Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole simple et facile pour mesurer enhancement dépendante anticorps d’infection par virus de Zika sérum convalescent à l’aide de particules virales journaliste virus de la Dengue.

Résumé

Amélioration dépendante anticorps d’infection a été démontrée à jouer un rôle majeur dans la pathogénie virale de la Dengue. Traditionnels tests qui mesurent la capacité d’anticorps ou de sérum d’augmenter l’infection dans les lignées cellulaires inadmissible ont compté sur l’utilisation de production virale dans les médias, suivies par des essais de plaque pour quantifier l’infection. Plus récemment, ces tests ont examiné infection par le virus (DENV) la Dengue dans les lignées cellulaires à l’aide d’anticorps fluorescent étiquetés. Ces deux approches ont des limites qui restreignent l’utilisation généralisée de ces techniques. Nous décrivons ici un essai simple in vitro à l’aide de Dengue virus journaliste particules virales (VPR) qui expriment la protéine fluorescente verte et les cellules K562 à examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’infection DENV sérum obtenu à partir de rhésus macaques 16 semaines après l’infection par le virus Zika (ZIKV). Cette technique est fiable, implique la manipulation des cellules, ne nécessite pas l’utilisation de virus compétente de réplication direct et peut être effectuée dans un format haut débit pour obtenir une lecture quantitative à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce test peut être facilement adapté pour examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’autres infections flavivirus tels que les virus de la fièvre jaune (SVA), virus de l’encéphalite équine japonais (tarek), virus du Nil occidental (VNO) etc. où les VPR est disponibles. La facilité de mise en place du test, analyse des données et interprétation des résultats rendent très favorable à la plupart des paramètres de laboratoire.

Introduction

Amélioration dépendante des anticorps (ADE) de l’infection est un processus par lequel partiellement une réaction croisée d’anticorps induits par un sérotype de virus augmente l’absorption d’un autre sérotype du virus, conduisant à une virémie et une augmentation de la réplication virale. ADE a été largement documenté dans les infections de virus (DENV) la Dengue où quatre principaux sérotypes sont fréquentes. Dans un sous-groupe de patients, l’ADE est associée à une fièvre hémorragique (DHF). Nous avons récemment démontré que Zika infection par le virus (ZIKV) induit des réponses en anticorps croisée DENV origine ADE de DENV in vitro et probablement contribué à l’amélioration de la virémie DENV in vivo¹ significativement élevés ^{, 2}. dosages d’anticorps dépendant d’amélioration constituent un outil précieux pour évaluer la capacité des anticorps à améliorer une infection secondaire avec des virus apparentés et donnent des indications précieuses sur la pathogenèse des infections par un flavivirus et informer le développement de vaccins.

Le test décrit ici utilise DENV VPR ainsi que les cellules K562 qui sont normalement inadmissibles à l’infection. VPR est structurellement intact réplication incompétent DENV particules virales qui codent un réplicon sub-génomique protéine fluorescente verte (GFP) qui s’exprime après un seul tour de réplication³. Ainsi, les cellules qui deviennent infectées par VPR réagissant en vert et peuvent être facilement détectés à l’aide de la cytométrie en flux ou la microscopie. La VPR utilisé dans cet essai ont été obtenues de sources commerciales. Ils peuvent, toutefois, être produites contre les autres virus et utilisés dans le test décrit dans ce manuscrit. Pendant ce temps, les cellules K562 sont une lignée de cellules leucémie FcγIII-exprimant le récepteur qui se lient à la région Fc des anticorps et s’infectent en présence de neutraliser des concentrations d’anticorps^4,5.

ADE dosages ont été largement utilisés dans les études portant sur les facteurs de risque pour la dengue sévère et pour délimiter les mécanismes de in vitro ADE^6,7,8. Le dosage de l’ADE décrit ici peut être utilisé rapidement et facilement pour déterminer la capacité du sérum pour améliorer l’infection in vitro à l’aide de VPR et cytométrie en flux, par rapport à d’autres tests utilisés actuellement, qui nécessitent soit la détermination de la formation de plaque unités (pfu) dans les cellules Vero ou souillure d’anticorps infecté les cellules^{6,7,8,9,10,11}, qui sont tous deux beaucoup de temps et du travail intensif.

