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摘要

肝脏捐献者数量严重不足, 肝脏捐献者的标准已经扩大。常温体外肝灌注 (NEVLP) 已发展为评价和修饰器官功能。本研究展示了 NEVLP 的大鼠模型, 并对 pegylated 过氧化氢酶的能力进行了试验, 以减轻肝脏保存损伤。

摘要

移植的同种异体肝有很大的不足, 并在反应中扩大了供体的标准。因此, 常温体外肝灌注 (NEVLP) 作为评价和改变器官功能的一种方法。NEVLP 与低温和 subnormothermic 灌注相比有许多优点, 包括减少保存损伤、生理条件下正常脏器功能恢复、器官性能评估, 以及作为器官修复的平台。、改建和改装。对小鼠和猪 NEVLP 模型进行了描述。我们展示了一个大鼠模型的 NEVLP, 并使用该模型显示其重要的应用之一-使用的治疗分子添加到肝灌流液。过氧化氢酶是一种内源活性氧 (ROS) 清除剂, 已被证明可以减少缺血再灌注在眼, 脑, 肺。聚乙二醇化已被证明是以过氧化氢酶为靶向内皮细胞。在这里, 我们增加了 pegylated 过氧化氢酶 (PEG 猫) 的基础灌流液, 并证明了它的能力减轻肝脏保护伤害。我们的啮齿动物 NEVLP 模型的好处是它是便宜的与更大的动物模型比较。这项研究的一个局限是它目前不包括灌注后肝移植。因此, 不能肯定地预测器官移植后的功能。然而, 大鼠肝移植模型的建立是很好的, 可以与该模型结合使用。最后, 我们展示了一个廉价的, 简单的, 易于复制的 NEVLP 模型使用大鼠。该模型的应用包括测试新的 perfusates 和灌流液添加剂, 用于器官评估的测试软件, 以及用于修复器官的实验。

引言

在肝移植的等待名单上有14578名患者, 每年约有7000人进行移植手术,1,2。针对这一严重的捐助者短缺问题, 已扩大了肝捐献者的标准;这些通常被称为边际器官或延长的标准捐赠者, 并预期在移植后的表现不如同种异体标准标准, 具有较高的原发性移植功能障碍和延迟移植功能3, 4,5,6。结果, NEVLP 作为评价和修改器官功能6,7的方法被引入。我们设计了一个大鼠 NEVLP 模型, 并用该模型证明了它的一个重要的潜在应用--对肝脏灌流液的新型分子添加剂的检测。

NEVLP 已经被评估在鼠 (鼠) 和猪模型, 以及在被丢弃的人体器官6,8,9。NEVLP 第一次人体试验的结果最近也发表在10。虽然低温机灌注已明显成为肾脏保存的标准, 但肝机灌注的温度仍有争议。与低温和 subnormothermic 灌注相比, NEVLP 有许多建议的优点。这包括减少保存伤害, 恢复正常的器官功能在生理条件下, 能力评估器官的性能, 并作为一个平台的器官修复, 重塑和修改7,11, 12,13,14,15,16,17。

大量的研究已经完成使用猪 NEVLP 模型。尽管这些模型在考虑使用废弃人体器官或人体临床试验模型时比较便宜, 但与我们的小动物 NEVLP 模型相比, 它们是非常昂贵的。每个实验成本的一个重要组成部分是灌流液。我们能够完成4小时的灌注与300毫升的灌流液在相对较低的成本。此外, 小动物的成本, 包括大鼠是非常低的成本相比, 猪。

