JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיש מחסור משמעותי לתורם כבד, הקריטריונים עבור התורמים הכבד שהורחבו. Normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) פותחה כדי להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. מחקר זה מדגים מודל עכברוש של NEVLP, בדיקות היכולת של pegylated-קטלאז, להקל על פגיעה בכבד שימור.

Abstract

קיים מחסור משמעותי של allografts הכבד זמין עבור השתלת, בתגובה שהורחבו הקריטריונים התורם. כתוצאה מכך, normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) כבר הציג כשיטה להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. NEVLP יתרונות רבים בהשוואה בהיפותרמיה ו subnormothermic כולל זלוף מופחת פגיעה שימור, שיקום תפקוד האיברים נורמלי בתנאים הפיזיולוגיות, הערכה של ביצועי איברים, כפלטפורמה לתיקון איברים , שיפוצים ושינויים. מודלים NEVLP מאתר והן חזירי תוארו. אנו מדגימים מודל עכברוש של NEVLP ולהשתמש מודל זה להראות אחד מהיישומים החשובים שלה – השימוש של מולקולה טיפולית נוספו perfusate הכבד. קטלאז נבלות מינים (ROS) חמצן תגובתי אנדוגני, הוכח כדי להקטין איסכמיה-פגיעה reperfusion בתוך העין, מוח, ריאות. Pegylation הוכח למטרה קטלאז אנדותל. כאן, הוספנו pegylated-קטלאז (פג-חתול) הבסיס perfusate הדגימו את יכולתה לצמצם פגיעה בכבד שימור. יתרון של המודל NEVLP מכרסם שלנו היא שזה זול לעומת דגמים בעלי חיים גדולים. מגבלה של מחקר זה היא כי היא אינה כיום כוללת זלוף שלאחר השתלת כבד. לכן, אין אפשרות לבצע חיזוי של הפונקציה של השתלת איברים שלאחר בוודאות. עם זאת, הדגם השתלת הכבד עכברוש מבוססת היטב, בהחלט יכול לשמש בשילוב עם מודל זה. לסיכום, הראו מודל NEVLP זול, פשוט, בקלות ניתן לשכפול באמצעות חולדות. יישומים של מודל זה יכול לכלול בדיקות perfusates הרומן תוספים perfusate, בדיקות תוכנה שתוכננה עבור איברים הערכה ואני ניסויים שנועדו לתקן את האיברים.

Introduction

ישנם חולים 14,578 ברשימת ההמתנה עבור השתלת כבד, כ 7,000 השתלות מתבצעות לכל השנה1,2. בתגובה פירוש הדבר תורם משמעותית, הרחיבו הקריטריונים עבור התורמים כבד; אלה מכונים לעתים קרובות שולי איברים או קריטריונים המורחבת תורמים, צפויים לבצע פחות טוב לאחר ההשתלה מאשר allografts הקריטריונים הסטנדרטיים, עם שיעור גבוה יותר של תפקוד שתל ראשי ושתל עיכוב הפונקציה3, 4,5,6. כתוצאה מכך, NEVLP כבר הציג כשיטה להעריך ולשנות איברים פונקציה6,7. יש מעוצב דגם עכברוש של NEVLP ואנו בשימוש מודל זה כדי להדגים אחד שלה יישומים פוטנציאליים חשובים – בדיקה של מולקולה הרומן תוספות כדי perfusate הכבד.

NEVLP יוערכו מאתר (עכברים) והן מודלים חזירי, כמו גם איברי אדם שהושלך6,8,9. התוצאות של הניסויים האנושי הראשון של NEVLP היו גם לאחרונה פורסם10. למרות מכונת בהיפותרמיה זלוף הפך בבירור התקן לשימור הכליה, הטמפרטורה במכונת הכבד אשר זלוף צריכה להתרחש הוא עדיין שנוי במחלוקת. NEVLP יתרונות רבים המוצע לעומת בהיפותרמיה זלוף subnormothermic. אלה כוללים פגיעה השימור מופחתים, שיקום תפקוד האיברים נורמלי בתנאים הפיזיולוגיות, היכולת להעריך את ביצועי איברים, ולא כפלטפורמה איברים תיקון, שיפוץ של השינוי7,11, 12,13,14,15,16,17.

