Base di un semplice flusso Cytometry Assay per determinare In Vitro dell'anticorpo dipendente valorizzazione del Virus di febbre rompiossa utilizzando siero convalescente Zika Virus

Riepilogo

Descriviamo un protocollo semplice e facile per misurare il miglioramento dipendente dell'anticorpo dell'infezione di siero convalescente di Zika virus utilizzando le particelle virali di Reporter di virus della Dengue.

Abstract

Il potenziamento dipendente dell'anticorpo dell'infezione ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella patogenesi virale Dengue. Tradizionale analisi che misurano la capacità di anticorpi o siero per migliorare infezione nelle linee cellulari impermissible hanno fatto affidamento sull'utilizzo uscita virale nei media seguiti da saggi di placca per quantificare l'infezione. Più recentemente, queste analisi hanno esaminato l'infezione di febbre rompiossa virus (DENV) nelle linee cellulari usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati. Entrambi questi approcci presentano limitazioni che limitano l'uso molto diffuso di queste tecniche. Qui, descriviamo un'analisi semplice in vitro usando Dengue virus reporter particelle virali (RVP) che esprimono la proteina fluorescente verde e le cellule K562 per esaminare potenziamento dipendente dell'anticorpo (ADE) dell'infezione di DENV usando il siero che è stato ottenuto da rhesus macachi 16 settimane dopo l'infezione con il virus di Zika (ZIKV). Questa tecnica è affidabile, comporta la minima manipolazione delle cellule, non implicano l'uso di virus competente replica dal vivo e può essere eseguita in un formato di throughput elevato per ottenere una lettura quantitativa mediante citometria a flusso. Inoltre, questo test può essere facilmente adattato per esaminare aumento dipendente dell'anticorpo (ADE) di altre infezioni da flavivirus come il virus della febbre gialla (YFV), virus dell'encefalite equina giapponese (JEEV), virus del Nilo occidentale (WNV) ecc dove RVP sono disponibili. La facilità di configurazione di test, analisi dei dati e interpretazione dei risultati rende altamente favorevole alla maggior parte delle impostazioni di laboratorio.

Introduzione

Anticorpo dipendente miglioramento (ADE) dell'infezione è un processo per cui le risposte parzialmente traversa-reattivo anticorpo indotte da un sierotipo del virus migliora l'assorbimento di un altro sierotipo del virus, che conduce la viremia e replicazione virale aumentata. ADE è stato ampiamente documentato nelle infezioni di Dengue virus (DENV) dove quattro principali sierotipi sono prevalenti. In un sottogruppo di pazienti, ADE è associata con febbre emorragica Dengue (DHF). Abbiamo recentemente dimostrato che l'infezione del virus (ZIKV) di Zika indotto significativamente elevati livelli di risposte di anticorpi cross-reattivi DENV causato ADE di DENV in vitro , che probabilmente ha contribuito alla valorizzazione di DENV viremia in vivo^{1 , 2}. analisi dell'anticorpo dipendente di potenziamento sono uno strumento prezioso per valutare la capacità degli anticorpi per migliorare secondario infezione con virus collegati e offrire preziose comprensioni nella patogenesi delle infezioni da flavivirus e informare il sviluppo di vaccini.

Il test descritto qui usa DENV RVP insieme con le cellule K562 che sono normalmente inammissibile all'infezione. RVP sono strutturalmente intatto replica incompetente DENV particelle virali che codificano un replicone sub-genomica della proteina fluorescente verde (GFP) che è espresso dopo un singolo ciclo di replica³. Come tale, le cellule che infettano con RVP reagiscono in verde e possono essere facilmente individuate mediante citometria a flusso o microscopia. La RVP usato per questo test sono stati ottenuti da fonti commerciali. Tuttavia, possono essere generati contro altri virus e usato per il test descritto in questo manoscritto. Nel frattempo, le cellule K562 sono un'espressione FcγIII-linea cellulare di leucemia che si legano alla regione Fc degli anticorpi e infettarsi in presenza di Sub-neutralizzare le concentrazioni di anticorpi^4,5.

Saggi di ADE sono stati ampiamente utilizzati negli studi che studiano i fattori di rischio per grave dengue e di delineare i meccanismi di in vitro ADE^6,7,8. Il dosaggio di ADE descritto qui può essere rapidamente e facilmente utilizzato per determinare la capacità del siero per migliorare l'infezione in vitro utilizzando RVP e flusso cytometry, rispetto ad altri dosaggi utilizzati attualmente, che richiedono sia la determinazione della placca formando unità (pfu) in cellule Vero o macchiatura dell'anticorpo di infetti cellule^{6,7,8,9,10,11}, entrambi i quali sono in termini di tempo e manodopera intensivo.