与其他模型的 NEVLP 在大鼠, 这里提出的模型是相对简单的实施和具有广泛的应用范围。在图 1中可以看到灌注电路。灌流液开始在灌流液水库 (1), 这是一个水套容器。灌流液是由一个滚子泵 (2) 从水库中拉出, 并推入 windkessel (3), 然后是肺 (4)。肺为逆流气体和灌流液流提供最大气体交换。灌流液然后进入加热线圈 (5) 内的灌注室, 以确保它是在生理温度, 和气泡陷阱 (6), 以防止空气气泡灌注有前器官 (7) 和后器官 (8) 样本端口, 这使得灌流液采样。灌流液然后通过门静脉插管进入肝脏。门静脉套管附在压力监测器上, 用于图表数据收集软件上的值。灌流液然后通过静脉插管退出肝脏, 并流入压力均衡器块 (9)。最后, 将灌流液从压力块中拉回, 通过滚子泵, 倒入储层中。该模型包括对门静脉进行连续灌注, 并将脉动流留到肝动脉和透析用在其他一些模型中, 每一个都需要一个单独的和额外的电路, 但以前已经证明不需要9,13。

为了探索新的治疗分子在灌流液中的加入, 我们选择了酶过氧化氢。过氧化氢酶是一种内源性 ROS 清除剂, 是细胞内部防御机制的一部分, 以减轻 ROS18的影响。过氧化氢酶在肝缺血再灌注损伤中的表达增加19。实验性地添加过氧化氢酶已被证明可以减少缺血再灌注眼, 脑, 肺20,21,22,23,24。聚乙二醇化已被证明的目标过氧化氢酶的内皮和帮助过氧化氢酶吸收到内皮细胞25。在减少肝缺血再灌注损伤方面, 对 PEG 进行系统的管理, 疗效有限;然而, 我们假设, 添加 PEG 猫到一个孤立的器官灌注电路将导致改善结果26,27,28。在这里, 我们添加 PEG 猫到我们的基地灌流液, 并表明其能力减轻肝脏保护伤害。

研究方案

所有程序都是按照《机构动物保育指南》和国家研究理事会《人道护理和使用实验动物手册》 (IACUC) 进行的, 并经俄亥俄州立大学 IACUC 委员会批准。

1. 初步设置

  1. 结合以下方法制备灌注液:86 毫升25% 白蛋白, 184 毫升的威廉姆斯的培养基, 30 毫升青霉素/链霉素 (10 的 u/毫升青霉素和0.01 毫克/毫升链霉素), 胰岛素 (50 u/升), 肝素 (0.01 u/毫升), l-谷氨酰胺 (0.292 克/升), 和氢化可松 (0.010 克/升), 总体积为300毫升。对于基灌流液和 peg 猫组, 添加 625 U/毫升的 peg 猫。
    1. 用三 (羟甲基) 氨基甲烷 (THAM) 将灌流液溶液缓冲到 pH 值7.4。使用动脉血气机确认灌流液 pH 值。
  2. 设置电路 (图 1)。
    1. 打开水浴温暖和设置它到37°c。让风琴室暖和起来。
    2. 将混合和缓冲的灌流液倒入水库, 开始循环。
      注: 本步骤中提到的灌流液是在步骤1.1.1 中编写的。
    3. 通过在线肺打开氧气气体 (95% 氧气和5% 二氧化碳) 到流量计数器。
    4. 打开数据收集软件, 然后单击 "开始" 以记录实验的持续时间。
  3. 设置手术显微镜和手术室 (图 2)。
    1. 打开所有设备, 包括暖板, 烙, 麻醉和生命体征 (心率和氧气饱和度) 监测设备。
      注: 显微镜的设置会因使用的显微镜而异, 并可根据用户的舒适度进行调整。
    2. 填充10毫升麻醉注射器与10毫升的液体异氟醚吸入 (分子量184.5 克/摩尔) 和放置在麻醉单位。
    3. 适当放置0.5 毫升肝素注射器 (50 U), 手术器械, 4-0 和7-0 丝缝合, 无菌棉签, 4 厘米 x 4 厘米无纺布纱布海绵 (图 2)。
  4. 准备异氟醚室。