מספר רב של מחקרים הושלמו באמצעות מודלים NEVLP חזירי. למרות מודלים אלה הם זולים יחסית, כאשר דגמי שקילת שימוש שנמחקו איברי אדם או ניסויים קליניים בבני, הם מאוד יקר בהשוואה שלנו דגם NEVLP בעלי חיים קטנים. מרכיב משמעותי של לכל ניסוי העלות היא perfusate. אנחנו יכולים להשלים זלוף 4 שעות עם 300 מ של perfusate במחיר נמוך יחסית. בנוסף, העלות של חיות קטנות כולל חולדות הוא נמוך מאוד לעומת העלות של חזירים.

לעומת דגמים אחרים של NEVLP בחולדה, המודל המוצג כאן הוא פשוט יחסית ליישום ובעל מגוון רחב של יישומים. המעגל זלוף ניתן לראות באיור1. Perfusate מתחיל במאגר perfusate (1), אשר הוא מיכל מים המעטפת. Perfusate הוא שלף מתוך המאגר על ידי משאבה רולר (2), דחף לתוך windkessel (3), ולאחר מכן את oxygenator (4). Oxygenator מוגדרת עבור גז countercurrent perfusate זרימה לספק חילוף הגזים המרבי. Perfusate ואז מההכנסות כדי חימום סליל (5) בתוך התא זלוף כדי להבטיח זאת היא בטמפרטורה הפיזיולוגיות, מלכודת בועות (6) כדי למנוע זלוף של בועות אוויר שם הם איברים מראש (7) ו עוגב שלאחר (8) מדגם יציאות, אשר מאפשרים את perfusate. לטעום. Perfusate ואז נכנס דרך הצינורית וריד שער הכבד. הצינורית וריד שער הכבד מחובר צג לחץ תרשימים הערכים על התוכנה אוסף נתונים. לאחר מכן, perfusate היציאות הכבד דרך הצינורית IVC, זורם לתוך הרחוב אקולייזר לחץ (9). לבסוף, perfusate משך מהגוש לחץ בחזרה דרך המשאבה רולר, רוקן לתוך המאגר. מודל זה כולל זלוף רציפה כדי וריד שער הכבד, משאיר בחוץ זרימה פועמת עורק הכבד, דיאליזה בשימוש גם דגמים אחרים, שכל אחד מהם דורש מעגל נוסף ונפרד, אך בעבר הוכחו לא להיות נדרש9,13.

על מנת לחקור התוספת של מולקולה טיפוליים חדשניים כדי perfusate, בחרנו את האנזים קטלאז. קטלאז הוא נבלות ROS אנדוגני, המהווה חלק של מנגנון ההגנה הפנימית תאים כדי. לרכך את ההשפעות של רוס18. הביטוי קטלאז הוא גדל איסכמיה הכבד פגיעה reperfusion פציעה19. תוספת ניסיוני של קטלאז הוכח כדי להקטין איסכמיה-פגיעה reperfusion, עיניים, המוח, ואת ריאות20,21,22,23,24. Pegylation הוכח למטרה קטלאז אנדותל, סיוע קטלאז ספיגת לתוך תאי אנדותל25. פג-חתול מנוהל מערכתית עם יעילות מוגבלת בהפחתת פגיעה כבדית איסכמיה-פגיעה reperfusion; עם זאת, שיערנו כי הוספת שפג-החתול מעגל זלוף מטלטלים יוביל ל שיפור תוצאות26,27,28. כאן, אנו מוסיפים פג-חתול perfusate הבסיס שלנו להדגים את יכולתו לצמצם פגיעה בכבד שימור.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם לקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים, המועצה הלאומית למחקר של מדריך עבור טיפול אנושי ו שימוש של מעבדה בעלי חיים (IACUC), עבר אישור על-ידי ועדת IACUC אוניברסיטת מדינת אוהיו.

