JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz enfeksiyon antikor bağımlı geliştirme tarafından Zika virüs nekahat serum dang virüs muhabir Viral parçacıkların kullanarak ölçmek için basit ve kolay bir iletişim kuralı tanımlamak.

Özet

Antikor bağımlı geliştirme enfeksiyon Dang viral patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır göstermiştir. Antikorlar veya serum enfeksiyon söyleyebileceğin hücre hatlarında geliştirmek kapasitesini ölçmek geleneksel deneyleri üzerinde kullanarak viral çıkış plak deneyleri tarafından takip medya enfeksiyon ölçmek için güveniyorlar. Son zamanlarda, bu deneyleri dang virüs (DENV) enfeksiyonu fluorescently etiketli antikorları kullanarak hücre hatlarında inceledik. Her iki bu yaklaşım bu teknikler yaygın kullanımı kısıtlamak kısıtlamalar bulunmaktadır. Burada, biz yeşil flüoresan protein ve K562 hücreleri antikor bağımlı geliştirme (ADE) DENV enfeksiyon rhesus elde edilen serum kullanarak incelemek için hızlı dang virüs muhabir viral parçacıkların (RVPs) kullanarak bir basit vitro tahlil tarif maymunların Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon sonra 16 hafta. Bu teknik güvenilirdir, hücreleri en az manipülasyonu içerir, canlı çoğaltma yetkili virüs kullanımı gerektirmez ve Akış Sitometresi kullanarak bir nicel okuma almak için yüksek işlem hacmi biçimde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu tahlil kolayca antikor bağımlı geliştirme (ADE) sarı humma virüsü (YFV), Japon Equine Ensefalit virüsü (JEEV), Batı Nil virüsü (WNV) burada RVPs kullanılabilir vb gibi diğer flavivirus enfeksiyonların incelemek için adapte edilebilir. Tahlil ayarlama kolaylığı, veri analizi ve sonuçları yorumlama çoğu laboratuvar ayarları için son derece uysal yapar.

Giriş

Antikor bağımlı geliştirme (ADE) enfeksiyon sayede virüs serotip tarafından indüklenen kısmen cross-reactive antikor yanıt artırır artan viral çoğaltma ve viremi yol virüs, başka bir serotip alımını bir süreçtir. ADE kapsamlı dang virüs (DENV) enfeksiyonları dört büyük serotipleri yaygın nerede belgelemiştir. Hastaların alt kümede, ADE Dang kanamalı ateşi (DHF) ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon DENV ADE içinde vitro neden oldu ve büyük olasılıkla DENV viremi vivo içinde1 iyileştirmesini katkıda DENV cross-reactive antikor yanıt düzeyi önemli ölçüde yüksek indüklenen göstermiştir , 2. antikor bağımlı geliştirme deneyleri vardır ilgili virüs ile ikincil enfeksiyon geliştirmek ve flavivirus enfeksiyonlarının patogenezinde içine değerli bilgiler sağlamak ve bilgilendirmek için antikorlar kapasitesini değerlendirmek için değerli bir araç aşıların geliştirilmesi.

Açıklanan tahlil DENV RVPs enfeksiyon için normalde söyleyebileceğin K562 hücreleri ile birlikte burada kullanır. RVPs tek bir çoğaltma3turdan sonra ifade edilir bir alt genomik yeşil flüoresan protein (GFP) replicon kodlamak yapısal olarak sağlam çoğaltma beceriksiz DENV viral parçacıkların vardır. Bu nedenle, RVPs ile enfekte olma hücreleri yeşil bulabilsem ve Akış Sitometresi veya mikroskobu kullanılarak kolayca algılanabilir. Bu tahlil kullanılan RVPs ticari kaynaklardan elde edilmiştir. Onlar ancak, olabilir diğer virüslere karşı oluşturulan ve bu el yazması açıklanan tahlil kullanılır. Bu arada, K562 hücreler antikorlar Fc bölgesine bağlamak ve alt antikor4,5konsantrasyonları nötralize huzurunda bulaşabilir bir FcγIII reseptör ifade lösemi hücre satırı vardır.

