活的嗅觉途径的功能评价

摘要

为研究神经系统在体内的功能提供了一个独特的平台。我们描述了在正常饲养条件下或受伤后评估生活的幼虫嗅觉信息处理的方法。

摘要

为研究神经系统的功能提供了一个独特的平台。它们提供了多种实验优势, 例如多种成像方法、电生理技术和行为检测。嗅觉系统特别适合于研究在正常发育过程中建立的突触功能或损伤后的改造功能。在这里, 我们描述的方法来评估处理嗅觉信息的生活幼虫。我们概述了在体内测量的突触前钙反应的结合在分子引导的行为检测的嗅觉球球球肾小球。方法可与嗅觉神经横断相结合, 研究突触连接的重新布线。实验是使用野生类型和转基因动物表达 gfp 记者在中枢神经系统细胞。应用所描述的转基因的方法可以很好地解开定义脊椎动物行为的分子基础。

引言

是研究神经系统正常功能的优秀动物模型。透明, 一个完全测序的基因组^1,2, 以及可获得的手术, 电生理和成像技术是独特的属性, 希望研究神经元在体内的功能 3.这种动物模型的多种实验可能性通过对感官和运动^{系统 4,5,6}进行的彻底研究说明了这一可能性。一个特别适合的神经元电路, 研究在突触水平的信息处理的许多方面是嗅觉系统 ⁷。首先, 它的突触连接是很好的定义: 嗅觉感受器神经元 (orn) 项目嗅觉灯泡和建立突触接触与树突的二尖瓣簇状细胞在肾小球内产生气味图。其次, 它的 orn 是由一生的神经发生持续产生的, 以保持嗅觉路径8的功能^.第三, 由于嗅觉系统显示出巨大的再生能力, 在烧蚀9后能够完全改造它们的嗅球.

本文介绍了将活树中嗅觉肾小球的成像与行为实验相结合的方法, 以研究嗅觉通路的功能。采用本文详细研究了嗅球在嗅觉^神经横截面10后肾小球连接的功能恢复问题。在中获得的数据是脊椎动物的代表, 因为嗅觉处理是进化守变的。

所描述的方法是用x. tropicalis进行的, 但它们可以很容易地在x 中实现。莱维斯。尽管成年的较大, 但这两个物种在阶段都非常相似。主要的差异在于基因组水平。月牙的遗传可追踪性较差, 主要由其异倍体基因组和长时间 (约 1年) 决定。相反,热带 x由于生成时间较短 (5-8个月) 和二倍体基因组, 更适合基因改造。介绍了野生动物和三个不同的转基因线的代表性实验: hb9:gfp (x. tropicalis)、Hb9:GFP (x. tropicalis) 和 tub2:gfp (x. laevis)。

目前工作中概述的方法应与xenopus领域的遗传进展一并考虑。所介绍的技术的简单性和易于实现使其特别有用, 用于评估已经描述的突变体¹¹, 以及 crispr-cas9 技术12生成的xenopus线^.我们还描述了一种用于横切嗅觉神经的外科手术, 这种手术可以在任何实验室中实施, 可以接触到。用于评估突触前钙反应和嗅觉引导行为的方法需要特定的设备, 尽管以适中的成本提供。方法以简单的形式提出, 以促进其在研究小组中的使用, 并可通过实施改进或与其他技术, 即组织学或遗传方法的联系, 为更复杂的检测奠定基础。

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研究方案

所有程序都得到了巴塞罗那大学动物研究伦理委员会的批准。

请注意:按照标准方法^13、14饲养热带和小。水是通过在反渗透获得的水中添加商业盐 (见材料表) 来制备的。电导率分别调整为 x .营养素和x. laevis 的 ~ 700μs 和 ~ 1400μs。幼虫可以通过自然交配或体外受精^获得14。胚胎被 djely而至 2% l-半胱氨酸准备在 0.1 x 马克的修改环 (mmr)。1x mM 包含 (mm): 100 氯化碳, 2 kcl, 1 mgso 4, 2 ccl₂,5 hepes, 0.1 edta, ph 7.8。幼虫在 2-3天 (第25个阶段) 后转移到2升储罐中, 并有水。当达到 nieuwkoop-faber (nf) 标准¹⁵的第40个阶段时, 它们被放置在5升的储罐中, 并保持在10动物的密度, x. tropicalis和x. laevis的温度保持在23–25°c 和18-20°c 的恒定温度。分别是。在 nf 标准的48-52 阶段发现的动物被用于实验。