1. הגדרת הראשונית

  1. להכין את הפתרון זלוף על-ידי שילוב הבאות: 86 מ של 25% אלבומין, 184 מ של המדיה של וויליאמס, 30 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (10 U/mL פניצילין ו- 0.01 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין), אינסולין (50 U/L), הפרין (0.01 U/mL),-גלוטמין (0.292 g/L), ו הידרוקורטיזון (0.010 g/L) את הנפח הכולל של 300 מ. כדי להפוך את הבסיס perfusate פג-חתול קבוצה, הוסף 625 U/mL של פג-חתול.
    1. מאגר הפתרון perfusate באמצעות טריס (hydroxymethyl) aminomethane (תאם) ל pH 7.4. השתמש מכונת גזים בדם כדי לאשר את רמת החומציות של perfusate.
  2. להגדיר את המעגל (איור 1).
    1. להפעיל את האמבטיה במים חמים יותר ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס. לאפשר לתא איברים להתחמם.
    2. שופכים את perfusate מעורב, במאגר לתוך המאגר ולהתחיל מחזור הדם.
      הערה: perfusate שהוזכר בשלב זה הוכן בשלב 1.1.1.
    3. הפעל את הגז oxygenating (95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני) לדלפק זרימה דרך oxygenator בתוך השורה.
    4. להפעיל את התוכנה אוסף נתונים ולחץ על "התחל" כדי להקליט את משך זמן הניסוי.
  3. כיוונון מיקרוסקופ כירורגי מחדר ניתוח (איור 2).
    1. הפעל את כל הציוד כולל לוח התחממות כדור הארץ, electrocautery, ואת הרדמה סימנים חיוניים (לב קצב וחמצן רוויה) פיקוח על ציוד.
      הערה: ההגדרות מיקרוסקופ ישתנו בהתבסס על המיקרוסקופ בשימוש ולא ניתן לכוונן נוחות המשתמש.
    2. למלא את המזרק הרדמה 10 מ ל 10 מ של איזופלוריין נוזלי האינהלציה (משקל מולקולרי 184.5 g/mol) ולמקם יחידת הרדמה.
    3. עמדה מזרק 0.5 מ"ל של הפארין (50 U), מכשירי הניתוח, 4-0 ו- 7-0 משי תפר ספוגיות כותנה סטרילי, 4 ס"מ על 4 ס"מ ארוגים גזה ספוגים כראוי (איור 2).
  4. הכינו את תא איזופלוריין.

2. אינדוקציה של הרדמה

  1. ללבוש את הבאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי): מסכה רפואית, כפפות כירורגי, שמלת חד פעמיות.
  2. שוקלים את החולדה.
    הערה: אנו משתמשים ספראג-Dawley חולדות בין 250 – 350 גר'.
  3. הפעל את מדחס חמצן ואיזופלוריין. הנח את העכבר, לאחר נשקל, אל החדר איזופלוריין ולאבטח את המכסה. לגרום הרדמה באמצעות איזופלוריין 6% הנכללת 2 ל'/דקה של חמצן.
    הערה: המינון המדויק איזופלוריין בשימוש יהיה תלוי במערכת הרדמה ספציפי בשימוש.
  4. השתמש קוצץ אלקטרונית קליפ שיער בטן החיה.
  5. החלף את החיה בבית הבליעה איזופלוריין.
  6. הפעל את יחידת הרדמה ממוקם בחדר הניתוח.
  7. הסר את החולדה תא איזופלוריין כאשר הרדמה מלאה מושרה. לאשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטה הבוהן.