ADE deneyleri kapsamlı bir şekilde kullanıldığını şiddetli Dang ve vitro ADE mekanizmaları betimlemek için risk faktörleri araştıran çalışmalarda6,7,8. Burada açıklanan ADE tahlil vitro enfeksiyon RVPs kullanarak geliştirmek ve Akış Sitometresi ile karşılaştırıldığında ya gerektiren kullanılmakta, diğer deneyleri plak şekillendirme belirlenmesi için serum kapasitesini belirlemek için hızlı ve kolay kullanılabilir ikisi de zaman alıcı ve emek hücreleri6,7,8,9,10,11, birimleri (pfu) Vero hücreleri veya bir antikor boyama enfekte yoğun.

Protokol

Burada açıklanan protokol göstermek için kullanılan serum numuneleri ilişki değerlendirme ve Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı için ev ve bakım için uygun olarak yerel, eyalet ve federal ilkelerinde edildi rhesus makak elde International (AAALAC)-akredite tesis. Tüm hayvan deneyleri gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve örnekleri paylaşım protokolü bir doku ile elde.

1. gün 1

Not: bir BSL-2 laboratuvar doku kültürü için kullanılan steril laminar akış Biyogüvenlik kabini içinde aşağıda açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Serum numuneleri, oda sıcaklığında erimek ve 100 µL serum örnekleri için steril bir tüp aktarın. Isı 30 dk 56° c su banyosu veya sıcaklığı ayarlanabilir bir thermomixer için devre dışı. 1:1-soğuk RPMI-%10 (10 fetal sığır serum ile RPMI) kullanarak 1:1,000 için arasında serum örneği 10 kat seri dilutions olun.
  2. Seri olarak seyreltilmiş serum örneği 10 µL steril bir 96-şey V-alt plaka her şey için transfer. Sadece ve serum örneği ve RPMI-10 sadece RVPs ve serum örneği olmadan olmadan denetim Wells, RPMI-10 RVPs ile iki kümeleri içerir. Her serum örneği ve triplicates RPMI-10 denetimleri ayarlayın.
  3. Dang-1, 2, 3 ve 4 RVPs-80 ° C dondurucu ve tezcan çıkarın 37 ° C su banyosu giriyordu. Hemen buz çözdürülen RVPs aktarın. Yaklaşık 170 µL RVPs her serum örneği için elde etmek (RVPs x 3 Wells her serum seyreltme için 10 µL (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) ve RVPs x 3 Wells beher-in RPMI-10 RVP ile 10 µL sadece kuyu kontrolü).
  4. RVPs 10 µL her de serum örneği içeren 96-şey V-alt plaka ve RPMI-10 RVPs (serum) denetim wells ile içine pipet. RVPs RPMI-10 yalnızca için (hiçbir serum örneği ve hiçbir RVP) kuyuları eklemeyin. İyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından Mix 5-10 kat. 10 µL soğuk eklemek RPMI-10 RVPs soğuk her RPMI 10 yerine (hiçbir serum örneği ve hiçbir RVP) kuyu kontrol sadece.
  5. 96-şey V-alt plaka için bir kuluçka aktarmak ve plaka varlığında % 5 CO237 ° C'de 1 saat kuluçkaya. 96-şey V-alt plaka kuluçka iken, % 70 etanol ile kabine Biyogüvenlik yüzeyini temizlemek ve UV ışığı 15dk için çalıştırın.
  6. İyi bir steril 5 mL damlalıklı kullanarak hücreleri karıştırın ve hücre 5 mL steril 15 mL konik tüp transfer K562 hücrelerinin tamamen Konfluent bir T75 şişesi kuluçka makinesi çıkarın.
    Not: K562 hücre RPMI-10 içinde muhafaza ve 1 x 106/mL subcultured.
  7. Hücreleri steril 15 mL konik tüp sizden 10 µL hücreleri kaldırarak saymak ve 10 µL tryphan mavi ile karıştırın. 15 mL konik tüp hücrelerde toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  8. 15 mL konik ~ 1200 x g hücreleri ile 10 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve sıcak RPMI-10 saat 80.000 hücreler/30 µL medya (2,66 106 hücre /mL x) bir konsantrasyon hücreleri resuspend.
  9. 96-şey V-alt plaka İnkübatör (Adım 1.6) kaldırmak, 96-şey V-alt plaka her şey için K562 hücre 30 µL aktarmak ve karıştırın iyice yukarı ve aşağı pipetting 5-10 kat. 96-şey V-alt plaka için bir kuluçka aktarmak ve plaka varlığında % 5 CO237 ° C'de 1 saat için kuluçkaya.
  10. 1s için kuluçka sonra 96-şey V-alt plaka kuluçka ve santrifüj ~ 1200 x g, 5 dakikalığına kaldırın. Santrifüjü sonra plaka % 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine baş aşağı çevirerek kuyuları medyadan dikkatle boşaltmak.
  11. Her şey hücrelerde 125 sıcak RPMI-10 µL içinde resuspending tarafından yıkama bir pipet ile iyice karıştırın ve ~ 1200 x g 5 dk. Decant medya için plaka plaka % 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine baş aşağı çevirerek santrifüj kapasitesi. Bu yıkama iki kez tekrarlayın.
  12. Çamaşır sonra RPMI-10 her şey, damlalıklı ile yukarı ve aşağı karışımı sıcak 100 µL ekleyin ve %5 CO2huzurunda 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya.