1. 嗅觉神经的横截面

1. 在室温下, 在50毫升的水中制备 0.02% ms-222 的麻醉液。
2. 准备一个小水箱 (1-2 l) 与水, 使动物在手术后恢复。
3. 切割长方形的纤维素定性滤纸 (4 厘米 x3 厘米, 见材料表)。
4. 将2块纤维素定性滤纸放入 0.02% ms-222 溶液中, 置于解剖范围内。
5. 从水箱中挑出一根子, 将其浸入麻醉溶液中。动物在2-4分钟内停止游泳, 不会对使用推子在尾部施加的机械刺激做出反应。
6. 将麻醉后的子放在矩形滤纸上。将动物的背侧朝上放置, 这样大脑结构就可以可视化。
   1. 使用 vannas 剪刀 (见材料表) 切割一个或两个嗅觉神经 (取决于要进行的检测类型)。将单个神经交叉用于需要对神经损伤进行内部控制的实验。
   2. 对于行为实验, 横切这两个神经, 以抑制所有气味信息到达嗅觉灯泡。在解剖范围内, 可以很容易地观察到嗅觉神经的切片效率;然而, 色素沉着或动物的位置可能是限制因素。
      请注意:(可选)证明该程序有效性的最佳方法是使用转基因表示他们的神经系统上的荧光记者 (见代表性的结果)。为此, 有必要使用装有荧光的解剖示波器 (图 1)。如果只有野生类型的动物可用, 可以使用 CM-diI 跟踪。按照协议 2 (见下文) 在鼻腔胶囊中注入 0.5 mg/ml 溶液中的 cm-dii 在 0.3 m 蔗糖中制备。有关 cm-dii 的制备和储存的详细信息, 请参见¹⁶ 。必须尽量减少染料从主腔中泄漏。为此, 有必要修改注射压力和微移液器的打开。应用 cm-di 24小时后, 嗅球肾小球层水平的荧光明显。目前的工作使用标签与 CM-diI 只是为了证明横截面程序;然而, 该方法也可用于利用常规组织学程序获取嗅觉肾小球的形态信息。
7. 将动物转移到回收池。应在 ~ 10分钟内恢复正常游泳, 对出血的存在进行仔细检查, 预计约1% 的动物接受手术。
8. 在 0.2% ms-222 溶液中对受伤动物进行安乐死。

2. 用荧光钙指标标记嗅觉受体神经元

1. 准备含有12% 的格林-1-糊精钙 (见材料表)、0.1% triton x-100 和 1 mm ncl¹⁷的溶液。如果在一个月内不使用溶液, 请将溶液存放在-20°c 或-80°c。
2. 准备尖端开孔 ~ 1–2μm 的玻璃移液器 (与用于膜片钳实验的微电极相似), 用于使用微移液器拉拔器进行微注射 (见材料表)。
3. 校准微注射的体积。使用蒸馏水, 调整压力和注射时间, 以获得0.15–0.3μl 的注射量。
   请注意:一个简单的过程是计算清空充满1μl 水的移液器所需的脉冲数。典型的参数是 30 psi 和 50 ms 注入时间的压力。
4. 将移液器放入微喷射器中, 并使用 ~ 2μl 的绿色-1 右旋糖酐溶液加载。
5. 按照步骤1.1 到1.6 准备一只子。
6. 将移液器的尖端移动到鼻腔胶囊的主腔中。
   请注意:参见图 2a 描述了中嗅觉路径的位置。
7. 使用2.3 中获得的设置, 提供几个吹泡。将染料的存在限制在鼻腔胶囊上。
8. 让休息 2-3分钟, 使用巴斯德移液器, 在动物较多的尾端上倒入0.02% 的 ms-222 溶液, 以避免干燥。
9. 将动物转移到回收槽中。
   请注意:应在 ~ 10分钟内恢复正常游泳, 操纵动物可能会造成伤害。
10. 使用 0.2% ms-222 溶液在注射15分钟后不恢复正常游泳行为的小。
11. 在注射后的第二天观察嗅球肾小球层水平的荧光。

