio simples em vitro usando Dengue vírus repórter partículas virais (RVPs) que expressam a proteína verde fluorescente e células K562 para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de infecção DENV usando soro que foi obtido a partir do rhesus macacos de 16 semanas após a infecção com vírus Zika (ZIKV). Esta técnica é confiável, envolve manipulação mínima das células, não envolve a utilização de vírus competente de replicação ao vivo e pode ser executada em um formato de alta taxa de transferência para obter uma leitura quantitativa usando citometria de fluxo. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de outros flavivirus infecções tais como o vírus da febre amarela (YFV), vírus da encefalite equina japonesa (LILICA), vírus do Nilo Ocidental (WNV) etc onde RVPs estão disponíveis. A facilidade de criação de ensaio, analisando os dados e interpretação de resultados tornam altamente receptivos a maioria das configurações de laboratório.

Introdução

Reforço de dependente de anticorpos (ADE) da infecção é um processo pelo qual respostas parcialmente cross-reactive anticorpos induzidas por um sorotipo de vírus aumenta a absorção de outro sorotipo do vírus, levando a virémia e aumento de replicação viral. ADE tem sido extensivamente documentada em infecções por vírus (DENV) Dengue onde quatro sorotipos principais são predominantes. Em um subconjunto de pacientes, ADE está associada com febre hemorrágica da Dengue (FHD). Recentemente mostramos que infecção por vírus (ZIKV) Zika induzido níveis significativamente elevados de respostas de anticorpos cross-reactive DENV que causou ADE de DENV em vitro e provavelmente contribuíram para o reforço da virémia no vivoDENV^{1 , 2}. ensaios de realce dependente de anticorpo são uma ferramenta valiosa para avaliar a capacidade dos anticorpos para melhorar a infecção secundária com vírus relacionados e fornecer insights valiosos sobre a patogênese das infecções flavivirus e informar o desenvolvimento de vacinas.

O ensaio descrito aqui usa DENV RVPs juntamente com células K562 que são normalmente inadmissíveis à infecção. RVPs são estruturalmente intacta replicação incompetente DENV partículas virais que codificar um Replicão subgenômica de proteína verde fluorescente (GFP) que manifesta-se após uma única rodada de replicação³. Como tal, as células que são infectadas com RVPs fluorescem verde e podem ser facilmente detectadas usando citometria de fluxo ou microscopia. Os RVPs usadas neste ensaio foram obtidas de fontes comerciais. Eles podem, no entanto, ser gerado contra outros vírus e utilizada no ensaio descrito neste manuscrito. Enquanto isso, as células K562 são uma linhagem de células de leucemia FcγIII-receptor-expressando que se ligam à região Fc dos anticorpos e tornar-se infectado na presença de sub, neutralizando as concentrações de anticorpos^4,5.

ADE ensaios têm sido amplamente utilizados em estudos investigando os fatores de risco para dengue grave e para delinear os mecanismos em vitro ADE^6,7,8. O ensaio de ADE descrito aqui pode ser rapidamente e facilmente usado para determinar a capacidade do soro para aumentar a infecção em vitro usando RVPs e fluxo cytometry, em comparação com outros ensaios utilizados atualmente, que também exigem a determinação da formação de placa bacteriana unidades (pfu) em células Vero ou mancha do anticorpo de infectados células^{6,7,8,9,10,11}, ambos os quais são demorados e trabalhistas intensiva.

Protocolo

As amostras de soro usadas para demonstrar o protocolo descrito aqui foram obtidas de macacos rhesus que estavam alojadas e cuidadas de acordo com o local, estado e federais condições em uma associação para avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório Internacional (AAALAC)-credenciado com facilidade. Todos os experimentos com animais foram revistos e aprovados pela Comissão de uso e cuidado institucional do Animal e as amostras foram adquiridas através de um protocolo de compartilhamento de tecido.

