Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine einfache und leichte Protokoll zur Messung der Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion durch Zika Virus genesenden Serum mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel.

Zusammenfassung

Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion hat sich gezeigt, eine wichtige Rolle in Dengue-virale Pathogenese zu spielen. Traditionelle Assays, die die Kapazität von Antikörpern oder Serum Infektion in unzulässige Zelllinien zu messen haben stützte sich auf mit viralen Ausgabe in den Medien, gefolgt von Plaque-Assays, um Infektion zu quantifizieren. Diese Tests haben in jüngerer Zeit, Dengue-Virus (DENV) Infektion in die Zell-Linien mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper untersucht. Beide Ansätze haben Einschränkungen, die den weit verbreiteten Einsatz dieser Techniken einschränken. Hier beschreiben wir einen einfachen in Vitro Assay mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel (RVP), die Ausdrücken grün fluoreszierendes Protein und K562-Zellen zu Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der DENV Infektion mit Serum, das Rhesus entnommen wurde Makaken 16 Wochen nach der Infektion mit Zika-Virus (ZIKV). Diese Technik ist zuverlässig, beinhaltet minimale Manipulation von Zellen, beinhaltet jedoch nicht die Verwendung von live Replikation zuständigen Virus und in einem hohen Durchsatz-Format für eine quantitative Auslesen mit Durchflusszytometrie erhalten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht angepasst werden, um Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der andere Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV), West-Nil-Virus (WNV) etc., RVP vorliegen, zu untersuchen. Die einfache Einrichtung der Assay, Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse macht es sehr geeignet, um die meisten Labor-Einstellungen.

Einleitung

Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der Infektion ist ein Prozess, wobei teilweise kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert durch einen Serotyp des Virus verbessert die Aufnahme von einem anderen Serotyp des Virus, was zu erhöhten Virusreplikation und Virämie. ADE wurde ausgiebig in Dengue-Virusinfektionen (DENV) dokumentiert, wo die vier wichtigsten Serotypen weit verbreitet sind. Bei einem Teil der Patienten ist ADE Dengue hämorrhagisches Fieber (DHF) zugeordnet. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Zika-Virus (ZIKV)-Infektion signifikant hohe DENV kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert, die ADE DENV in Vitro verursacht und wahrscheinlich dazu beigetragen, die Verbesserung der DENV Virämie in Vivo^{1 , 2}. Antikörper-abhängige Verstärkung-Assays sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der Kapazität von Antikörpern gegen Sekundärinfektion mit verwandten Viren erweitern und wertvolle Einblicke in die Pathogenese der Flavivirus Infektionen und informieren die Entwicklung von Impfstoffen.

Der Test beschrieben verwendet hier DENV RVP zusammen mit K562-Zellen, die normalerweise unzulässig für Infektionen sind. RVP sind strukturell intakt Replikation inkompetenten DENV Viruspartikel, die ein Sub-genomische grün fluoreszierendes Protein (GFP) Replicon zu kodieren, die nach einer Runde Replikation³ausgedrückt wird. Als solche Zellen, die mit RVP infiziert fluoreszieren grün und leicht detektiert werden mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Die RVP in diesem Assay verwendet wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen. Sie können gegen andere Viren generiert und verwendet in der Probe in diesem Manuskript beschrieben. Unterdessen sind K562 Zellen einer FcγIII Rezeptor-exprimierenden Leukämie Zelllinie, die an die Fc-Region von Antikörper binden und im Beisein von Sub-Neutralisierung Konzentrationen von Antikörpern^4,5infiziert werden.

ADE-Assays wurden ausgiebig in Studien zur Untersuchung der Risikofaktoren für schwere Dengue-Fieber und die Mechanismen der in-vitro- ADE abzugrenzen verwendet^6,7,8. Der hier beschriebenen ADE-Assay schnell und einfach lässt sich die Kapazität des Serum zur Verbesserung von in-vitro- Infektion mit RVP und flow Cytometry, im Vergleich zu anderen Assays verwendet derzeit, die entweder erfordern die Bestimmung der Bildung von Plaque zu bestimmen Einheiten (Pfu) in Vero-Zellen oder Antikörper Färbung der infizierten Zellen^{6,7,8,9,10,11}, beide zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind intensive.

Protokoll

Die Serumproben verwendet, um die hier beschriebenen Protokoll demonstrieren wurden von Rhesus-Makaken erhalten, die untergebracht und umsorgt in Übereinstimmung mit lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Richtlinien in einem Verein für die Bewertung und Zulassung von Laboratory Animal Care International (AAALAC)-akkreditierten Einrichtung. Alle Tierversuche wurden überprüft und durch institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und Proben wurden durch eine sharing-Protokoll übernommen.