3. 突触前反应实时成像用的制备

1. 在进行实验前24–48小时, 用有机硅弹性体 (例如, sylgard) 涂覆直径为35毫米的4-6 粒培养皿。一旦弹性体聚合, 就用一个长方形的井来安装。
   请注意:在48–52个 nf 阶段发现的x . 热带的典型尺寸为10毫米 x 4 毫米。
2. 制备一个160μm 至 1 mm 氨基酸溶液的100毫升, 作为对的气味刺激。该溶液可包含多种氨基酸的混合物: 蛋氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。稀释xenopus ringer 溶液中的氨基酸, 由 (mm) 组成: 100 氯化萘、2 kcl、1 ccl₂、2 mgcl 2、10葡萄糖、10 hepes、240 mosmkg、ph 7.8。确保 ph 值保持在7.8。
3. 用20毫升的氨基酸溶液填充高架储层。用聚乙烯导管将储罐连接到放置在鼻腔胶囊上方的28g 毛细管 (见材料表)。
   请注意:毛细管安装在微机械手上 (见材料表)。灌注系统中必须没有气泡。
4. 使用电磁阀夹紧阀的晶体管-晶体管逻辑 (ttl) 控制, 实现氨基酸溶液的应用时间精度 (见材料表)。刺激器用于产生 ttl 脉冲 (见材料表)。通过更改 ttl 脉冲的持续时间 (即0.1 至 1秒), 检查时间精度以提供气味溶液。
5. 用100毫升的溶液填充另一个高架水库。
6. 对进行麻醉, 并将其置于解剖范围内 (步骤1.1 至 1.6)。
7. 准备一只用于成像的。如果白化病是可用的, 请继续执行步骤 3.9, 否则将嗅球上方的皮肤移开, 因为它含有损害成像的黑素细胞 (步骤 3.8)。
   请注意:根据动物的色素沉着情况, 有两种方法可以进行实验。最好使用白化病动物。白化病菌株可用于x. laevis 和白化病 x. 热带病毒线最近已生成的 crispr-cas9 ¹²或 talens ¹⁸。
8. 使用万纳剪刀, 在中枢神经系统边缘的皮肤上做一个外侧切口。使切割应在嗅球的水平上进行, 永远不会达到球的位置, 这可以很容易地通过视神经的位置来识别。
9. 用推子捏伤口的皮肤, 把它拉过神经系统。通过嗅球上方没有黑素细胞来验证成功去除。使用巴斯德移液器浇注 0.02% ms-222 溶液, 保持动物湿润。
10. 将子放入涂层盘的井 (见材料表)。在动物上方涂上涂上高真空油脂的玻璃盖板。将盖板放置到尾部的顶部。
11. 确保嗅球和胎盘保持暴露在细胞外介质中。在成像过程中保持不动。用含有100μm 管尿款 (见材料表) 的 xenopus 林格液填充培养皿, 以防止肌肉收缩.
    请注意:在-80°c 下, 在不超过6个月的温度下, 将其储存在脂肪中。
12. 将盘子放在直立的显微镜下, 将子放在一起。使用聚乙烯管材 (见材料表) 将含有xenopus林格溶液的储层与使用聚乙烯管材 (见材料表) 的盘连接, 以便连续灌注 xenopus 林格溶液, 以保持动物的生命, gt;1 h.
    请注意:微型磁性夹具 (见材料表) 对于将管道稳定地连接到盘子非常有用。输液管和吸管必须位于 ~ 180°角。
13. 开始完善xenopus林格的解决方案。在整个实验过程中, 保持菜品溶液的水平不变。通过观察血管内的血液循环, 持续评估的生存能力。