Protocole

Les échantillons de sérum utilisés pour démontrer le protocole décrit ici proviennent de macaques rhésus qui étaient logés et pris en charge conformément à l’état local et fédérales politiques dans une Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC)-accrédités par facilité. Toutes les expériences animales ont été examinées et approuvées par animalier institutionnel et Comité de l’emploi et des échantillons ont été acquis par un protocole de partage des tissus.

1. jour 1

Remarque : Effectuez toutes les étapes décrites ci-dessous dans une armoire de biosafety stérile à flux laminaire utilisé pour culture de tissus dans un laboratoire BSL-2.

1. Décongeler les échantillons de sérum à la température ambiante et transférer 100 µL de chaque échantillon de sérum dans un tube stérile. Chaleur inactive pendant 30 minutes à 56° C dans un bain d’eau ou une température réglable thermomixer. Faire 10 fois des dilutions de l’échantillon de sérum allant de 1:1 à 1 : 1 000 à l’aide de froid RPMI-10 (RPMI avec 10 % sérum de veau fœtal).
2. Transférer 10 µL de l’échantillon de sérum dilué en série à chaque puits d’une plaque de fond en V 96 puits stérile. Comprend deux ensembles de puits de contrôle, RPMI-10 avec VPR seulement et sans échantillon de sérum et RPMI-10 seulement sans VPR et sans échantillon de sérum. Mettre en place chaque échantillon de sérum et RPMI-10 témoins en géométrie.
3. Retirer la Dengue-1, 2, 3 et 4 VPR du congélateur-80 ° C et dégel dans un bain-marie à 37 ° C. Transférer la VPR dégelé immédiatement à la glace. Obtenir environ 170 µL VPR pour chaque échantillon de sérum (10 µL de VPR x 3 puits pour chaque dilution du sérum (1:1, 01:10, 1/100, 1 / 1 000) et 10 µL de VPR x 3 wells pour chacune des RPMI-10 avec RVP seulement contrôler les puits).
4. Déposer 10µl de VPR dans chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits contenant l’échantillon de sérum et au RPMI-10 avec puits de contrôle VPR (pas de sérum). N’ajoutez pas de puits de VPR avec le RPMI-10 seulement (aucun échantillon de sérum et sans RVP). Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas 5 à 10 fois. Ajouter 10 µL de froid RPMI-10 au lieu de VPR à chaque froid RPMI-10 seulement (aucun échantillon de sérum et sans RVP) contrôle des puits.
5. La plaque de fond en V 96 puits de transfert à un incubateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C en présence de 5 % de CO₂. Alors que la plaque de fond en V 96 puits est en incubation, nettoyer la surface de la biosécurité armoire avec 70 % d’éthanol et exécuter les ultraviolets pendant 15 min.
6. Sortir une fiole T75 entièrement confluente de cellules K562 de l’incubateur, mixer les cellules bien à l’aide d’une pipette stérile 5 mL et transférer 5 mL de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL.
   Remarque : Les cellules K562 sont maintenus en milieu RPMI-10 et repiqués à 1 x 106/ml.
7. Compter le nombre de cellules en enlevant les 10 cellules µL du tube conique stérile de 15 mL et mélanger avec le bleu de tryphan 10 µL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules dans le tube conique de 15 mL.
8. Centrifuger les 15 mL conique avec cellules à ~ 1 200 x g pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules chaudes RPMI-10 à une concentration de 80 000 cellules/30 µL de médias (2,66 x 10⁶ cellules/ml).
9. Retirez la plaque de fond en V 96 puits de l’incubateur (étape 1.6), de transférer 30 µL de cellules K562 dans chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits et mélanger soigneusement en pipettant également monter et descendre 5 à 10 fois. La plaque de fond en V 96 puits de transfert à un incubateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C en présence de 5 % de CO₂.
10. Après incubation pendant 1 h, enlever la plaque de fond en V 96 puits de l’incubateur et centrifuger à ~ 1 200 x g pendant 5 minutes. Après centrifugation, décantation des médias provenant des puits en tournant la plaque à l’envers dans un récipient contenant 10 % eau de Javel.
11. Laver les cellules dans chaque puits par eux resuspendant dans 125 µL de RPMI-10 chaud, bien mélanger avec une pipette et centrifuger la plaque à ~ 1 200 g pendant 5 min. décanter les médias en tournant la plaque à l’envers dans un récipient contenant 10 % eau de Javel. Répétez cette étape de lavage deux fois.
12. Après le lavage, ajouter 100 µL de chaud RPMI-10 à chacun se mélangent bien, Monte et descend avec la pipette et incuber la plaque pendant 48 h à 37 ° C en présence de 5 % de CO₂.