3. נוהל רכש

  1. להכין שהקפל פורטל 16 גרם (איור 3).
    1. מתחילים עם angiocatheter 16 גרם. לחתוך קטע 7 מ מ של אבובים. לקבוע את נקודת האמצע של מקטע 7 מ מ על ידי מדידת 3.5 מ מ. Incise אל נקודת האמצע ולהסיר את החלק הקדמי של הצנרת.
    2. השתמש עוצר דימום לרסק חלק שטוח עכשיו זה. להשתמש במשחה כדי להמיס את הקצה השני של angiocatheter כדי ליצור שפה. אין למקם את הטיפ ישירות על הלהבה או זה תוצת.
  2. הכינו את הצינורית צינור המרה.
    1. קח angiocath 27 G, לחתוך את הנמל הזרקת להשאיר רק את הקטטר. להתחבר זה קטע 10 ס מ של הצנרת cannular 27 G.
  3. מקם את העכברוש עם האף שלה בקונוס האף בהרדמה, שלה ארבע הגפיים. מרותק למיטה. לפקח על סימני החיים על ידי הצמדת שהצג הגפיים האחוריות השמאלי. לבצע צביטה הבוהן כדי לאשר עומק ההרדמה המתאימה. המשך הרדמה איזופלוריין 4% (לבעלי שמכבידים > 250 גרם).
  4. תרסיס הבטן של החיה עם אלכוהול איזופרופיל 70%. אפשר להתייבש. המקום סטרילי תלוי מעל בעל החיים.
  5. עושים קו האמצע חתך של מצאתי לשימוש לחיקו חדות מספריים והרחבת דרך העור (איור 4). הזן של הצפק ובעדינות תחתכי את השריר. לטפל כדי למנוע נזק לשלפוחית השתן של ההיבט נחות של החתך הזה ולכבד בהיבט מעולה של החתך.
  6. להרחיב את החתך רוחבית על ימין ועל שמאל כדי ליצור צלב ברמה של הגבול נחות של הכבד.
  7. להפוך את ההרדמה עד 2% (לבעלי שקילה > 250 גרם).
  8. . משכי הסרעפת באמצעות מלחציים נגד יתושים מעוקל הצלעות באמצעות צלעות רטרקטורים (איור 5).
  9. לחתוך את falciform, הסרעפת, והרצועות gastrohepatic עם מספריים חדות.
  10. אתר את העניבה-off הווריד הסרעפת 7-0 בתפר כמו קרוב ומקורו ככל האפשר למנוע דליפה.
  11. המעיים העכברוש באמצעות המוליך עצה של כותנה בטעימת סטרילי, עוטף את המעי גזה לחלח עם תמיסת מלח 0.9%. הקפידו לא למתוח את להערכת של המעי הדק.
  12. לנתח מעל הכלילי התחתון (IVC) כדי להסיר את עודפי רקמת. לנתח מאחורי IVC פשוט נעלה ההסתעפות ולהעביר לולאה של 4-0 בתפר משי לשימוש מאוחר יותר (איור 6).
  13. . משכי את הכליה הימנית כדי לספק חשיפה וריד הכליה. . משכי את האונה הימנית של הכבד עליונית עם גזה... . תקשור וריד הכליה 7-0 בתפר משי קרוב IVC ככל האפשר, לצרוב על פני זה דיסטלי השולטת (איור 7).
  14. בזהירות שווייץ וריד הטחול, תקשור אותו בעזרת שני תפרים משי 7-0, חצו אותה בין שתי התפרים.
  15. תקשור, מאתרים ומפסיקים ורידים נוספים באמצעות תפרים משי 7-0 עבור אורך נוסף על וריד שער הכבד, במידת הצורך.
    הערה: ישנם לפעמים ענפים קטנים של infrahepatic IVC בין וריד הכליה נכון את הכבד נחות.
  16. לנתח סביב העורק gastroduodenal, לקשור את העורק gastroduodenal 7-0 בתפר משי, מאתרים ומפסיקים את העורק gastroduodenal.
  17. לנתח סביב עורק הכבד ולאחר מכן מקם עניבה תפר משי 7-0 סביבו (איור 8).
  18. שווייץ המרה.
    1. בדוק את האורך של המרה. . תקשור צינור המרה בקצה הדיסטלי באמצעות 7-0 בתפר משי. במקום הלולאה של 7-0 בתפר משי סביב המרה הציר הקרוב ככל האפשר.
    2. לחתוך חור זה מחצית מהקוטר התעלה עם מספריים קטנות, למקם צנתר 27 G המרה הציר הקרוב. לקשור את הצנתר במקום באמצעות בתפר העניבה סנדל הרומי (איור 9).
  19. להזריק 0.5 מ של הפארין (50 U) לתוך הווריד הפין או IVC של החיה באמצעות מחט 27 גרם.
    הערה: מזרק אינסולין 27 G גם ניתן להשתמש במקום זאת.
  20. מלחציים, תקשור IVC באמצעות הקודם שמוקם תפר משי 4-0.
  21. . תקשור עורק הכבד באמצעות הקודם שמוקם תפר משי 7-0
  22. . להסיר וריד שער הכבד באמצעות סרטון המיקרוכירורגית מלקחיים נקרר את וריד שער הכבד באמצעות angiocatheter של 22 גרם. מיושרות וריד שער הכבד עם 60 מ ל תמיסת קר 0.9% עם הפרין 1 מ"ל (100 U) עד הכבד blanches (איור 10).
    הערה: אם הכבד לא בלנש מיד זה אפשר לעסות עם צמר גפן סטרילי עצה applicators.
  23. לחשוף את suprahepatic IVC, חצו אותו בתור גבוה בחזה ככל האפשר.
  24. בצע hepatectomy כדלקמן. . לחתוך את הסרעפת חתך את עורק הכבד, לחתוך את IVC, לחתוך וריד שער הכבד, לחתוך כל הרצועות נוספים, להוציא את הכבד. מקם את הכבד קרח קר 0.9% תמיסת מלח (איור 11).
  25. מקום מגבון וסקולרית 16 גרם וריד שער הכבד (איור 12). מקם את הכבד על המעגל זלוף הכבד normothermic ex-vivo .

4. זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

הערה: perfusate המשמש כאן הוכן פרוטוקול שלב 1.1.1.

  1. מקם את הצינורית וריד שער הכבד לווריד פורטל בעצור (איור 13).
  2. במהלך מיקום בצינורית וריד שער הכבד, לשמור על זרימה של perfusate דרך המעגל ב 2 מ ל/דקה כדי להתחיל. תסתכלו על המסך עבור התוך וריד שער לחץ; זה עשוי להצביע על הספינה יש להפוך occluded, מיקום מחדש של צנתרים הדרוש.
  3. תפר ב הצינורית IVC זרימה החזרה של perfusate השימוש בתפר משי 7-0.
  4. לאחר שני קנולות במקום, מתחילים להופיע את הזרימה ב- 1 מ ל/דקה עד לחץ פיזיולוגיים בטווח של 10-16 cmH2O.
  5. לקחת דגימה 1 מ"ל מן קדם ויציאות פוסט--0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו 240 דקות של זלוף. לחלק את הדגימה 1 מ"ל בשתי הדגימות 0.5 mL.
    הערה: 0.5 מ ל זה ישמש בשלב פרוטוקול 4.5.1, ו- 0.5 מ ל ישמש בשלב פרוטוקול 4.5.2.
    1. הצמד להקפיא 0.5 מ של דגימה זו צינורות קריוגני בחנקן נוזלי.
    2. להפעיל ניתוח גזים בדם באמצעות 0.5 mL הנותרים של perfusate.
    3. לאחר הפעלת הבדיקה גז דם בכל נקודה בזמן (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו- 240 דקות) לבחון את דרגות החומציות ואת החיץ את perfusate לפי הצורך כדי לחזור pH 7.4.
  6. בתום 4 שעות של זלוף, נתק את הכבד של המעגל זלוף. לחלק הכבד 0.5 ג'י מקטעים. הצמד הקפאת רקמת הכבד צינורות קריוגני בחנקן נוזלי.

5. ניסוי שלאחר ניתוח

  1. לקבוע אלנין aminotransferase (ALT) ברמה perfusate-0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו 240 דקות באמצעות ערכת מסחרי assay ערכי צבע מוחלטים.
    1. בקצרה, דגירה של perfusate עם ריאגנטים לערבב התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דק מדד הצפיפות האופטית ערכים-570 nm באמצעות קורא microplate.
  2. Homogenize 0.5 גרם של רקמת הכבד עם 100 µL פירוק מאגר ולנתח את הרקמה lysate אדנוזין טריפוספט (ATP), גלוטתיון (GSH) של malondialdehyde (מד א).
    1. בקצרה, למדוד את רמות ATP הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית. לערבב את הדגימה עם המאגר התגובה, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות מדד הצפיפות האופטית-570 nm באמצעות קורא microplate.
    2. למדוד את רמות GSH הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית. מערבבים את דגימות רקמה עם קוקטייל וזמינותו. למדוד את ערכי צפיפות אופטית-405-414 nm.
    3. למדוד את רמות מד"א של הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית. לערבב את הדגימות עם יפורסם ומחממים עד 95 מעלות צלזיוס במשך 60 דק צנטריפוגה מגיבים, להעביר את תגובת שיקוע צלחת 96-ובכן. למדוד את הצפיפות האופטית-532 ננומטר.
  3. Homogenize 0.5 גרם של רקמת הכבד עם 100 µL פירוק מאגר ולנתח את הרקמה lysate לפעילות היחסי של קספאז-3/7 באמצעות ערכת וזמינותו המסחרית.
    1. לערבב את הרקמה lysate עם המאגר assay ריאגנט קספאז-3-7, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. למדוד את רמת קרינה פלואורסצנטית כל טוב באמצעות קורא microplate.
  4. לקבוע את הרמה של מוות תאים הדגימות רקמת הכבד באמצעות ערכת זיהוי מוות מסחרי ב באתרו .
    1. מראש לטיפול של 0.5 g רקמות חלקים עם Proteinase U/mL 10 K 10 דקות, ואז דגירה עם תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות לבצע ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

גודל דגימה של חולדות שלוש לכל קבוצה היה בשימוש. ALT נמדדה ב 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו 240 דקות של זלוף. השתמשנו הסטודנט t-בדיקות כדי להשוות בין תוצאות בין הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת פג-חתול קבוצות בכל נקודה בזמן. השוואת את הבסיס perfusate ו perfusate בסיס בתוספת קבוצות פג-חתול, יש פח?...