2. 麻醉的诱导

  1. 佩戴以下个人防护设备 (PPE): 手术面罩、手术手套、一次性长袍。
  2. 称一下老鼠。
    注意: 我们在 250–350 g 之间使用大大鼠。
  3. 打开氧气压缩机和异氟醚。在被称量后, 将老鼠放入异氟醚腔内, 并确保盖子的安全。用2升/分氧的6% 异氟醚诱导麻醉。
    注: 确切使用异氟醚剂量将取决于所使用的特定麻醉系统。
  4. 用电子剪刀夹住动物的腹部毛发.
  5. 替换异氟醚腔内的动物。
  6. 打开手术室里的麻醉装置。
  7. 当麻醉完全诱发时, 将大鼠从异氟醚腔中取出。用脚趾捏确认麻醉深度。

3. 采购程序

  1. 准备16克的入口袖口 (图 3)。
    1. 从16克 angiocatheter 开始。切割7毫米的油管。确定7毫米段的中点, 测量3.5 毫米切割在中点和移除前半部分油管。
    2. 用止血粉碎这个现在平坦的部分。用打火机融化 angiocatheter 的另一端, 形成唇。不要把笔尖直接放到火焰中, 否则它会着火。
  2. 准备胆管插管。
    1. 取27克 angiocath, 切断注射口, 只留下导管。将此连接至27克 cannular 油管的10厘米段。
  3. 将大鼠的鼻子放在麻醉鼻锥中, 并将其四四肢固定。通过将显示器连接到左后肢来监测生命体征。执行脚趾捏, 以确认适当的麻醉深度。继续麻醉在4% 异氟醚 (对体重 > 250 克的动物)。
  4. 用70% 异丙醇喷洒动物的腹部。允许干燥。把不育的褶皱放在动物身上。
  5. 用锋利的剪刀和伸展皮肤 (图 4) 从剑突到耻骨进行中线切口。轻轻地进入腹膜, 切开肌肉。注意避免损害这个切口的下一面和肝脏在这个切口的上级方面的膀胱。
  6. 将切口侧向左侧和右侧, 在肝脏下边界的水平处形成十字。
  7. 将麻醉降低到 2% (为动物称重 > 250 克)。
  8. 用弯曲的蚊子钳和肋骨拉钩 (图 5) 收回剑突过程。
  9. 用锋利的剪刀切开镰、膈和 gastrohepatic 韧带。
  10. 在膈静脉上定位并栓上7-0 条缝合线, 尽可能靠近其原点以防止渗漏。
  11. 阉割用一种不育的湿棉尖涂抹器, 用0.9% 生理盐水蘸纱布包扎肠道。注意不要伸展小肠的血管。
  12. 解剖下腔静脉以去除多余的组织。解剖后的静脉刚好优于分岔和通过一个循环4-0 丝缝合为以后使用 (图 6)。
  13. 收回右肾以提供暴露在右肾上腺静脉。用纱布将肝脏的右叶缩回。用7-0 丝缝线将右肾上腺静脉系好, 尽可能接近烧灼, 并将其穿过远端的领带 (图 7)。
  14. 仔细解剖脾静脉, 用两条7-0 丝缝线将其绑起来, 在两条缝线之间切开。
  15. 如果需要的话, 在门静脉上用7-0 丝缝线缝合并结扎额外的静脉。
    注: infrahepatic 在右肾上腺静脉与下肝之间有时有小的分支。
  16. 解剖周围的胃十二指肠动脉, 用7-0 丝缝线栓住胃十二指肠动脉, 结扎胃十二指肠动脉。
  17. 解剖周围的肝动脉, 然后放置7-0 丝缝合领带围绕它 (图 8)。
  18. 解剖出胆管。
    1. 检查胆管的长度。用7-0 丝缝线将远端的胆管系上。在胆管周围放置一圈7-0 丝缝线, 尽可能下部。
    2. 用小剪刀把管子直径的一半切成一个洞, 然后将27克导管放进胆管下部。使用罗马凉鞋领结缝合导管 (图 9)。
  19. 用27克针将0.5 毫升肝素 (50 U) 注入到动物的小弟弟静脉或静脉内。
    注: 还可以使用27克胰岛素注射器代替。
  20. 用先前放置的4-0 丝缝合线钳住并系上静脉。
  21. 用先前放置的7-0 丝缝线栓住肝动脉。
  22. 用显微外科夹子夹住门静脉。用22克 angiocatheter Cannulate 门静脉。冲洗门静脉与60毫升冷0.9% 生理盐水与1毫升肝素 (100 U), 直到肝脏 blanches (图 10)。
    注: 如果肝脏不立即漂白, 它可以用无菌的棉尖喷头按摩。
  23. 暴露 suprahepatic 的静脉, 并在胸部尽可能高的切割。
  24. 执行肝切除术如下。切开隔膜, 切开肝动脉, 切开静脉, 切开门静脉, 切开其他韧带, 取出肝脏。将肝脏置于冰冷的0.9% 生理盐水中 (图 11)。
  25. 在门静脉放置16克的血管袖口 (图 12)。将肝脏放在前体常温肝脏灌注回路中。