1. Tag 1

Hinweis: Führen Sie die Schritte, die unten beschriebenen in einem sterilen Laminar-Flow Biosafety Kabinett für Gewebekultur in einem Labor BSL-2 verwendet.

1. Tauen Sie die Serumproben bei Raumtemperatur auf und 100 µL jeder Serum-Probe in ein steriles Röhrchen. Wärme für 30 min bei 56° C in einem Wasserbad oder einer Temperatur einstellbar Thermomixer zu inaktivieren. 10-divisibel serielle Verdünnungen der Serumprobe von 1:1 bis hin zu 1:1,000 mit kalten RPMI-10 (RPMI mit 10 % fötalen Rinderserum) zu machen.
2. 10 µL seriell verdünnte Serumprobe in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-V-Boden-Platte zu übertragen. Gehören Sie zwei Sätze von Kontroll-Vertiefungen, RPMI-10 mit RVP nur und ohne Serumprobe und RPMI-10 nur ohne RVP und Serumprobe. Jede Serumprobe und RPMI-10 Kontrollen in Triplicates einrichten.
3. Das Dengue-Fieber-1, 2, 3 und 4 RVP von-80 ° C Gefrierschrank und Tauwetter zu entfernen Sie in einem 37 ° C-Wasserbad. Übertragen Sie die aufgetauten RVP sofort zu Eis. Erhalten rund 170 µL RVP für jede Serumprobe (10 µL des RVP X 3 Brunnen für jeden Serum-Verdünnung (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) und 10 µL des RVP X 3 Brunnen für jeden RPMI-10 mit RVP Steuern nur Brunnen).
4. Pipette 10 µL des RVP in jede gut der 96-Well V-Bodenplatte mit der Serumprobe und RPMI-10 mit RVP (kein Serum) Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine RVP RPMI-10 nur (keine Serumprobe und keine RVP) Brunnen. Mischung gründlich von oben und unten pipettieren 5 – 10 mal. Fügen Sie 10 µL kalter RPMI-10 anstelle von RVP auf jedes kalte RPMI-10 nur (keine Serumprobe und keine RVP) Brunnen kontrollieren.
5. Übertragen Sie 96-Well-V-Boden-Platte auf einem Inkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO₂. Während die 96-Well-V-Bodenplatte Inkubation ist, reinigen Sie die Oberfläche der Biosicherheit Schrank mit 70 % Ethanol und laufen Sie das UV-Licht für 15 min.
6. Entfernen Sie eine vollständig konfluierende T75 Flasche K562 Zellen aus dem Inkubator, mischen Sie die Zellen, die nun mit einer sterilen 5 mL pipettieren und übertragen Sie 5 mL der Zellen auf eine sterile 15 mL konische Rohr.
   Hinweis: Die K562-Zellen sind in RPMI-10 verwaltet und subkultiviert auf 1 x 10⁶/mL.
7. Die Anzahl der Zellen durch das Entfernen von 10 µL Zellen aus dem sterilen 15 mL konische Röhrchen und mischen mit 10 µL Tryphan blau. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer um zu bestimmen, die Gesamtzahl der Zellen in der 15 mL konische Röhre.
8. Die 15 mL konisch mit Zellen bei ~ 1.200 x g für 10 Minuten zentrifugieren, überstand abgießen und Aufschwemmen der Zellen im warmen RPMI-10 in einer Konzentration von 80.000 Zellen/30 µL Medien (2,66 x 10⁶ -Zellen-/mL).
9. Entfernen der 96-Well-V-Boden-Platte aus dem Inkubator (Schritt 1.6), 30 µL K562 Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-V-Boden-Platte übertragen und Mischen von pipettieren rauf und runter 5 – 10 mal. Übertragen Sie 96-Well-V-Boden-Platte auf einem Inkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO₂.
10. Entfernen Sie nach Inkubation für 1 h die 96-Well-V-Boden-Platte aus dem Inkubator und Zentrifuge bei ~ 1.200 x g für 5 Minuten. Nach Zentrifugation Dekantieren der Medien aus den Vertiefungen durch die Platte in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel auf den Kopf drehen.
11. Waschen Sie die Zellen in jedem Bohrloch von resuspending sie in 125 µL warm RPMI-10, mischen mit einer Pipette und Zentrifugieren der Platte ~ 1.200 x g für 5 min. Dekantieren der Medien durch die Platte in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel auf den Kopf drehen. Wiederholen Sie diese Waschschritt zwei Mal.
12. Nach dem Waschen, fügen Sie 100 µL der warmen RPMI-10 zu jedem mix gut, rauf und runter mit dem pipettieren und inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO₂.