Protocollo

I campioni di siero utilizzati per illustrare il protocollo descritto qui sono stati ottenuti da macaques del reso che erano alloggiate e curate secondo locale, statale e federale politiche in un'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale (AAALAC)-accreditato facility. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali e i campioni sono stati acquisiti attraverso un protocollo di condivisione di tessuto.

1. giorno 1

Nota: Eseguire tutti i passaggi descritti di seguito in una flusso laminare sterile biosicurezza usata per coltura tissutale in un laboratorio BSL-2.

1. Scongelare i campioni di siero a temperatura ambiente e trasferire 100 µ l di ciascun campione di siero in una provetta sterile. Inattivare con il calore a 56° C in un bagno d'acqua o un thermomixer regolabile in temperatura per 30 minuti. Effettuare diluizioni seriali 10 volte campione di siero che vanno da 1:1 a 1:1,000 utilizzando freddo RPMI-10 (RPMI con 10% siero bovino fetale).
2. Trasferire 10 µ l di campione di siero diluito serialmente in ciascun pozzetto di una piastra di fondo V 96 pozzetti sterile. Sono due serie di pozzetti di controllo, RPMI-10 con RVP solo e senza campione di siero e RPMI-10 solo senza RVP e senza campione di siero. Impostare ogni campione di siero e RPMI-10 controlli in triplici copie.
3. Rimuovere il Dengue-1, 2, 3 e 4 RVP da-80 ° C e scongelare loro in bagnomaria a 37 ° C. Trasferire il RVP scongelati immediatamente in ghiaccio. Ottenere RVP circa 170 µ l per ogni campione di siero (10 µ l di RVP x 3 pozzi per ogni diluizione del siero (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) e 10 µ l di RVP x 3 pozzi per ognuna delle RPMI-10 con RVP solo controllo pozzi).
4. Pipettare 10 µ l di RVP in ciascun bene la piastra di fondo V 96 pozzetti contenenti il campione di siero e RPMI-10 con pozzetti di controllo RVP (nessun siero). Non aggiungere RVP RPMI-10 solo (nessun campione di siero e nessun RVP) pozzi. Mix accuratamente pipettando su e giù 5 – 10 volte. Aggiungere 10 µ l freddo RPMI-10 al posto di RVP per ogni freddo RPMI-10 soltanto pozzetti di controllo (nessun campione di siero e nessun RVP).
5. Trasferire la piastra di fondo V 96 pozzetti per un'incubatrice e incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C in presenza di 5% CO₂. Mentre la piastra a 96 pozzetti fondo V è in incubazione, pulire la superficie della cappa di biosicurezza con etanolo al 70% ed eseguire la luce UV per 15 min.
6. Rimuovere un pallone T75 completamente confluente di cellule K562 dall'incubatrice, mescolare le celle anche utilizzando una pipetta sterile 5 mL e trasferire 5 mL di cellule in una provetta conica sterile 15 mL.
   Nota: Le cellule K562 sono mantenute in RPMI-10 e una subcoltura a 1 x 106/ml.
7. Contare il numero di cellule rimuovendo 10 celle µ l dalla provetta conica sterile 15 mL e mescolare con il blu di tryphan 10 µ l. Contare le celle utilizzando un emocitometro per determinare il numero totale di cellule nella provetta conica da 15 mL.
8. Centrifugare il 15 mL conica con cellule a ~ 1.200 x g per 10 minuti, decantare il supernatante e risospendere le cellule in caldo RPMI-10 ad una concentrazione di 80.000 cellule/30 µ l di media (2,66 x 10⁶ cellule/ml).
9. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti fondo V dall'incubatrice (passo 1.6), trasferire 30 µ l di cellule K562 in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti fondo V e mescolare accuratamente pipettando su e giù 5 – 10 volte. Trasferire la piastra di fondo V 96 pozzetti per un'incubatrice e incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C in presenza di 5% CO₂.
10. Dopo incubazione per 1 h, è necessario rimuovere la piastra a 96 pozzetti fondo V dall'incubatore e centrifugare a ~ 1.200 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, decantare i media dai pozzetti ruotando la piastra capovolta in un contenitore contenente candeggina al 10%.
11. Lavare le cellule in ogni pozzetto da loro risospendere in 125 µ l di RPMI-10 caldo, mescolare accuratamente con una pipetta e centrifugare la piastra a ~ 1.200 x g per 5 min, decantare i media girando la piastra capovolta in un contenitore contenente candeggina al 10%. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
12. Dopo il lavaggio, aggiungere 100 µ l di caldo RPMI-10 a ciascuno mescolare bene, su e giù con la pipetta e incubare la piastra per 48 h a 37 ° C in presenza di 5% CO₂.