4.体内常温肝灌注

注: 此处使用的灌流液是在协议步骤1.1.1 中编写的。

  1. 将门静脉插管置于袖口的门静脉内 (图 13)。
  2. 在门静脉套管放置时, 保持灌流液通过电路2毫升/分钟的流量开始。观察在门静脉压力下的任何尖峰的显示器;这可能表明该船只已被堵塞, 并重新定位套管是必要的。
  3. 用7-0 丝缝线缝合灌流液返流的静脉插管。
  4. 一旦两个套管到位, 开始转动的流量在1毫升/分钟, 直到生理压力的范围内的 10–16 cmH2O 达到。
  5. 在0、30、60、90、120、150、180、210和240分钟的灌注中, 从前、后端口中抽取1毫升样品。将1毫升样品分成两个0.5 毫升的样品。
    注: 0.5 毫升的这将用于协议步骤 4.5.1, 0.5 毫升将用于协议步骤4.5.2。
    1. 在液氮中低温管中对此样品进行0.5 毫升冻结。
    2. 使用剩余的0.5 毫升灌流液进行动脉血气分析。
    3. 在每个时间点 (0、30、60、90、120、150、180、210和240分钟) 运行血气分析后, 检查 ph 值, 并根据需要将灌流液缓冲以返回到 pH 值7.4。
  6. 在4小时灌注的结论中, 将肝脏与灌注回路断开。把肝脏分成 0.5 g 段。将低温管内的肝组织冷冻在液氮中。

5. 实验后分析

  1. 使用商业色度测定试剂盒测定灌流液中丙氨酸转氨酶 (ALT) 水平0、30、60、90、120、150、180、210和240分钟。
    1. 简而言之, 用37摄氏度的反应混合试剂孵化灌流液60分钟. 使用微板块读取器测量 570 nm 的光学密度值。
  2. 融汇0.5 克肝组织, 100 µL 裂解缓冲液, 分析三磷酸腺苷 (ATP)、谷胱甘肽 (GSH) 和丙二醛 (MDA) 的组织裂解。
    1. 简而言之, 使用商业化验试剂盒测量肝脏组织样品的 ATP 水平。将样品与反应缓冲剂混合, 室温孵育30分钟. 使用微板块读取器测量 570 nm 的光学密度。
    2. 使用商业化验试剂盒测量肝组织样品的 GSH 含量。将组织样品与化验鸡尾酒混合。测量405–414纳米的光学密度值。
    3. 使用商业化验试剂盒测量肝脏组织样品的 MDA 水平。将样品与 TBA 和热量混合到95摄氏度, 60 分钟离心反应物, 将上清液转移到96井板上。测量光学密度在532毫微米。
  3. 融汇0.5 克的肝组织与100µL 的裂解缓冲, 并分析组织裂解剂的相对 caspase-3/7 活动使用商业化验试剂盒。
    1. 将组织裂解剂与 caspase-3-7 试剂检测缓冲器混合, 室温孵育30分钟。
    2. 使用微板块读取器测量每个井中的荧光水平。
  4. 使用商业原位死亡检测试剂盒确定肝脏组织样本中凋亡细胞的水平。
    1. 用 10 U/毫升蛋白酶 K 的0.5 克组织切片预处理10分钟, 然后用反应混合物在37°c 上孵育60分钟. 用荧光显微镜进行分析。

结果

每组三只老鼠的样本大小被使用。ALT 测量了 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 和240分钟的灌注。我们使用学生的t检验, 以比较的结果之间的基础灌流液和基地灌流液加上 PEG 猫组在每个时间点。在比较基灌流液和基灌流液加上 peg-猫组, 有显着少 (p < 0.05) ALT 在基灌流液加上 PEG 猫组在 150, 180, 210 和240分钟 (图 14A)。

讨论

移植的同种异体肝有很大的不足, 在反应中, 捐献者的标准已经扩大了1、2、3、4、5。由于捐助者短缺, NEVLP 已被引入作为评估和修改器官功能6,7的方法。我们设计了一种 NEVLP 的大鼠模型。此外, 我们使用这个模型来证明它的一个重?...

披露声明

所有作者都报告说, 他们没有相关的披露。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 T32AI 106704-01A1 和俄亥俄州立大学器官移植、灌注、工程和再生的 t 鲁道夫·弗莱切基金的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Perfusate
8% AlbuminCLS Behring, King of Prussia, PA0053-7680-32
Williams MediaSigma Aldrich, St. Louis, MOW1878
Penicillin/StreptomycinSigma Aldrich, St. Louis, MOP4333
InsulinEli Lilly, Indianapolis, IL0002-8215-91
HeparinFresnius Lab, Lake Zurich, ILC504701
L-glutamineSigma Aldrich, St. Louis, MOG3126
HydrocortisoneSigma Aldrich, St. Louis, MOH0888
THAMHospira, Inc,0409-1593-04
Polyethylene Glycol - CatalaseSigma AldrichS9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical MaskGenericN/A
Protective GownGenericN/A
Surgical GlovesGenericN/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley RatHarlan Sprague Dawley Inc.250 -350 grams
Surgical MicroscopeLeicaM500-N w/ OHS
Charcoal CanistersKent ScientificSOMNO-2001-8
IsofluranePiramal HealthcareN/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe Valco Instruments Co, Inc.SOMNO-10ML
Electrosurgical UnitMacanMV-7A
Warming PadBraintree ScientificHHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-MVG-Module
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RT
Isoflurane chamberKent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tabletop
OxygenPraxair98015
Rib retractorsKent ScientificINS600240
GenieTouchKent ScientificGenieTouch
Normal SalineBaxterNDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven SpongesCriterion104-2411
Sterile Q-TipsHenry Schein Animal Health1009175
U-100 27 Gauge Insulin SyringeTerumo22-272328
5mL SyringeBDREF 309603
4-0 Braided Silk SutureDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Braided Silk SutureTeleflex MedicalREF 103-S
16 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4252586-02
14 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4251717-02
Bile Duct Cannular TubingAltec01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath WarmerLauda Ecoline StareditionE103
Data Collection SoftwareADInstruments Labchart 7
Liver Perfusion CircuitHarvard Apparatus73-2901
Membrane OxygenatorMediac SPAM03069
Roller PumpIsmatecISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide)Praxair98015
Organ ChamberHarvard ApparatusILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic TubeUSA Scientific1418-7410
MucasolSigma-AldrichZ637181
Microsurgical Instruments
Small ScissorsRobozRS-5610
Large ScissorsS&TSAA-15
Forceps - Large AngledS&TJFCL-7
Forceps - Small AngledS&TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Scissors - non microFST 14958-1114958-11
Forceps - Straight TipS&TFRS-15 RM8TC
Large Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-02
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-03
Small Mosquito ClampsGenericN/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK354
Glutathione Assay KitCayman Chemical703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay KitAbcamab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay SystemsPromegaG8090
POLARstar OMEGA Microplate ReaderBMG LABTECHN/A

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