4. 突触前钙 2⁺嗅觉肾小球变化的实时成像

请注意:成像过程描述了广域显微镜, 但可以很容易地适应共聚焦显微镜通过调整采集设置。成像应在安装在防振台上的立式显微镜中进行。

1. 用低放大倍率来可视化子, 例如5倍。
2. 移动微机械手轴, 将毛细管输送气味溶液放在一个鼻囊的顶部, 用嗅觉神经形成90°角。应避免嗅球上方的气味溶液流动, 因为它可能会引起扭曲成像的湍流。
3. 使用高放大倍率、长工作距离、水浸目标: 60xx、0.9 n. a., 找到位于鼻囊侧的嗅球 (受刺激)。
4. 检查眼睛的荧光发射。肾小球结构应该是明显的 (图 2b)。
5. 使用适用于钙成像的相机进行现场采集。定义一个包含整个嗅觉灯泡的框, 通常为 256 x 256 或 512 x 512 像素。将采集帧速率采集设置为 20–40 hz. 调整增益, 使基部荧光值约为饱和度的20%。获取5秒的视频。
6. 可视化影片。检查图像焦点、没有运动工件和包含饱和像素的区域。如果使用16位相机, 肾小球区域的典型荧光值应为 5000–20000 a. u.。如果成像条件最佳, 请继续执行下一步。如果需要, 请重复步骤 4.6, 以提高图像质量或调整增益设置。
7. 开始延时采集, 记录嗅觉刺激引起的反应。
   请注意:气味溶液的精确应用由 ttl 刺激控制。一个典型的实验包含基线周期为 4秒, 然后是从0.1 到0.5秒的刺激时间和6-10秒的恢复期。
8. 对气味进行重复刺激, 以达到时间间隔 & gt;2 分钟, 将流速设置为 1-1 ml·min-1.由于在所有实验过程中都进行了全球灌注, 局部应用的氨基酸被冲走。
   请注意:盘中溶液的体积约为3毫升。
9. 图像分析
   1. 检测响应
      1. 将电影导出到 imagej。
         请注意:目标是检测对刺激有反应的肾小球区域的存在。
      2. 将荧光图像的原始序列转换为 fa0₀电影。根据以下关系测量基部荧光的相对变化: (f-f₀)/f₀, 其中 f₀表示基线荧光水平。
      3. 在刺激过程中, 在显示假定荧光的区域周围绘制感兴趣的区域 (roi) 会增加, 并记录它们在 roi 管理器中的位置 (图 2e)。绘制 roi, 以检测无肾小球结构区域的背景荧光水平。
   2. 答复的量化。
      1. 将定义的 roi 放在荧光图像的原始序列中。获取每个帧所选 roi 的平均灰度值。将获得的值序列传输到分析程序 (例如, igor pro)。
      2. 减去背景荧光, 然后计算每个 roi 的 fa0 f0_变化(图 2f)。为所选的每个 roi 绘制 " f/f 0" 中的增量。计算基部 fcf_{0 的}标准偏差 (刺激前)。
         请注意:如果在刺激过程中得到的 fcf₀的增加大于基值的2个标准偏差, 则考虑正反应。