1. dia-1

Nota: Execute todos os passos descritos abaixo em uma fluxo de laminar estéril biossegurança armário usada para cultura de tecidos em um laboratório BSL-2.

1. Descongelar as amostras de soro à temperatura ambiente e transferir 100 µ l de cada amostra de soro a um tubo estéril. Calor inativar por 30 min a 56° C em banho-maria ou um thermomixer temperatura ajustável. Fazer 10 vezes seriais diluições da amostra soro variando de 1:1 a 1:1,000 usando frio RPMI-10 (RPMI com 10% de soro fetal bovino).
2. Transferência de 10 µ l de amostra de soro diluído em série a cada poço um estéril 96 poços V-da placa de base. Incluem dois conjuntos de controle poços, RPMI-10 com RVPs só e sem amostra de soro e RPMI-10 só que sem RVPs e sem amostra de soro. Configure cada amostra de soro e RPMI-10 controles em triplica.
3. Retire a Dengue-1, 2, 3 e 4 RVPs do congelador-80 ° C e descongele-os em banho maria a 37 ° C. Transferi os RVPs descongelados imediatamente em gelo. Obter RVPs aproximadamente 170 µ l de cada amostra de soro (10 µ l de poços RVPs x 3 para cada diluição (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) e 10 µ l de poços RVPs x 3 para cada um dos 10-RPMI com RVP só controlam poços).
4. Pipete 10 µ l de RVPs em cada bem a 96 poços V-da placa de base que contém a amostra de soro e o RPMI-10 com poços de controle RVPs (sem soro). Não adicione RVPs ao RPMI-10 só (nenhuma amostra de soro e sem RVP) poços. Misturar cuidadosamente pipetando para cima e para baixo 5-10 vezes. Adicionar 10 µ l frio RPMI-10 em vez de RVPs cada frio RPMI-10 somente (nenhuma amostra de soro e sem RVP) de controle de poços.
5. Transferir a placa de V-fundo de 96 poços para uma incubadora e incubar a placa por 1 hora a 37 ° C, na presença de 5% de CO₂. Enquanto a placa de 96 poços de V-fundo está incubando, limpe a superfície do armário com etanol a 70% da biossegurança e executar o UV luz por 15 min.
6. Remover um balão T75 totalmente confluente de células K562 da incubadora, misturar as células bem usando uma pipeta estéril 5 mL e transferir 5ml de células para um tubo cônico estéril 15 mL.
   Nota: As células K562 são mantidas em RPMI-10 e repicagem em 1 x 10⁶/mL.
7. Contar o número de células por remover 10 µ l células do tubo cônico estéril 15 mL e misturar com o azul de tryphan 10 µ l. Conte as células usando um hemocytometer para determinar o número total de células no tubo cônico de 15 mL.
8. Centrifugue a 15ml cónico com células a ~ 1.200 x g durante 10 minutos, decante o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI quente-10 em uma concentração de 80.000 µ l de células/30 de mídia (2.66 x 10⁶ células /mL).
9. Remova a placa de 96 poços de V-fundo da incubadora (passo 1.6), transferir 30 µ l de células K562 a cada poço da placa de 96 poços V-fundo e homogeneiza pipetando para cima e para baixo 5-10 vezes. Transferir a placa de V-fundo de 96 poços para uma incubadora e incubar a placa por 1 hora a 37 ° C, na presença de 5% de CO₂.
10. Após incubação por 1h, remova a placa de 96 poços de V-fundo da incubadora e centrifugar ~ 1.200 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, decante a mídia dos poços, girando o prato de cabeça para baixo em um recipiente contendo água sanitária 10%.
11. Lavar as células em cada poço por resuspending-los em 125 µ l de RPMI-10 quente, misture bem com uma pipeta e centrifugar a placa a ~ 1.200 x g durante 5 min. decantar a mídia girando o prato de cabeça para baixo em um recipiente contendo água sanitária 10%. Repita este passo de lavar duas vezes.
12. Após a lavagem, adicionar 100 µ l de morno RPMI-10 a cada misture bem, subindo e descendo com a pipeta e incubar a placa por 48 h a 37 ° C, na presença de 5% de CO₂.