Discussion

קיים מחסור משמעותי של allografts הכבד זמין עבור השתלת, בתגובה קריטריונים התורם היה מורחב1,2,3,4,5. בשל המחסור התורם, NEVLP כבר הציג כשיטה להעריך ולשנות איברים פונקציה6,7. עיצבנו עכ...

Disclosures

כל המחברים מדווחים שיש להם אין גילויים הרלוונטיים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32AI 106704-01A1, קרן פלש טי השתלת איברים, זלוף, הנדסה, התחדשות ב אוניברסיטת אוהיו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Perfusate
8% AlbuminCLS Behring, King of Prussia, PA0053-7680-32
Williams MediaSigma Aldrich, St. Louis, MOW1878
Penicillin/StreptomycinSigma Aldrich, St. Louis, MOP4333
InsulinEli Lilly, Indianapolis, IL0002-8215-91
HeparinFresnius Lab, Lake Zurich, ILC504701
L-glutamineSigma Aldrich, St. Louis, MOG3126
HydrocortisoneSigma Aldrich, St. Louis, MOH0888
THAMHospira, Inc,0409-1593-04
Polyethylene Glycol - CatalaseSigma AldrichS9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical MaskGenericN/A
Protective GownGenericN/A
Surgical GlovesGenericN/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley RatHarlan Sprague Dawley Inc.250 -350 grams
Surgical MicroscopeLeicaM500-N w/ OHS
Charcoal CanistersKent ScientificSOMNO-2001-8
IsofluranePiramal HealthcareN/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe Valco Instruments Co, Inc.SOMNO-10ML
Electrosurgical UnitMacanMV-7A
Warming PadBraintree ScientificHHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-MVG-Module
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RT
Isoflurane chamberKent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tabletop
OxygenPraxair98015
Rib retractorsKent ScientificINS600240
GenieTouchKent ScientificGenieTouch
Normal SalineBaxterNDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven SpongesCriterion104-2411
Sterile Q-TipsHenry Schein Animal Health1009175
U-100 27 Gauge Insulin SyringeTerumo22-272328
5mL SyringeBDREF 309603
4-0 Braided Silk SutureDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Braided Silk SutureTeleflex MedicalREF 103-S
16 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4252586-02
14 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4251717-02
Bile Duct Cannular TubingAltec01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath WarmerLauda Ecoline StareditionE103
Data Collection SoftwareADInstruments Labchart 7
Liver Perfusion CircuitHarvard Apparatus73-2901
Membrane OxygenatorMediac SPAM03069
Roller PumpIsmatecISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide)Praxair98015
Organ ChamberHarvard ApparatusILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic TubeUSA Scientific1418-7410
MucasolSigma-AldrichZ637181
Microsurgical Instruments
Small ScissorsRobozRS-5610
Large ScissorsS&TSAA-15
Forceps - Large AngledS&TJFCL-7
Forceps - Small AngledS&TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Scissors - non microFST 14958-1114958-11
Forceps - Straight TipS&TFRS-15 RM8TC
Large Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-02
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-03
Small Mosquito ClampsGenericN/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK354
Glutathione Assay KitCayman Chemical703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay KitAbcamab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay SystemsPromegaG8090
POLARstar OMEGA Microplate ReaderBMG LABTECHN/A

References

  1. . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
  2. . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
  3. Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
  4. Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
  5. Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
  6. Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
  7. Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
  8. Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
  9. Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
  10. Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
  11. Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
  12. Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
  13. Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
  14. Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
  15. Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
  16. Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
  17. Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
  18. Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
  19. Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
  20. Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
  21. He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
  22. Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
  23. Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
  24. Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
  25. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
  26. Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
  27. Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
  28. Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
  29. Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
  30. Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
  31. Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
  32. Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
  33. Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
  34. Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
  35. Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
  36. Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
  37. Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
  38. Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136Normothermic vivoNEVLP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved