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Resumo

Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.

Resumo

Há uma escassez significativa de aloenxertos fígados disponíveis para transplante, e em resposta aos critérios de doador foram ampliados. Como resultado, normotérmico ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi introduzido como um método para avaliar e modificar a função do órgão. NEVLP tem muitas vantagens em comparação com hipotermia e subnormothermic perfusão incluindo reduziu o prejuízo de preservação, restauração da função normal do órgão em condições fisiológicas, avaliação de desempenho do órgão e como uma plataforma para o reparo de órgãos , remodelação e modificação. Modelos NEVLP de murino e suínos têm sido descritos. Podemos demonstrar um modelo do rato de NEVLP e use este modelo para mostrar uma de suas aplicações importantes — o uso de uma molécula terapêutica adicionado ao perfusato hepático. Catalase é um limpador de espécies (ROS) endógena reativas de oxigênio e tem demonstrado para diminuir a isquémia-reperfusão no olho, cérebro e pulmão. Pegylation mostrou alvo da catalase para o endotélio. Aqui, nós adicionamos peguilado-catalase (PEG-CAT) para o perfusato base e demonstrou a sua capacidade de atenuar a lesão hepática de preservação. Uma vantagem do nosso modelo NEVLP roedor é que é barato em comparação com modelos animais maiores. Uma limitação deste estudo é que ele não inclui atualmente pós-perfusão transplante hepático. Portanto, a previsão da função da pós-transplante de órgãos não pode ser feito com certeza. No entanto, o modelo de transplante de fígado de rato está bem estabelecido e certamente poderia ser usado em conjunto com este modelo. Em conclusão, demonstramos um modelo de baixo custo, simples e facilmente replicável NEVLP usando ratos. Aplicações deste modelo podem incluir testes romance perfusates e aditivos de perfusato, software projetado para avaliação do órgão testes e experimentos destinados a reparar órgãos.

Introdução

Há 14.578 pacientes em lista de espera para transplante hepático e aproximadamente 7.000 transplantes são realizados por ano1,2. Em resposta a esta escassez significativa de doadores, expandiram-se os critérios para os doadores de fígado; Estes são frequentemente referidos como órgãos marginais ou critérios estendidos doadores e são esperados para executar menos bem após transplante de aloenxertos critérios padrão, com taxas mais elevadas de disfunção primária do enxerto e enxerto retardado função3, 4,5,6. Como resultado, foi introduzido como um método para avaliar e modificar a função de órgão6,7NEVLP. Temos desenhado um modelo do rato de NEVLP e usou este modelo para demonstrar uma de suas aplicações potenciais importantes – o teste de aditivos de molécula romance ao fígado perfusato.

NEVLP foi avaliado em murino (rato) e modelos de suínos, bem como em órgãos humanos descartados6,8,9. Os resultados dos primeiros ensaios humanos de NEVLP foram também recentemente publicado10. Apesar de perfusão hipotérmica máquina tornou-se claramente o padrão para a preservação do rim, a temperatura na qual máquina fígada perfusão deve ocorrer é ainda controversa. NEVLP tem muitas vantagens propostas em comparação com hipotermia e perfusão subnormothermic. Estes incluem lesão reduzida de preservação, restauração da função normal do órgão em condições fisiológicas, a capacidade de avaliar o desempenho do órgão e como uma plataforma para órgão reparação, remodelação e modificação7,11, 12,13,14,15,16,17.

Um número significativo de estudos foram concluído usando modelos de suínos NEVLP. Embora estes modelos são comparativamente baratos quando considerando modelos usando descartados órgãos humanos ou testes clínicos em humanos, eles são muito caros quando comparados ao nosso modelo de NEVLP de animais pequeno. Um componente significativo do por experiência o custo é o perfusato. Somos capazes de concluir uma perfusão de 4h com 300 mL de perfusato a um custo relativamente baixo. Além disso, o custo de pequenos animais, incluindo ratos é muito baixo em comparação com o custo de suínos.

Em comparação com outros modelos de NEVLP no rato, o modelo apresentado aqui é relativamente simples de implementar e tem uma ampla gama de aplicações. O circuito de perfusão pode ser visto na Figura 1. O perfusato começa no reservatório de perfusato (1), que é um recipiente de água encamisadas. Perfusato é retirado do reservatório por uma bomba de roletes (2) e empurrado para uma windkessel (3) e, em seguida, o oxigenador (4). O oxigenador é definido para o gás em contracorrente e fluxo de perfusato para fornecer a troca gasosa máxima. O perfusato, em seguida, receitas para um aquecimento da bobina (5) dentro da câmara de perfusão para garantir que ele está na temperatura fisiológica e um borbulhador (6) para evitar a perfusão de bolhas de ar lá são pre-órgão (7) e pós-órgão (8) portos de amostra, que permitem o perfusato ser amostrados. O perfusato, em seguida, entra o fígado através da cânula da veia porta. A cânula da veia porta está ligada a um monitor de pressão que gráficos os valores do software de coleta de dados. O perfusato então sai do fígado através da cânula da veia cava inferior e flui para o bloco de equalização de pressão (9). Finalmente, o perfusato é retirado do bloco de pressão através da bomba de roletes e esvaziado no reservatório. Este modelo inclui uma perfusão contínua para a veia porta e deixa de fora o fluxo pulsátil para a artéria hepática e diálise usado em alguns outros modelos, cada um deles requer um circuito separado e adicional, mas ter previamente demonstrado não ser necessário9,13.

Para explorar a adição de uma molécula terapêutica novela para o perfusato, escolhemos da catalase enzima. Catalase é um limpador ROS endógeno que é parte do mecanismo de defesa interno de células para atenuar os efeitos da ROS18. Expressão da catalase é aumentada em isquemia hepática reperfusão lesão19. Para diminuir a isquémia-reperfusão no olho, cérebro e pulmão20,21,22,23,24, demonstrou-se adição experimental da catalase. Pegylation mostrou alvo da catalase ao endotélio e ajuda na captação de catalase em células endoteliais25. PEG-CAT tem sido administrada sistemicamente com limitada eficácia na redução de lesões de isquémia-reperfusão hepática; no entanto, formulamos a hipótese que adicionar QUE PEG-CAT para um circuito de perfusão de órgão isolado levaria para melhorar resultados de27,26,28. Aqui, nós adicionamos o PEG-CAT a nosso base perfusato e demonstrar a sua capacidade atenuar a lesão hepática de preservação.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do cuidado Animal institucional e Conselho Nacional de pesquisa do guia para o cuidado humano e uso de animais de laboratório (IACUC) e foi objecto de aprovação pelo Comité IACUC de Universidade de estado de Ohio.

1. set-up inicial

  1. Preparar a solução de perfusão combinando-se o seguinte: 86 mL de albumina 25%, 184 mL de mídia Williams, 30 mL de penicilina/estreptomicina (10 U/mL penicilina e 0,01 mg/mL Estreptomicina), insulina (50 U/L), heparina (0,01 U/mL), L-glutamina (0,292 g/L), e Hidrocortisona (0,010 g/L) para um volume total de 300 mL. Para o perfusato base e grupo PEG-CAT, adicione 625 U/mL de PEG-CAT.
    1. Tampão da solução de perfusato usando tris (hidroximetil) aminometano (THAM) para pH 7,4. Use uma máquina de gás de sangue arterial para confirmar o pH de perfusato.
  2. Montar o circuito (Figura 1).
    1. Prepara o banho de água quente e defina-a 37 ° C. Permitir que a câmara de órgão para se aquecer.
    2. Despeje o perfusato misto e no buffer do reservatório e começar a circulação.
      Nota: O perfusato mencionado nesta etapa foi elaborado na etapa 1.1.1.
    3. Liga o gás oxigenação (95% oxigênio e 5% de dióxido de carbono) para o contador de fluxo através do Oxigenador em linha.
    4. Ativar o software de coleta de dados e clique em "start" para gravar para a duração do experimento.
  3. Configure o microscópio cirúrgico e a sala de cirurgia (Figura 2).
    1. Ligue todos os equipamentos, incluindo a placa de aquecimento, eletrocautério e a anestesia e sinais vitais (coração taxa e oxigênio saturação) equipamento de monitorização.
      Nota: As configurações de microscópio irão variar com baseadas no microscópio usado e podem ser ajustadas para o conforto do usuário.
    2. Encha a seringa de anestesia de 10 mL com 10ml de isoflurano líquido para inalação (peso molecular 184,5 g/mol) e coloque na unidade de anestesia.
    3. Posicione uma seringa de 0,5 mL de heparina (50 U), os instrumentos cirúrgicos, 4-0 e 7-0 de seda sutura, cotonetes estéreis e esponjas de gaze 4 x 4 cm não tecida apropriadamente (Figura 2).
  4. Prepare a câmara de isoflurano.

2. a indução da anestesia

  1. Usar o seguinte equipamento de protecção pessoal (PPE): máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas, vestido descartável.
  2. Pese o rato.
    Nota: Nós usamos ratos Sprague-Dawley entre 250-350 g.
  3. Ligue o compressor de oxigênio e isoflurano. Coloque o rato, depois de ser ponderado, na câmara de isoflurano e fixe a tampa. Induzi a anestesia com isoflurano 6% entregado com 2 L/min de oxigênio.
    Nota: A dose exata de isoflurano usada dependerá do sistema de anestesia específica sendo usado.
  4. Use o cortador eletrônico para fazer um corte de cabelo de abdominal do animal.
  5. Substitua o animal na câmara de isoflurano.
  6. Liga o aparelho de anestesia localizado na sala de cirurgia.
  7. Remova o rato da câmara isoflurano quando é totalmente a indução anestésica. Confirme a profundidade de anestesia utilizando uma pitada de dedo do pé.

3. o concurso

  1. Prepare a braçadeira portal 16G (Figura 3).
    1. Começar com um angiocatheter de 16 G. Corte uma parte de 7 mm do tubo. Determinar o ponto médio da seção 7 mm medindo 3,5 mm. entalha no ponto médio e remover a metade anterior da tubulação.
    2. Use uma pinça hemostática para esmagar esta parte agora plana. Use um isqueiro para derreter a outra extremidade do angiocatheter para criar um lábio. Não coloque a ponta diretamente para a chama, ou isso vai inflamar.
  2. Prepare a cânula do ducto biliar.
    1. Pegue um angiocath 27 G e cortar o orifício de injecção, deixando apenas o cateter. Conectar-se a esta para uma seção de 10 cm do tubo de cannular 27 G.
  3. Posicione o rato com o nariz do cone de nariz de anestesia e suas quatro extremidades imobilizado. Monitore os sinais vitais, anexando o monitor à extremidade traseira esquerda. Execute uma pitada de dedo do pé para confirmar a profundidade apropriada da anestesia. Continuar a anestesia com isoflurano 4% (para os animais que pesam > 250 g).
  4. Pulverize o abdômen do animal com álcool isopropílico a 70%. Deixe-a secar. Coloque um pano estéril sobre o animal.
  5. Fazer uma incisão de xifoide ao púbis usando afiada tesoura e estendendo-se através da pele (Figura 4). Suavemente Insira o peritônio e entalha o músculo. Tome cuidado para não danificar a bexiga no aspecto inferior desta incisão e o fígado no aspecto superior desta incisão.
  6. Estenda a incisão lateralmente à esquerda e à direita para formar uma cruz no nível da borda inferior do fígado.
  7. Transformar a anestesia caiu para 2% (para animais com peso > 250 g).
  8. Retrai o processo xifoide, usando uma pinça mosquito curvo e as costelas utilizando retractores costela (Figura 5).
  9. Cortar o pinçamento, frênico e ligamentos menor com uma tesoura afiada.
  10. Localize e gravata-fora a veia frênica com uma sutura de 7-0 como perto de sua origem quanto possível para evitar fugas.
  11. Eviscerar o rato usando um aplicador de ponta de algodão umedecido estéril e embrulhe o intestino em gaze umedecida com solução salina normal 0,9%. Tome cuidado para não esticar a vasculatura do intestino.
  12. Disse sobre a veia cava inferior (VCI) para remover o excesso de tecido. Dissecar para trás a veia cava inferior apenas superior até a bifurcação e passar um loop de uma sutura de seda 4-0 para uso posterior (Figura 6).
  13. Retrai o rim direito para oferecer exposição a veia adrenal direita. Retrai o lobo direito do fígado superiormente com gaze. Amarrar a veia adrenal direita com uma sutura de seda de 7-0 mais próximo a veia cava inferior quanto possível e cauterizar através dele distal para o empate (Figura 7).
  14. Cuidadosamente dissecar para fora da veia esplênica, amarrá-la usando duas suturas de seda de 7-0 e cortar através dele entre as duas suturas.
  15. Amarrar e ligate veias adicionais usando sutura seda 7-0 para o comprimento adicional na veia porta, se necessário.
    Nota: Às vezes existem pequenos ramos do infrahepatic veia cava inferior entre o fígado inferior e a veia adrenal direita.
  16. Dissecar a artéria gastroduodenal, amarrar a artéria gastroduodenal com uma sutura de seda de 7-0 e ligate a artéria gastroduodenal.
  17. Dissecar a artéria hepática e coloque uma gravata de seda de sutura 7-0 em torno dele (Figura 8).
  18. Disse o ducto biliar.
    1. Verifica o comprimento do ducto biliar. Gravata do ducto biliar na extremidade distal, usando uma sutura de seda de 7-0. Coloque um laço de uma sutura de seda de 7-0 ao redor do ducto biliar como proximalmente quanto possível.
    2. Corte um buraco que é metade do diâmetro do duto com tesouras pequenas e colocar um cateter de 27 G no canal colédoco proximal. Amarre o cateter no lugar usando uma sutura de gravata sandália romana (Figura 9).
  19. Injete 0,5 mL de heparina (50 U) da veia peniana ou veia cava inferior do animal usando uma agulha 27G.
    Nota: Uma seringa de insulina de 27 G também pode ser usada em vez disso.
  20. Braçadeira e amarrar a veia cava inferior usando o previamente colocado sutura de seda 4-0.
  21. Amarre a artéria hepática usando o previamente colocado sutura seda 7-0.
  22. Braçadeira da veia porta usando um clipe microcirúrgico. Canule a veia porta usando um angiocatheter de 22g. Nivelado a veia porta com 60 mL de solução salina de 0,9% frio com heparina 1 mL (100 U) até o fígado blanches (Figura 10).
    Nota: Se o fígado não Escalde imediatamente podem ser massageado com aplicadores de ponta de algodão estéril.
  23. Expor o suprahepatic veia cava inferior e cortar através dele tão alto no peito como possível.
  24. Execute um hepatectomy como segue. Corte em torno do diafragma, cortar a artéria hepática, cortar a veia cava inferior, cortar a veia porta, cortar qualquer ligamentos adicionais e tirar o fígado. Coloque o fígado em gelo frio 0,9% soro fisiológico normal (Figura 11).
  25. Coloque uma braçadeira vascular de 16 G na veia portal (Figura 12). Coloque o fígado no circuito de perfusão hepática normotérmica ex vivo .

4. Ex Vivo de perfusão hepática normotérmica

Nota: O perfusato utilizado aqui foi elaborado na etapa de protocolo 1.1.1.

  1. Coloque a cânula da veia porta para a veia portal algemada (Figura 13).
  2. Durante a colocação de cânula da veia porta, manter o fluxo do perfusato através do circuito em 2 mL/min para começar. Observar o monitor para qualquer picos na pressão da veia porta; Isso pode indicar que o navio tem tornam-se obstruídos e reposicionamento da cânula é necessária.
  3. Sutura na cânula da veia cava inferior para o fluxo de retorno do perfusato usando uma sutura de seda de 7-0.
  4. Uma vez que ambas as cânulas estão no lugar, comece transformando-se o fluxo de 1 mL/min até atingir uma pressão fisiológica na faixa de 10 a 16 cmH2O.
  5. Tome uma amostra de 1 mL de pré e pós-portas em 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min de perfusão. Divida a amostra de 1 mL em duas amostras de 0,5 mL.
    Nota: 0,5 mL e 0,5 mL de isto será usado na etapa de protocolo 4.5.1 serão usado na etapa de protocolo 4.5.2.
    1. Snap freeze 0,5 mL desta amostra em tubos criogênicos em nitrogênio líquido.
    2. Execute uma análise de gás de sangue arterial utilizando os restante 0,5 mL de perfusato.
    3. Depois de executar a análise de gás de sangue em cada ponto do tempo (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min) examinar os níveis de pH e buffer o perfusato conforme necessário para retornar ao pH 7,4.
  6. Na conclusão de 4 h de perfusão, desconecte o fígado do circuito da perfusão. Divida o fígado em segmentos de 0,5 g. Snap congelar o tecido do fígado em tubos criogênicos em nitrogênio líquido.

5. análise pós-experiência de

  1. Determine a alanina aminotransferase (ALT) nível o perfusato em 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min usando um kit de ensaio colorimetric comercial.
    1. Em breve, incubar o perfusato com os reagentes de mistura de reação a 37 ° C por 60 min. medir a densidade óptica valores a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.
  2. Homogeneizar a 0,5 g de tecido hepático com 100 µ l de tampão de Lise e analisar o tecido lisado de trifosfato de adenosina (ATP), glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA).
    1. Em breve, medir os níveis de ATP das amostras de tecido do fígado usando um kit de ensaio comercial. Misturar a amostra com o amortecedor da reação e incubar a temperatura ambiente por 30 min. medida da densidade óptica a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.
    2. Medir os níveis GSH das amostras de tecido do fígado usando um kit de ensaio comercial. Misture as amostras de tecido com o coquetel de ensaio. Medir os valores de densidade óptica a 405 – 414 nm.
    3. Medir os níveis MDA das amostras de tecido do fígado usando um kit de ensaio comercial. Misturar as amostras com TBA e calor para 95 ° C por 60 min. centrifugar o reagente e transferir o sobrenadante para uma placa de 96 poços. Medir a densidade óptica em 532 nm.
  3. Homogeneizar a 0,5 g de tecido hepático com 100 µ l de tampão de Lise e analisar o tecido lisado para actividade de caspase-3/7 relativa usando um kit de ensaio comercial.
    1. Misture o lisado de tecido com o buffer de ensaio do caspase-3-7 reagente e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
    2. Medir o nível de fluorescência em cada poço usando um leitor de microplacas.
  4. Determine o nível de células apoptóticas nas amostras de tecido do fígado usando um kit de deteção de morte comercial em situ .
    1. Pré-tratamento de 0.5 g tecido seções com 10 U/mL Proteinase K por 10 min e incubar em seguida com a mistura de reação a 37 ° C por 60 min. executar a análise usando um microscópio fluorescente.

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Resultados

Utilizou-se um tamanho de amostra de três ratos por grupo. ALT foi medido em 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min de perfusão. Usamos o Student t-testes para comparar os resultados entre o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT em cada ponto de tempo. Comparando o perfusato base e base perfusato além de grupos de PEG-CAT, lá é significativamente menor (p < 0,05) ALT na base perfusato plus grupo PEG-CAT em 150, 180, 210 e 240 min (

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Discussão

Há uma escassez significativa de aloenxertos fígados disponíveis para transplante e em resposta a critérios de doador tem sido expandida1,2,3,4,5. Como resultado da escassez de doadores, NEVLP foi introduzido como um método para avaliar e modificar a função de órgão6,7. Nós projetamos um mode...

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Divulgações

Todos os autores relatam que eles não têm nenhum divulgações pertinentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH T32AI 106704-01A1 e o Flesch de T. para a transplantação de órgãos, a perfusão, a engenharia e a regeneração no The Ohio State University.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Perfusate
8% AlbuminCLS Behring, King of Prussia, PA0053-7680-32
Williams MediaSigma Aldrich, St. Louis, MOW1878
Penicillin/StreptomycinSigma Aldrich, St. Louis, MOP4333
InsulinEli Lilly, Indianapolis, IL0002-8215-91
HeparinFresnius Lab, Lake Zurich, ILC504701
L-glutamineSigma Aldrich, St. Louis, MOG3126
HydrocortisoneSigma Aldrich, St. Louis, MOH0888
THAMHospira, Inc,0409-1593-04
Polyethylene Glycol - CatalaseSigma AldrichS9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical MaskGenericN/A
Protective GownGenericN/A
Surgical GlovesGenericN/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley RatHarlan Sprague Dawley Inc.250 -350 grams
Surgical MicroscopeLeicaM500-N w/ OHS
Charcoal CanistersKent ScientificSOMNO-2001-8
IsofluranePiramal HealthcareN/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe Valco Instruments Co, Inc.SOMNO-10ML
Electrosurgical UnitMacanMV-7A
Warming PadBraintree ScientificHHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-MVG-Module
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RT
Isoflurane chamberKent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tabletop
OxygenPraxair98015
Rib retractorsKent ScientificINS600240
GenieTouchKent ScientificGenieTouch
Normal SalineBaxterNDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven SpongesCriterion104-2411
Sterile Q-TipsHenry Schein Animal Health1009175
U-100 27 Gauge Insulin SyringeTerumo22-272328
5mL SyringeBDREF 309603
4-0 Braided Silk SutureDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Braided Silk SutureTeleflex MedicalREF 103-S
16 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4252586-02
14 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4251717-02
Bile Duct Cannular TubingAltec01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath WarmerLauda Ecoline StareditionE103
Data Collection SoftwareADInstruments Labchart 7
Liver Perfusion CircuitHarvard Apparatus73-2901
Membrane OxygenatorMediac SPAM03069
Roller PumpIsmatecISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide)Praxair98015
Organ ChamberHarvard ApparatusILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic TubeUSA Scientific1418-7410
MucasolSigma-AldrichZ637181
Microsurgical Instruments
Small ScissorsRobozRS-5610
Large ScissorsS&TSAA-15
Forceps - Large AngledS&TJFCL-7
Forceps - Small AngledS&TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Scissors - non microFST 14958-1114958-11
Forceps - Straight TipS&TFRS-15 RM8TC
Large Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-02
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-03
Small Mosquito ClampsGenericN/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK354
Glutathione Assay KitCayman Chemical703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay KitAbcamab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay SystemsPromegaG8090
POLARstar OMEGA Microplate ReaderBMG LABTECHN/A

Referências

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  3. Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
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