Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Resumen

Se describe un protocolo simple y fácil para medir la mejora dependiente de anticuerpos de la infección por Zika virus suero convaleciente con partículas virales de Dengue virus reportero.

Resumen

Mejora dependiente de anticuerpos de la infección se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la patogenia viral de Dengue. Los análisis tradicionales que miden la capacidad de los anticuerpos o del suero para mejorar la infección en líneas celulares han confiado en usar salida viral en los medios de comunicación seguido por ensayos de placa para cuantificar la infección. Más recientemente, estos ensayos han examinado la infección del Dengue virus (DENV) en las líneas celulares usando los anticuerpos de fluorescencia marcados. Ambos estos métodos tienen limitaciones que restringen el uso generalizado de estas técnicas. Aquí, describimos un análisis simple en vitro con Dengue virus reportero partículas virales (RVPs) que expresan la proteína verde fluorescente y las células K562 a examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por DENV usando el suero que se obtiene de macaco de la India macacos 16 semanas después de la infección con el virus Zika (ZIKV). Esta técnica es confiable, implica la mínima manipulación de las células, no implica el uso de virus competentes de replicación directo y puede realizarse en un formato de alto rendimiento para obtener una lectura cuantitativa mediante citometría de flujo. Además, este análisis pueden ser adaptado fácilmente para examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de otras infecciones de flavivirus como el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la encefalitis equina (JEEV), virus del Nilo Occidental (VNO) etc. donde RVPs están disponibles. La facilidad de establecer el ensayo, análisis de los datos y la interpretación de los resultados hacen altamente susceptibles a más valores de laboratorio.

Introducción

Mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección es un proceso por el que las respuestas de anticuerpos cruz-reactivos parcialmente inducidas por un serotipo de virus mejora la absorción de otro serotipo del virus, llevando a mayor replicación viral y viremia. ADE ha sido ampliamente documentado en las infecciones del virus (DENV) Dengue donde predominan cuatro serotipos principales. En un subgrupo de pacientes, ADE se asocia con la fiebre hemorrágica de Dengue (FHD). Recientemente hemos demostrado que la infección del virus (ZIKV) Zika inducido significativamente altos niveles de respuestas de anticuerpos cruz-reactivos de DENV que causaron ADE de DENV en vitro y probablemente contribuyeron a la mejora de la viremia DENV en vivo^{1 , 2}. ensayos de mejora dependiente de anticuerpo son una herramienta valiosa para evaluar la capacidad de anticuerpos para mejorar la infección secundaria con virus relacionados y proporcionar información valiosa en la patogenesia de infecciones por flavivirus e informar a la desarrollo de vacunas.

El descrito aquí emplea DENV RVPs junto con las células K562 que son normalmente inadmisibles a la infección. RVPs son estructuralmente intacto replicación incompetente DENV partículas virales que codifican un replicón de sub-genomic proteína verde fluorescente (GFP) que se expresa después de una sola ronda de replicación³. Así, las células que se infectan con RVPs fluorescencia verde y pueden ser fácilmente detectadas mediante citometría de flujo o microscopia. Los RVPs utilizados en este ensayo se obtuvieron de fuentes comerciales. Sin embargo, se pueden generar contra otros virus y utilizado en el ensayo se describe en este manuscrito. Mientras tanto, las células K562 son una línea de células de leucemia FcγIII-receptor-expresión que se unen a la región Fc de los anticuerpos y se infectan en la presencia de neutralizar las concentraciones de anticuerpo^4,5.

ADE los ensayos se han utilizado en estudios que investigaron los factores de riesgo para dengue grave y delinear los mecanismos de en vitro ADE^6,7,8. El ensayo de ADE descrito aquí puede ser rápidamente y fácilmente usado para determinar la capacidad del suero para mejorar en vitro infección usando RVPs y flujo cytometry, en comparación con otros ensayos utilizados en la actualidad, que requieren ya sea la determinación de la formación de placa unidades (pfu) en células Vero o tinción de anticuerpos de la infección las células^{6,7,8,9,10,11}, los cuales son desperdiciadores de tiempo y mano de obra intensivo.

Protocolo

Las muestras de suero utilizadas para demostrar el protocolo descrito aquí se obtuvieron de macacos rhesus que fueron alojadas y atendidas según local, estatal y federales políticas en una asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care Internacional (AAALAC)-acreditado centro. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal y las muestras fueron adquiridas a través de un tejido de intercambio de protocolo.

1. día 1

Nota: Realice todos los pasos que se describen a continuación en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar estéril utilizado para cultivo de tejidos en un laboratorio BSL-2.

1. Las muestras de suero a temperatura de descongelar y transferir 100 μl de cada muestra de suero a un tubo estéril. Inactive por calor durante 30 minutos a 56° C en un baño de agua o un Termomezcladores temperatura ajustable. Hacer 10 veces diluciones seriadas de la muestra de suero que van de 1:1 para 1:1,000 con RPMI-10 frío (RPMI con 10% suero bovino fetal).
2. Transferir 10 μl de la muestra de suero en serie diluido en cada pocillo de una placa de V-inferior de 96 pocillos estéril. Incluyen dos sistemas de control de pozos, RPMI-10 con RVPs sólo y sin muestra de suero y RPMI-10 sin RVPs y sin muestra de suero. Configurar cada muestra de suero y RPMI-10 controles en triplicado.
3. Retire el Dengue-1, 2, 3 y 4 RVPs del congelador de-80 ° C y descongelar en baño de agua de 37 ° C. La transferencia de los RVPs descongelados inmediatamente en hielo. Obtener RVPs aproximadamente 170 μl de cada muestra de suero (10 μl de los RVPs x 3 pozos para cada dilución de suero (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) y 10 μl de los RVPs x 3 pozos para cada uno de los 10 de RPMI con RVP sólo control de pozos).
4. Pipetear 10 μl de RVPs en cada pozo de la placa de 96 pocillos V-parte inferior que contiene la muestra de suero y el RPMI-10 con pocillos de control RVPs (no suero). No añadir pozos de RVPs RPMI-10 solamente (ninguna muestra de suero y no RVP). Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo 5 – 10 veces. Añadir 10 μl de frío RPMI-10 en lugar de RVPs cada RPMI-10 frío sólo (ninguna muestra de suero y no RVP) de control de pozos.
5. Transferir la placa de 96 pocillos fondo V a una incubadora e Incube la placa durante 1 hora a 37 ° C en presencia de 5% CO₂. Mientras está incubando la placa de 96 pocillos fondo V, limpie la superficie de la bioseguridad con etanol al 70% y ejecute la UV luz durante 15 minutos.
6. Retire un frasco de T75 completamente confluente de células K562 de la incubadora, mezclar las células bien utilizando una pipeta estéril 5 mL y transferir 5 mL de células a un tubo cónico de 15 mL estéril.
   Nota: Las células K562 son mantenidas en RPMI-10 y subcultivadas en 1 x 106/ml.
7. Contar el número de las células mediante la eliminación de 10 células μl del tubo cónico de 15 mL estéril y mezclar con azul de tryphan de 10 μl. Contar las células usando un hemocitómetro para determinar el número total de células en el tubo cónico de 15 mL.
8. Centrifugue el 15 mL cónico con células ~ 1.200 x g durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI-10 caliente en una concentración de 80.000 células/30 μl de medios (2,66 x 10⁶ células /mL).
9. Retire la placa de 96 pocillos V-fondo de la incubadora (criterio 1.6), transferir 30 μl de las células K562 a cada pocillo de la placa de 96 pocillos fondo V y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo 5 – 10 veces. Transferir la placa de 96 pocillos fondo V a una incubadora e Incube la placa durante 1 hora a 37 ° C en presencia de 5% CO₂.
10. Después de incubar durante 1 h, retire la placa de 96 pocillos fondo V de la incubadora y centrifugar a 1.200 ~ x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, decantar los medios de comunicación de los pozos girando la placa boca abajo en un recipiente que contiene 10% de lejía.
11. Lavar las células en cada pozo a resuspender en 125 μl de RPMI-10 caliente, mezclar bien con una pipeta y centrifugar la placa a ~ 1.200 x g durante 5 min, decantar los medios girando la placa boca abajo en un recipiente que contiene 10% de lejía. Repetir este lavado dos veces.
12. Después del lavado, añada 100 μl de RPMI-10 para cada uno, de la mezcla hacia arriba y hacia abajo con la pipeta caliente e Incube la placa durante 48 h a 37 ° C en presencia de 5% CO₂.