2. jour 3

1. Retirez la plaque de fond en V 96 puits contenant 100 µL de cellules et médias/puits de l’incubateur et déplacez-le dans une armoire de sécurité biologique. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélange le contenu de chaque bien et transférer les cellules et médias à 96 puits U fond sur plaque ou au préalable étiquetés tubes en polypropylène de 5 mL.
2. Rincer chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits avec 100 µL de 1 % paraformaldéhyde (PFA) dans 1 x Saline tamponnée au Phosphate (PBS) et transfert vers les puits respectifs dans le 96 bien U-plaque ou marqués 5 mL tubes en polypropylène à l’étape 2.1 de céder une finale concentration de 0,5 % PFA/puits ou tube. Mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux, couvrir la plaque avec du papier aluminium et laisser reposer dans l’incubateur pendant 30 minutes pour fixer les cellules.
3. Préparer le cytomètre de flux (voir Table des matières par exemple) en exécutant les cellules K562 incolores pour étalonner le côté et vers l’avant dispersion ainsi que les paramètres de fluorescence. Le canal de fluorescence seul requis est FL1, comme GFP est la seule fluorescence émise par les cellules. Acquisition de ~ 30, 000-50 000 cellules de chaque échantillon.
   Remarque : Un cytomètre de flux capable de lire une fluorescence unique peut être utilisé pour l’acquisition des données, cellules infectées avec VPR seulement émet une fluorescence verte due à la présence de GFP, et aucun autre canal de fluorescence ne sont nécessaires.

3. analyse des données

1. Analyser les données acquises sur le cytomètre en flux à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir Table des matières).
   1. Ensemble le premier portail basé sur FSC-A (forward scatter – zone) vs FSC-H (forward scatter – hauteur) comprennent des cellules individuelles et exclure les doublets auto-fluorescent analyse¹². Puis, la porte cellules bloquées singulet issus des SSC-A (diffusion latérale – zone) vs FSC-A exclure tout débris auto-fluorescente.
   2. Analyser les SSC-A vs FSC-A cellules fermées pour l’expression de la GFP basé sur SSC-A vs GFP-A. Déterminer le pourcentage de cellules GFP + pour chaque dilution des échantillons de sérum et de contrôle en définissant une barrière autour de GFP + cellules.
2. Déterminer le pourcentage moyen de GFP + cellules pour chaque dilution des échantillons sériques et les puits de contrôle en divisant le pourcentage total de GFP + cellules dans les puits en triple par 3.
3. Calculer pli-amélioration de l’infection en divisant le pourcentage moyen de GFP + cellules dans les échantillons de sérum pour chaque dilution divisé par le pourcentage moyen des cellules GFP + dans le RPMI-10 avec puits de contrôle VPR (aucun échantillon de sérum).
4. Graphique de pli-perfectionnement (axe y) contre la dilution (axe x) et effectuer une analyse statistique en utilisant ANOVA suivie de test post hoc de Tukey à comparaisons multiples.

Résultats

Des sérums provenant de 4 rhésus macaques ont été recueillies à 16 semaines après l’infection avec ZIKV et testés pour leur potentiel d’amélioration DENV-1, 2, 3 et 4 infection dans les cellules K562. Les animaux avaient une virémie pic de ~ 1 x 10⁵ copies de ZIKV RNA/mL de plasma par jour 3 après l’infection qui a diminué à des niveaux inférieurs à la limite de détection de 7 jours après l’infection. Aucun virémie a été détectée dans le plasma à l...

Discussion

Flavivirus comme DENV et ZIKV partagent des preuves significatives d’homologie dans les deux leurs protéines structurales et non structurales qui produisent des anticorps qui réagissent avec l’autre^13,14. Ces réponses anticorps une réaction croisée ont été démontrés pour améliorer d’infection aussi bien in vivo et in vitro avec un sérotype hétérologue ou autres associés flavivirus^1,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348