2. dia 3

1. Remover a placa de V-fundo de 96 poços contendo 100 µ l de células e de mídia/poço da incubadora e movê-lo para uma armário de biossegurança. Usando uma pipeta multicanal, misturar o conteúdo de cada bem e transferir as células e mídia para um fundo bem U 96 placa ou para pre-rotulado tubos polipropileno de 5 mL.
2. Enxágue a cada poço em placa de 96 poços V-fundo com 100 µ l de 1% paraformaldeído (PFA) em 1 x fosfato tamponado salino (PBS) e transferência aos respectivos poços no 96 bem U-parte inferior da placa ou polipropileno tubos etiquetados 5ml da etapa 2.1 para produzir uma final concentração de 0,5% PFA/poço ou tubo. Misturar cuidadosamente com uma pipeta multicanal, cubra o prato com papel alumínio e deixe descansar na incubadora durante 30 minutos para consertar as células.
3. Preparar o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais , por exemplo) executando imaculadas células K562 para calibrar o lado e espalhe para a frente, juntamente com as configurações de fluorescência. O canal de fluorescência apenas exigido é FL1, como GFP é a única fluorescência emitida a partir das células. Adquirir ~ 30, 000 – 50.000 células de cada amostra.
   Nota: Qualquer citômetro de fluxo capaz de ler uma única fluorescência pode ser usado para a aquisição de dados, como as células infectadas com RVPs só emitirão fluorescência verde devido à presença de GFP, e nenhum outro canal de fluorescência são necessários.

3. análise de dados

1. Analisar dados adquiridos sobre o citômetro de fluxo usando qualquer software de análise de citometria de fluxo (ver tabela de materiais).
   1. Conjunto o primeiro Portal baseado no FSC-A (dispersão frente – área) vs FSC-H (frente dispersão – altura) para incluir células únicas e excluir autofluorescente parelhas de análise¹². Então, portão células dependentes de singlete baseadas no SSC-A (dispersão lateral – área) vs FSC-A para excluir todos os restos de autofluorescent.
   2. Analisar o SSC-A vs células gated FSC-A para a expressão de GFP baseado no SSC-A vs GFP-A. Determine a porcentagem de células GFP + para cada diluição das amostras de soro e controle definindo um portão ao redor de células GFP +.
2. Determine a percentagem média de células GFP + para cada diluição da amostra de soro e controle de poços, dividindo a percentagem de células GFP + em poços de três vias por 3.
3. Calcule dobra-realce de infecção dividindo a percentagem média de células GFP + nas amostras de soro para cada diluição dividido pela percentagem média de células GFP + na RPMI-10 com poços de controle RVPs (nenhuma amostra de soro).
4. Gráfico dobra-realce (eixo y) contra diluição (eixo x) e realizar análise estatística utilizando ANOVA seguida pelo teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas.

Resultados

Os soros de 4 do rhesus macaques foram coletadas 16 semanas após a infecção com ZIKV e testaram por seu potencial melhorar o DENV-1, 2, 3 e 4 infecção em células K562. Os animais tiveram virémia pico de ~ 1 x 10⁵ cópias de RNA/mL ZIKV de plasma por dia 3 após infecção que recusou-se a níveis que estavam abaixo do limite de detecção por 7 dias após a infecção. Não virémia foi detectada no plasma a pós-infecção 16 semanas. Em seguida, realizou-se o ensaio da...

Discussão

Flavivírus como DENV e ZIKV compartilham significativa evidência de homologia em ambas as suas proteínas estruturais e não estruturais que geram anticorpos que reagem de forma cruzada com os outros^13,14. Estas respostas de anticorpos cross-reactive têm sido mostradas para melhorar da infecção in vivo e em vitro com um sorotipo heterólogo ou outros relacionados flavivírus^1,2. O p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348