5. 嗅觉引导下的行为检测

请注意:执行检测的设置示意图如图 3所示。

1. 在6井盘的上部打小孔, 以容纳 1.57 mm 的 o. d. x 1.57 mm i. d. 管材。使用环氧树脂粘合剂插入管材和密封件 (参见材料表)。
   请注意:经修改的菜可以在用蒸馏水彻底清洗后重复使用多次。
2. 制备含有蛋氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸的氨基酸溶液50毫升 (详见步骤 3.2)。浓度范围为160μm 至 1 mm。将溶液的20毫升置于高架储集层中。
3. 在检测前至少12小时内不要给虫喂食。从它们的外壳水箱中取出6头, 并将它们放入2升的干净水中, 以尽量减少接触气味。
4. 将修改后的6口井盘放在白色 led 透射照明器上 (图 3)。
5. 使用流形将灌注入口与含有氨基酸溶液的储层结合在一起 (见材料表)。检查灌注系统, 消除气泡。同时填充6口井。调整储层高度, 允许在 ~ 30秒内输送≥5毫升的气味溶液。
   请注意:在接触气味溶液后, 用双蒸馏水清洗每口井4次。
6. 在每口井里灌满10毫升的水。放置1塔多内利/井。休息 gt;3 分钟。
7. 设置图像采集。使用传统的 ccd 摄像机, 可以在≥5 hz 的情况下获取图像. 将相机连接到计算机。在这里, 使用蔡司 mrc5 相机控制禅宗软件, 但其他等效配置可以使用。如果需要提高帧速率, 请应用像素分组。图片应该显示整个6井菜。
8. 开始图像采集, 使电影包含基础 (30秒)、刺激 (25–35 s) 和恢复 (30–60秒) 周期。
9. 成像后将6口井的动物送回水箱。
10. 使用诸如 wrmtrck^19、20等插件在 imagej^中分析影片, 这些插件提供了与动力相关的多个参数。
11. 要准备要分析的图像, 首先要通过绘制 35 mm x 35 mm 的矩形 roi 来选择井 (图 4a)。通过计算整个序列的最大投影来获取背景图像。它应该在没有的情况下显示井的图像。
12. 从原始影片中减去最大投影。对生成的32位影片执行阈值, 并应用 wrmtrck 插件。调整 wrmtrck 参数, 以可靠地跟踪动物的运动。将得到的 x、y 坐标传输到分析程序中。
13. 使用 x-y 坐标, 通过应用以下公式计算到气味源 (井中的灌注入口) 的欧几里得距离:
    
    其中 os 指示气味源的位置, tad 表示在给定时间的位置。有关详细信息, 请参阅图 4a 。

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结果

本文提出了两种互补方法的组合, 对的功能进行体内研究: i) 一种成像突触前钙 2⁺生命肾小球变化的方法使用荧光钙指示剂的, 和 ii) 气味引导行为检测, 可用于研究对特定水性气味的反应。由于这些方法已被用来评估^{受伤 10}后嗅觉处理的恢复情况, 因此还介绍了一种简单的造嗅觉神经横切方法。

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讨论

本文介绍了一些技术, 这些技术对于研究活中嗅觉通路的功能很有用。目前的议定书对那些工作或能够进入xenopus的实验室特别有用;然而, 这也是有趣的那些研究神经元再生和修复的细胞和分子基础的研究人员。在中获得的结果可以与其他脊椎动物模型中收集的数据结合起来, 以确定保守的机制。所描述的方法将受益于转基因^18、22

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)	Tecniplast	XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)	World Precision Instruments	501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)	World Precision Instruments	501778
Whatman qualitative filter paper	Fisher Scientific	WH3030917
X. laevis tubb2-GFP	National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731	NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP	European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI	ThermoFisher Scientific	C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic	ThermoFisher Scientific	C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection	Sutter Instrument	B100-75-10	O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller	Sutter Instrument	P-97
Microinjector	Parker Instruments	Picospritzer III
Sylgard-184	Sigma-Aldrich	761028-5EA
Microfil micropipettes	World Precision Instruments	MF28G-5
Upright microscope	Zeiss	AxioImager-A1
Master-8 stimulator	A.M.P.I.
CCD Camera	Hamamatsu	Image EM
Solenoid valves	Warner Instruments	VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR Scientific	636082B
Tubocurarine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T2379
CCD Camera	Zeiss	MRC-5 Camera	Controlled by Zen software
camera lens	Thorlabs	MVL8ML3	There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin	RS Components
Manifold	Warner Instruments	MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions	Narishige	MN-153
Mini magnetic clamps	Warner Instruments	MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0755	O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.