2. Tag 3

1. Entfernen Sie die 96-Well-V-Boden-Platte mit 100 µL Zellen und Medien/Brunnen aus dem Inkubator und verschieben Sie ihn auf eine biologische Kabinett. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Mischung der Inhalt der einzelnen gut und die Zellen zu übertragen und Medien zu einem 96 gut U-Boden Platte oder, vorab mit der Bezeichnung 5 mL Polypropylenröhrchen.
2. Spülen Sie jedem Bohrloch in der 96-Well-V-Boden-Platte mit 100 µL 1 % Paraformaldehyd (PFA) 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Transfer in die jeweiligen Vertiefungen in den 96 gut U-Bodenplatte oder beschrifteten 5 mL Polypropylenröhrchen vom Schritt 2.1 eine endgültige Ausbeute Konzentration von 0,5 % PFA/Brunnen oder Rohr. Mischen Sie gründlich mit einer Mehrkanal-Pipette, decken Sie die Platte mit Alu-Folie ab, und lassen Sie es sich in den Inkubator für 30 Minuten, die Zellen zu beheben.
3. Bereiten Sie das Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien zum Beispiel) durch Ausführen von ungefärbten K562-Zellen, um die Seite und forward Scatter zusammen mit der Fluoreszenz-Einstellungen zu kalibrieren. Der einzige Fluoreszenz-Kanal erforderlich ist FL1, wie GFP die einzige Fluoreszenz emittiert aus den Zellen ist. Erwerben von ~ 30, 000-50.000 Zellen von jeder Probe.
   Hinweis: Jeder kann Lesen einer einzigen Fluoreszenz Durchflusszytometer kann verwendet werden, für die Datenerfassung, wie Zellen infiziert mit RVP nur grün fluoreszieren aufgrund des Vorhandenseins von GLP ertönt, und keine Fluoreszenz-Kanal benötigt.

(3) Datenanalyse

1. Analysieren Sie Daten, die auf die Verwendung von Flow Cytometry Analysesoftware Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Gruppe das erste Tor basiert auf FSC-A (forward Scatter – Bereich) Vs FSC-H (forward Scatter – Höhe) Einzelzellen und Analyse¹²Auto-fluoreszierende Dubletten ausschließen. Dann Tor Singulett-gated Zellen basierend auf SSC-A (Side Scatter – Bereich) Vs FSC-A Fremdkörper Autofluorescent auszuschließen.
   2. SSC-A Vs FSC-A geschlossene Zellen analysieren, für die der Ausdruck der GLP SSC-A Vs basiert GFP-A. Bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP + Zellen für jede Verdünnung der Proben Serum und Kontrolle durch ein Tor um GFP + Zellen festlegen.
2. Der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen pro Serum Probenverdünnung und Kontroll-Vertiefungen durch Division der Gesamtprozentsatz der GFP +-Zellen in dreifacher Ausfertigung Brunnen durch 3 zu bestimmen.
3. Falte-Verbesserung der Infektion durch die Aufteilung der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen in Serumproben für jede Verdünnung geteilt durch den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP +-Zellen in den RPMI-10 mit RVP (keine Serumprobe) Kontroll-Vertiefungen zu berechnen.
4. Graph Falte-Erweiterung (y-Achse) versus Verdünnung (x-Achse), und führen Sie statistische Auswertung ANOVA, gefolgt von Tukey Post-hoc-Test für multiple Vergleiche mit.

Ergebnisse

Seren von 4 Rhesus Makaken und auf ihr Potenzial zur Verbesserung DENV-1 getestet wurden gesammelt 16 Wochen nach Infektion mit ZIKV, 2, 3 und 4 Infektion in K562-Zellen. Die Tiere hatten Spitze Virämie von ~ 1 x 10⁵ Exemplare von ZIKV RNA/mL Plasma vom 3. Tag nach der Infektion, die auf ein Niveau gesunken, die unter der Nachweisgrenze von 7 Tage nach der Infektion lagen. Keine Virämie wurde im Plasma auf 16 Wochen nach der Infektion festgestellt. Dann die RVP-Assay wurde du...

Diskussion

Flaviviren wie DENV und ZIKV Teilen deutlichen Anzeichen Homologie in ihre strukturelle und nicht strukturelle Proteine, die Antikörper zu erzeugen, die mit einander^13,14Kreuzreaktion. Diese kreuzreaktiven Antikörperantworten nachweislich zur Verbesserung der Infektion in Vivo und in Vitro mit einer heterologen Serotyp oder andere im Zusammenhang mit Flaviviren^1,2. Kreuz zu verbessern,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348