2. giorno 3

1. Rimuovere la piastra di fondo V 96 pozzetti contenenti 100 µ l di cellule e media/pozzetto dall'incubatrice e spostarlo in una cappa di biosicurezza. Usando una pipetta multicanale, miscela il contenuto di ogni bene e trasferire le cellule e media per un fondo U ben 96 piastra o per pre-etichettata provette in polipropilene da 5 mL.
2. Sciacquare ciascun pozzetto della piastra di fondo V 96 pozzetti con 100 µ l di 1% paraformaldeide (PFA) 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS) e trasferimento ai rispettivi pozzetti in 96 ben U-fondo piatto o tubi in polipropilene da 5 mL con etichetta dal passaggio 2.1 per produrre una finale concentrazione dello 0,5% PFA/pozzetto o tubo. Mescolare accuratamente usando una pipetta multicanale, coprire la piastra con un foglio di alluminio e lasciarlo riposare nell'incubatrice per 30 minuti per fissare le cellule.
3. Preparare il citometro a flusso (Vedi ad esempio la Tabella materiali ) eseguendo le cellule K562 non macchiate per calibrare il lato e forward scatter insieme alle impostazioni di fluorescenza. Il canale di fluorescenza solo richiesto è FL1, come GFP è l'unica fluorescenza emessa dalle cellule. Acquisire ~ 30, 000 – 50.000 cellule da ciascun campione.
   Nota: Qualsiasi cytometer di flusso in grado di leggere una singola fluorescenza può essere utilizzato per l'acquisizione dei dati, come le cellule infettate con RVP solo emette fluorescenza verde per la presenza di GFP, e nessun altro canale di fluorescenza sono necessari.

3. analisi dei dati

1. Analizzare i dati acquisiti sul citofluorimetro utilizzando qualsiasi software di analisi di citometria a flusso (Vedi tabella materiali).
   1. Insieme al primo cancello basato su FSC-A (forward scatter – zona) vs FSC-H (forward scatter – altezza) per includere singole cellule ed escludere auto-fluorescente doppietti da analisi¹². Quindi, cancello singoletto-gated celle basate su SSC-A (dispersione laterale – zona) vs FSC-A per escludere eventuali detriti autofluorescenti.
   2. Analizzare vs SSC-A cellule gated FSC-A per l'espressione della GFP basato su vs SSC-A GFP-A. Determinare la percentuale di cellule GFP + per ogni diluizione dei campioni del siero e controllo impostando un cancello intorno cellule GFP +.
2. Determinare la percentuale media di cellule GFP + per ogni diluizione del campione di siero e pozzetti di controllo dividendo la percentuale totale di cellule GFP + nei pozzetti triplicate per 3.
3. Piega-potenziamento dell'infezione viene calcolato dividendo la percentuale media di cellule GFP + nei campioni del siero per ogni diluizione diviso per la percentuale media di cellule GFP + in RPMI-10 con pozzetti di controllo RVP (nessun campione di siero).
4. Piega-valorizzazione (asse y) del grafico contro diluizione (asse x) ed effettuare analisi statistiche, facendo uso di ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey per i confronti multipli.

Risultati

I sieri da 4 rhesus macaques erano raccolti a 16 settimane dopo l'infezione con ZIKV e testato per il loro potenziale migliorare DENV-1, 2, 3 e 4 infezione in cellule K562. Gli animali hanno avuti viremia di picco di ~ 1 x 10⁵ copie di ZIKV RNA/mL di plasma dal giorno 3 dopo infezione che è sceso a livelli che erano sotto il limite di rilevazione di 7 giorni dopo l'infezione. No la viremia è stata rilevata nel plasma post-all'infezione 16 settimane. L'analisi RVP è stata ese...

Discussione

Flavivirus come DENV e ZIKV condividere testimonianze significative di omologia in entrambe le loro proteine strutturali e non strutturali che generano gli anticorpi che cross-reagiscono con a vicenda^13,14. Queste risposte di anticorpi cross-reattivi sono state indicate per migliorare di infezione sia in vivo che in vitro con un sierotipo eterologo o altro relativi flavivirus^1,2. Il pote...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348