2. gün 3

  1. 100 µL hücre ve medya/iyi kuluçka makinesi üzerinden içeren 96-şey V-alt plaka çıkarın ve bir biyogüvenlik kabini taşımak. Bir çok kanallı pipet, karışımı kullanarak içeriği her şey ve hücreleri transfer ve medyaya 96 iyi U-alt plaka veya 5 mL polipropilen borular için önceden etiketli.
  2. 96-şey V-alt plaka %1 100 µL ile her kuyuya durulama Paraformaldehyde (PFA) 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 96 de U-alt plaka veya etiketli 5 mL polipropilen borular içinde anılan sıraya göre wells transfer adım 2.1 bir son vermeye konsantrasyonu % 0,5 PFA/iyi veya tüp. İyice bir çok kanallı pipet kullanarak karıştırmak, alüminyum folyo ile plaka kapak ve kuluçka hücreleri düzeltmek 30 dakika boyunca oturmak izin.
  3. Akış Sitometresi ( Tablo reçetesi Örneğin bakınız) hazırlamak için yan ve floresan ayarların yanı sıra ileri dağılım kalibre günahı K562 hücreleri çalıştırarak. GFP hücrelerden yayılan tek Floresans sadece floresan kanal gerekli FL1, olduğu. Kazanmak ~ 30, 000 – 50.000 hücreleri her örnek.
    Not: Herhangi bir Akış Sitometresi tek bir floresan okuma yeteneğine sahip olarak RVPs ile enfekte hücreleri sadece GFP varlığı nedeniyle yeşil Floresans yayarlar ve diğer bir floresan kanal ihtiyaç vardır veri alma için kullanılabilir.