2. día 3

1. Retire la placa de V-inferior de 96 pocillos con 100 μl de células y los medios de comunicación/de la incubadora y a un gabinete de bioseguridad. Utilizando una pipeta multicanal, mezclar el contenido de cada uno así y transferencia de las células y los medios de comunicación a un bien U-fondo 96 platean o a previamente etiquetado como tubos de polipropileno de 5 mL.
2. Lave cada pocillo de la placa V-inferior de 96 pocillos con 100 μl de 1% paraformaldehido (PFA) en 1 x fosfato tampón salino (PBS) y traslado a los respectivos pozos en la 96 bien U inferior placa o etiqueta 5 mL tubos de polipropileno en el paso 2.1 para rendir un final concentración de 0.5% PFA/pozo o tubo. Mezclar bien con una pipeta multicanal, cubra la placa con papel de aluminio y lo deje reposar en la incubadora durante 30 minutos para fijar las células.
3. Preparar el citómetro de flujo (véase Tabla de materiales por ejemplo) mediante la ejecución de las células K562 sin mancha para calibrar el lado y dispersión hacia adelante junto con los valores de fluorescencia. El canal de fluorescencia sólo requerido es FL1, como GFP es el único fluorescencia emitida por las células. Adquirir 30, 000-50.000 células de cada muestra.
   Nota: Cualquier citómetro de flujo capaz de leer una sola de la fluorescencia puede utilizarse para la adquisición de los datos, como las células infectadas con RVPs sólo emite fluorescencia verde debido a la presencia de GFP, y ningún otro canal de fluorescencia son necesarios.

3. Análisis de los datos

1. Analizar los datos adquiridos en el citómetro de flujo utilizando cualquier software de análisis de citometría de flujo (véase tabla de materiales).
   1. Conjunto de la primera puerta basado en FSC-A (avance dispersión – área) vs FSC-H (forward scatter – altura) son las células y excluir a auto-fluorescente dobletes de análisis¹². Entonces, la puerta cerrada camiseta células basadas en SSC-A (dispersión de lado – zona) vs FSC-A excluir cualquier escombro autofluorescent.
   2. Analizar vs SSC-A células cerradas FSC-A para la expresión de GFP en base a vs SSC-A GFP-A. Determinar el porcentaje de células GFP + para cada dilución de las muestras de suero y control estableciendo una puerta alrededor de las células GFP +.
2. Determinar el porcentaje de células GFP + para cada dilución de la muestra de suero y pocillos de control dividiendo el porcentaje total de células GFP + en los pozos por triplicado 3.
3. Calcular doble-mejora de la infección al dividir el porcentaje medio de células GFP + en las muestras de suero para cada dilución dividido por el porcentaje medio de células GFP + en el RPMI-10 con pocillos de control RVPs (ninguna muestra de suero).
4. Ver pliegue-mejora (eje y) versus dilución (eje x) y realizar análisis estadístico con ANOVA seguido de post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples.

Resultados

Sera de 4 rhesus macacos fueron recogidos 16 semanas después de la infección con ZIKV y probaron por su potencial para mejorar el DENV-1, 2, 3 y 4 la infección en células K562. Los animales tenían viremia pico de ~ 1 x 10⁵ copias de ZIKV ARN/mL de plasma por día 3 después de la infección que se negó a niveles por debajo del límite de detección por 7 días después de la infección. No hay viremia se detectó en el plasma en la infección después de 16 semanas. Luego...

Discusión

Flaviviruses DENV como ZIKV compartir evidencia significativa de homología en ambos sus proteínas estructurales y no estructurales que generan anticuerpos que cruz-reaccionan con otros^13,14. Estas respuestas de anticuerpos cruz-reactivos se han demostrado para mejorar de la infección tanto en vivo como en vitro con un serotipo heterólogo u otros relacionados con flaviviruses^1,2. El p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348