3. veri analizi

  1. Herhangi bir Akış Sitometresi Analizi yazılım kullanarak Akış Sitometresi alınan verileri analiz (tablo malzemeleri görmek).
    1. Küme ilk kapısı, vs FSC-tek hücre eklemek veya auto-floresan birini analiz12den çıkartmak için H (ileri dağılım-yükseklik) FSC-A (ileri dağılım üzerinde – alan) temel. O zaman, singlet Geçitli hücreler SSC-A göre kapı (yan dağılım-alan) vs FSC-A herhangi bir autofluorescent enkaz dışlamak için.
    2. SSC-A vs GFP ifade tabanlı için SSC-A vs FSC-A Geçitli hücreler analiz GFP-A. GFP + hücrelerin etrafında bir kapı ayarlayarak GFP + hücreler her seyreltme serum ve denetim örnekleri için yüzdesini belirlemek.
  2. 3 tarafından hücrelerinin toplam yüzdesi, GFP + onaylatılacak Wells bölerek GFP + hücreler her serum Numune dilüsyonu ve denetim wells için ortalama yüzdesini belirleyin.
  3. Kat-geliştirme enfeksiyon hücrelerinin GFP + serum numuneleri hücrelerinin GFP + RPMI-10 RVPs (serum örneği) denetim wells ile ortalama yüzde bölünen her seyreltme için ortalama yüzde bölerek hesaplayın.
  4. Kat-geliştirme (y ekseni) seyreltme karşı (x ekseni) grafik ve istatistiksel analiz Tukey'nın post-hoc testi birden çok karşılaştırmalar için ardından ANOVA kullanarak.

Sonuçlar

Sera 4 rhesus makak ZIKV ile enfeksiyon sonra toplanan 16 hafta vardı ve potansiyellerini DENV-1 geliştirmek test üzerinden, 2, 3 ve 4 enfeksiyon K562 hücrelerdeki. Hayvanlar tepe viremi ~ 1 105 kopya ZIKV RNA/mL plazma x 7 gün sonra enfeksiyon tarafından algılamayı sınırın altındaki edildi düzeyleri reddetti enfeksiyon sonra 3 gün vardı. Hiçbir viremi 16 hafta sonrası enfeksiyon, plazma algılandı. O zaman, RVP tahlil gerçekleştirilmiş ve toplanan verileri...

Tartışmalar

Flaviviruses DENV ve ZIKV gibi önemli kanıt homoloji birbirleri ile13,14cross-react antikor üreten her iki onların yapısal ve yapısal olmayan proteinlerde paylaşmak. Bu cross-reactive antikor yanıt-e doğru geliştirmek gösterilmiştir enfeksiyonu ile ilgili vivo içinde ve vitro Contegra serotip veya diğer flaviviruses1,2. Çapraz enfeksiyon geliştirmek için potansiyel hasta...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Açıklanan proje JJM için Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü'nden fon tarafından desteklenmiştir. Görüş ya da burada yer alan iddialar yazarların özel olanları ve resmi veya yansıtıcı olarak görüşlerini Savunma Bakanlığı, Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü veya başka bir Ajansı ABD olmak yorumlanacaktır değildir Hükümet.

WGV tüm deneylerin gerçekleştirilen ve veri analiz; JJM tasarlamış ve çalışma denetlenir; WGW ve JJM kağıt yazdı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DENV 1-4 RVPIntegral MolecularRVP-501
K562 cellsATCCCCL-243
RPMICorning10-040-CV
FBSGE lifesceincesSH 30910.0310% FBS in RPMI-10
Penicillin-StreptomycinMP biomedicals1670049100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPESCellegro25-060-Cl0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)SigmaM71451x in RPMI-10
Sodium PyruvateCellegro25-000-Cl1mM in RPMI-10
L-glutamineFisher ScientificMT25005CI 
Sterile V-bottom platesThomas Scientific333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubesVWR60819-728
Non-sterile U-bottom platesFalconRef 353910A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipetteDenvilleP7127
200uL sterile pipette tipsDenvilleP3020 CPS
20uL sterile pipette tipsDenvilleP1121
50-200uL multichannel pipetteDenvilleP3975-8-B
5-50uL multichannel pipetteDenvilleP3975-9-B
20% formadehydeTousimis #1008B
Water BathThermoFisherTSCOL35
thermomixerEppendorf2231000387An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 IncubatorThermoFisher13-998-213
EthanolSigma AldrichE7023
Liquid BleachFisher ScientificNC9724348
Flowjo 9.8TreeStar, Inc.Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometerBecton Dikinson
Liquid BleachFisher ScientificNC9724348

Referanslar

  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 134Zika vir sdang vir santikor ba ml geli tirmemuhabir viral par ac klar nnekahat serumFlavivirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır