JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Xenopus головастиков предлагают уникальную платформу для изучения функции нервной системы в естественных условиях. Мы описываем методологий для оценки обработка обонятельной информации в живых личинок Xenopus в нормальных условиях воспитания или после травмы.

Аннотация

Xenopus головастиков предлагают уникальную платформу для изучения функции нервной системы. Они обеспечивают несколько экспериментальных преимущества, такие как доступность многочисленных изображений подходов, электрофизиологические методы и поведенческих анализов. Xenopus головастика обонятельной системы особенно хорошо подходит для изучения функции синапсов во время нормального развития или реформировать после травмы. Здесь мы описываем методологий для оценки обработка обонятельной информации в живых личинок Xenopus . Мы наметим сочетание в естественных условиях измерений Пресинаптический кальция ответов в клубочков обонятельные луковицы с обонятельных руководствуясь поведение анализов. Методы могут быть объединены с перерезка обонятельных нервов для изучения переоснащая синаптических подключения. Эксперименты представлены с использованием одичал тип и генетически модифицированных животных, выражая GFP репортеров в клетках центральной нервной системы. Применение подходов, описанных в генетически модифицированных головастиков может быть полезным для распутывая молекулярные основания, которые определяют поведение позвоночных.

Введение

Xenopus головастиками представляют отличную животных модель для изучения нормальной функции нервной системы. Прозрачность, полностью виртуализированного генома1,2и доступности методов хирургического, электрофизиологических и изображений являются уникальными свойствами Xenopus личинок, которые позволяют расследований нейронов в естественных условиях3 . Некоторые из нескольких экспериментальных возможностей этой модели на животных показано тщательного исследования головастика сенсорные и моторные системы4,5,6. Особенно хорошо подходит нейронной цепи для изучения многих аспектов обработки на уровне синапсов информации является Xenopus головастика обонятельной системы7. Во-первых, его синаптической связи четко определены: обонятельных рецепторов нейронов (ORNs) проект обонятельные луковицы и установить синаптических контактов с дендриты митрального клапана/тафтинговые клеток внутри клубочков для создания карты запах. Во-вторых его ORNs постоянно создаются нейрогенез на протяжении всей жизни для поддержания функциональности обонятельные пути8. И в-третьих, потому что Обонятельная сенсорная система показывает большой потенциал рекуперативного, Xenopus головастиками способны полностью реформировать их обонятельные луковицы после аблации9.

В этой статье мы описываем подходы, которые сочетают изображения обонятельных клубочков в жизни головастики с поведенческой экспериментов для изучения функциональность обонятельных путей. Описанные здесь методы были использованы для изучения функционального восстановления клубочковых подключения в обонятельные луковицы после Обонятельный нерв перерезка10. Данные, полученные в Xenopus головастиками являются представитель позвоночных, поскольку обонятельные обработка эволюционной сохраняется.

Описанные методы являются примером с помощью X. tropicalis , но они могут быть легко реализованы в X. laevis. Несмотря на больший размер взрослых X. laevisоба вида являются на удивление схожими стадии головастика. Основные различия находятся на уровне генома. X. laevis отображает бедные генетических уступчивость, главным образом определяется ее интрогрессии генома и долго поколения время (приблизительно 1 год). В отличие от X. tropicalis более пригодным для генетических изменений из-за его короче время генерации (5-8 месяцев) и диплоидных генома. Представитель эксперименты проиллюстрированы одичал тип животных и три различных трансгенных линий: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) и tubb2:GFP (X. laevis).

Методологии, изложенной в текущей работе должен рассматриваться наряду с генетической прогрессирует в поле Xenopus . Простота и простая реализация методы, представленные делает их особенно полезными для оценки уже описанных мутантов11, а также линии Xenopus порожденных ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технологии12. Мы также описания хирургическая процедура, используемая для трансектных обонятельные нервы, которые могут осуществляться в любой лаборатории, имеющие доступ к Xenopus головастиками. Подходы, используемые для оценки реакции Пресинаптический кальция и обонятельные руководствуясь поведения требуют специального оборудования, хотя доступен за умеренную плату. Методологии представлены в простой форме для содействия их использованию в научно-исследовательских групп и может установить баз более сложных анализов, либо путем реализации улучшений ассоциации с другими методами, т.е., гистологические или генетические подходы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были утверждены Комитетом этике исследований на животных в университете Барселоны.

Примечание: X. tropicalis и X. laevis головастиков выращиваются в соответствии со стандартными методами13,14. Головастик вода готовится путем добавления воды, полученные путем обратного осмоса коммерческих соли (см. Таблицу материалы). Проводимость корректируется ∼700 МКС и ∼1, 400 МКС для X. tropicalis и X. laevis головастиков, соответственно. Личинки могут быть получены либо природных спаривания или оплодотворение in vitro14. Эмбрионы dejellied с 2% L-цистеина, подготовленном в 0.1 x Марк изменения Ringers (MMR). 1 x MMR содержит (в мм): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 ЭДТА, pH 7,8. Личинки переносятся после 2-3 дня (этап 25) 2 L цистерн с водой головастик. Когда головастиков достигают стадии 40 Nieuwkoop-Фабер (NF) критерии15, они помещаются в 5 Л танков и поддерживается на плотность 10 животных/л. температура остается неизменной на 23 – 25 ° C и 18 – 20 ° C для X. tropicalis и X. laevis головастики, соответственно. Животных, найденных на этапах 48 — 52 NF критерии используются для экспериментов.

1. перерезка обонятельных нервов

  1. Подготовить обезболивающим раствор 0,02% MS-222 в 50 мл воды головастика при комнатной температуре.
  2. Подготовьте небольшой бак (1 – 2 Л) с головастика воды, чтобы обеспечить возможность восстановления животных после операции.
  3. Разрезать прямоугольные куски качественный фильтр целлюлозная (4 см x 3 см, см. Таблицу материалы).
  4. Мокрые 2 бумажки целлюлозы качественный фильтр в 0,02% раствора MS-222 и разместите их под рассечения сферы.
  5. Выберите головастиков из бака и погрузите его в решение обезболивающим. Животное останавливается плавательный в течение 2-4 мин и не реагируют на механических раздражителей, применяемых на уровне хвост с помощью пинцета.
  6. Место наркотизированных головастика на прямоугольные куски бумаги. Позиция животное с его дорсальной стороной вверх, поэтому могут быть визуализированы структуры мозга.
    1. С помощью беззаботными ножницы (см. Таблицу материалы) вырезать одной или обеих обонятельных нервов (в зависимости от типа анализа осуществляться). Разрез одного нерва для экспериментов, которые требуют внутреннего контроля травмы нерва.
    2. Для поведенческой экспериментов разрез и нервы для того, чтобы подавить всю информацию одоранта, прибывающих в обонятельные луковицы. Эффективность секционирование обонятельных нервов может легко наблюдается рассечения сферу; Однако пигментации или животного позиции может сдерживающими факторами.
      Примечание: (Необязательно) Лучший способ удостоверять действительность процедуры с использованием трансгенных головастиков, которые выражают флуоресцентные репортеры на их нервной системы (см. Представитель результаты). С этой целью необходимо использовать рассечение область с флуоресценцией (рис. 1). Если одичал тип животных доступны, только трассировки с CM-дии могут быть использованы. Следуйте протокол 2 (см. ниже) для введения 0,5 мг/мл раствора CM-дии в 0,3 М сахарозы в носовой капсулой. Смотреть 16 для деталей на приготовления и хранения см дии. Необходимо свести к минимуму утечки красителя из основной полости. С этой целью необходимо изменить давление впрыска и открытие micropipettes. Флуоресцирование на уровне клубочковых слоя обонятельные луковицы становится очевидным 24 ч после применения CM-дии. Настоящая работа использует маркировки с CM-дии просто чтобы сертифицировать перерезка процедуры; Однако этот метод также может использоваться для получения морфологической информации обонятельных клубочков, с использованием обычных гистологические процедур.
  7. Передача животных в резервуар восстановления. Головастики следует восстановить нормальный плавательный в течение ~ 10 мин выполнять тщательную проверку на наличие кровоизлияний, которые, как ожидается, в ~ 1% животных подвергаются хирургии.
  8. Усыпить раненых животных в 0,2% раствор MS-222.

2. Маркировка обонятельных рецепторов нейронов с показателями флуоресцентные кальция

  1. Подготовить раствор, содержащий 12% кальция зеленый-1-декстрана (см. Таблицу материалы), 0,1% тритон X-100 и 1 мм NaCl17. Сохранить решение при-20 ° C или при температуре-80 ° C, если это не могут быть использованы в течение одного месяца.
  2. Подготовиться с помощью съемника микропипеткой микроинъекции стеклянной пипетки с кончика отверстия ~ 1-2 мкм (аналогичные диаметром до микроэлектродов используется для патч зажим экспериментов) (см. Таблицу материалы).
  3. Калибровка объем микроинъекций. С помощью дистиллированной воды, отрегулировать давление и инъекции время для получения томов инъекций 0,15-0,3 мкл.
    Примечание: Простая процедура состоит в подсчете количество импульсов, необходимых для очистки пипетки заполнены с 1 мкл воды. Типичные параметры находятся под давлением 30 psi и 50 мс время впрыска.
  4. Место пипетки в microinjector и загрузить его с ~ 2 мкл раствора кальция зеленый-1 декстрана.
  5. Подготовьте следующие шаги 1.1-1.6 головастиков.
  6. Переместите кончиком пипетки в главных полость носа капсулы.
    Примечание: Смотрите Рисунок 2A , описывающий местоположение обонятельных путей в Xenopus головастиков.
  7. С помощью параметров, полученных в 2.3, доставить несколько затяжек. Ограничьте присутствие краситель носовой капсулой.
  8. Пусть головастика отдых для 2-3 мин, с помощью пипетки Пастера, налить капель MS-222 0,02% раствора на более хвостовой части животного, чтобы избежать высыхания.
  9. Передать животное восстановления танк.
    Примечание: Он должен восстановить нормальный плавательный в ~ 10 мин манипуляции животных может вызвать травмы.
  10. Усыпить головастиков, которые не восстановить нормальный плавательный поведение 15 мин после инъекции, 0,2% раствором MS-222.
  11. Соблюдайте флуоресцирования на уровне клубочковых слоя обонятельные луковицы на следующий день после инъекции.

3. Подготовка головастики живут изображений Пресинаптический ответов

  1. 24-48 ч до проведения эксперимента, пальто 4 – 6 чашек Петри диаметром 35 мм с силиконового эластомера (например, Sylgard). Как только полимеризуется эластомер, изготовить прямоугольные хорошо подогнать головастик.
    Примечание: Типичные размеры для X. tropicalis головастиков, найденных на этапах NF 48 — 52 являются 10 x 4 мм.
  2. Подготовка 100 мл 160 мкм до 1 мм амино кислоты раствор, действуя как одоранта стимул для головастиков. Решение может содержать смесь нескольких аминокислоты: метионин, лейцин, гистидин, аргинин и лизин. Разбавить аминокислоты в Xenopus Рингера раствор, состоящий из (в мм): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 глюкозы, 10 HEPES, 240 мОсм/кг, pH 7,8. Убедитесь, что рН поддерживается на 7,8.
  3. Заполните повышенный резервуар с 20 мл раствора аминокислоты. Подключите водохранилища с полиэтиленовой трубы к 28 G капилляр (см. Таблицу материалы) размещены выше носовой капсулой.
    Примечание: Капиллярная трубка монтируется на микроманипулятор (см. Таблицу материалы). Пузырьки воздуха должны отсутствовать из системы перфузии.
  4. Добиться временной точности в применении решение аминокислота, используя Транзисторно транзисторная логика (ТТЛ) управления электромагнитный щепотку клапанов (см. Таблицу материалы). Стимулятор используется для создания TTL импульсов (см. Таблицу материалы). Проверка точности временной доставить одоранта решения путем изменения длительности импульсов TTL, т.е.., s 0.1 до 1.
  5. Заполните другой повышенный резервуар с 100 мл раствора Рингера Xenopus .
  6. Анестезировать головастиков и поместите его в область рассечения (шаги 1.1-1.6).
  7. Подготовьте головастиков для изображений. Если доступны альбинос головастиков переходите к шагу 3.9, в противном случае удалить кожи над обонятельные луковицы, потому что она содержит меланоцитов, которые ослабляют изображений (шаг 3,8).
    Примечание: Существует два способа выполнить эксперимент в зависимости от пигментации животного. Предпочтительнее использовать альбинос животных. Альбинос штаммы доступны для X. laevis и Альбино X. tropicalis линии недавно созданные ТРИФОСФАТЫ-Cas9 12 или18Таленс.
  8. Ножницами беззаботными, сделайте боковой надрез на коже головастика на краю центральной нервной системы. Следует сделать разрез на уровне обонятельные луковицы и никогда не достигает позиции tectum, которые могут быть легко идентифицированы по местоположению зрительного нерва.
  9. Щепотка вырезать кожу с помощью пинцета и натяните его нервной системы. Проверка успешного удаления отсутствие меланоцитов выше обонятельные луковицы. Держите животное влажные, поливая капли 0,02% раствора MS-222 с помощью пипетки Пастера.
  10. Место головастиков в колодец с покрытием блюдо (см. Таблицу материалы). Положите стекло coverslip покрытием с высокой вакуумной смазка выше животного. Поместите coverslip для покрытия верхней части tectum до конца хвоста.
  11. Убедитесь, что обонятельные луковицы и плакод остаются подверженными внеклеточных среды. Держите головастика неподвижной во время визуализации. Заполните чашку Петри с Xenopus звонаря solutioncontaining 100 мкм тубокурарин (см. Таблицу материалы), чтобы предотвратить сужения мышцы.
    Примечание: Тубокурарин хранится в аликвоты-80 ° c не более чем 6 месяцев.
  12. Поместите блюдо Холдинг головастиков под микроскопом вертикально. Подключите водохранилище, содержащих раствор Рингера Xenopus с блюдо с использованием полиэтиленовых труб (см. Таблицу материалы) для непрерывной перфузии Xenopus Рингера раствор для держать животное в живых для > 1 час.
    Примечание: Мини-магнитные зажимы (см. Таблицу материалы) очень полезны для стабильно соединения труб на блюдо. Перфузии и всасывающие трубы должны быть расположены в ~ 180° угол.
  13. Начало perfusing раствор Рингера Xenopus . Поддерживать уровень раствора в блюдо постоянной на протяжении всего эксперимента. Постоянно оцените жизнеспособность головастика, наблюдая за циркуляцию крови по сосудам.

4. живут изображений Пресинаптический Ca2 + изменений в обонятельные клубочков

Примечание: Визуализации процедура описана для микроскопии поля, но могут быть легко адаптированы к конфокального микроскопа, регулируя параметры приобретения. Изображения должны осуществляться в вертикальном Микроскоп, монтируется на столе вибрации.

  1. Визуализировать головастиков с низким увеличением цели, например 5 x.
  2. Перемещение осей микроманипулятор для размещения капилляров, обеспечивая решение одоранта на вершине один носовой капсулой, образуя под углом в 90 ° с Обонятельный нерв. Поток раствора одоранта выше обонятельные луковицы следует избегать, поскольку это может привести к турбулентности, которые искажают изображение.
  3. Обонятельные луковицы ипсилатерально расположен в носовой капсулы (в зависимости от стимуляции) с помощью большого увеличения, рабочим расстоянием, воды погружение цель найти: 60Xx, 0,9 н.а.
  4. Проверьте флуоресценции выбросов на глаз. Клубочковых структур должно быть очевидным (рис. 2B).
  5. Выполняют живой приобретения с камерой для кальция изображений. Определите окно, содержащее весь обонятельные луковицы, как правило, 256 x 256 или 512 x 512 пикселей. Набор приобретение кадров стоимость приобретения до 20 – 40 Гц. Отрегулируйте выигрыш, так что значения базальной флуоресценции ~ 20% насыщения. Приобрести 5 s видео.
  6. Визуализируйте фильма. Проверьте изображение фокус, отсутствие артефактов движения и регионов, содержащих насыщенные пикселей. Типичный флуоресценции значения клубочковых регионов должна быть 5000-20000 а.е. Если с помощью 16-разрядной камеры. Переходите к следующему шагу, если изображений условия являются оптимальными. Повторите шаг 4.6 Если необходимо улучшить качество изображения или получить настройки.
  7. Начало промежуток времени приобретения для записи ответов, вызываемые обонятельные стимулы.
    Примечание: Точное применение раствора одоранта контролируется TTL раздражителей. Типичная эксперимент содержит базовый период 4 s, следуют стимуляции раз от 0.1 до 0.5 s и восстановительный период 6 – 10 сек.
  8. Выполнение повторяющихся стимуляцию Отдушки для интервалов времени > 2 мин Установите скорость потока-1-1,5 mL·min-1. Так как глобальные перфузии на во всех экспериментах, локально прикладной аминокислоты вымываются.
    Примечание: Объем раствора в блюдо составляет ~ 3 мл.
  9. Анализ изображений
    1. Обнаружение ответов
      1. Экспорт фильмов в ImageJ.
        Примечание: Цель Обнаружение присутствия клубочковых регионов, реагировать на раздражители.
      2. Преобразуйте необработанные последовательность изображений флуоресценции в кино0 ΔF/F. Измерить относительные изменения в базальной флуоресценции согласно следующие отношения: (F-F0) / f0, где F0 указывает базовые уровни флюоресценции.
      3. Нарисуйте регионы интереса (ROI) вокруг районов показаны предполагаемые флуоресценции увеличивается во время стимуляции и записывать их позиции в менеджере ROI (2 рисунокE). Нарисуйте ROI для обнаружения фоновые уровни флюоресценции в районе лишенный клубочковых структур.
    2. Количественная оценка ответов.
      1. Место определенные ROIs в сырой последовательности изображений флуоресценции. Получите среднее значение серого выбранных трансформирования для каждого кадра. Передача последовательности значений, полученных для анализа программы (например., Игорь Pro).
      2. Вычитание фона флуоресценции, а затем вычислить ΔF/F0 изменения для каждой ROI (Рисунок 2F). Участок увеличение ΔF/F0 для каждого из выбранных ROIs. Вычислите стандартное отклонение базальной ΔF/F0 (до стимуляции).
        Примечание: Положительный ответ считается, если увеличение ΔF/Ф0 , полученный при стимуляции размером более 2 стандартных отклонения базальной ценностей.

5. обонятельных руководствуясь поведение Assay

Примечание: Схема установки для выполнения анализа показано на рисунке 3.

  1. Сделайте небольшие отверстия по размеру трубки 1,14 мм ID O.D. x 1.57 мм в верхней части каждой скважины 6-ну блюдо. Вставить трубку и печатью с помощью эпоксидного клея (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Изменение блюдо может быть повторно использован много раз после тщательного мытья с дистиллированной водой.
  2. Подготовка 50 мл раствора аминокислоты, содержащие метионин, лейцин, гистидин, аргинин и лизин (см. шаг 3.2 для подробной информации). Концентрации может варьироваться от 160 мкм до 1 мм. Место 20 мл раствора в повышенных водохранилище.
  3. Не кормите головастиков для по крайней мере 12 h до assay. Взять 6 головастиков от их корпус танка и поместите их в 2 Л воды чистой головастика для сведения к минимуму воздействия одорантов.
  4. Место изменение блюдо 6 скважин на белый LED-transilluminator (рис. 3).
  5. Пара входов перфузии в водохранилище, содержащий аминокислоты решения с помощью коллектора (см. Таблицу материалы). Проверка системы перфузии и устранить воздушные пузыри. Заполните 6 скважин одновременно. Отрегулируйте высоту водохранилища, чтобы разрешить доставку ≥5 мл раствора одоранта в течение ~ 30 s.
    Примечание: Мыть каждый хорошо 4 раза с двойной дистиллированной водой после экспозиции одорант решение.
  6. Заполните каждый хорошо с 10 мл воды головастик. 1 место головастика/хорошо. Отпуск для отдыха > 3 мин.
  7. Настройка загрузки изображений. Используйте обычные CCD камера, которая может приобрести изображений на ≥5 Гц. Подключите камеру к компьютеру. Здесь, использовать камеру Zeiss MRC5 контролируется Zen программное обеспечение, но другие эквивалентные конфигурации могут быть использованы. Если это необходимо увеличить частоту кадров, примените биннинга пикселей. Изображения должны показать весь 6-ну блюдо.
  8. Начало захвата изображений таким образом, что фильмы содержат базальной (30 s), стимул (25 – 35 s) и восстановления (30-60 s) периодов.
  9. Вернуться животных из 6 скважин блюдо танки после съемки.
  10. Анализируйте фильмы в ImageJ, с помощью плагинов, например wrMTrck19,20 , которые предоставляют несколько параметров, связанных с подвижности.
  11. Чтобы подготовить изображения для анализа, сначала выберите колодец, рисование прямоугольного ROI 35 x 35 мм (рис. 4A). Получите фоновое изображение путем расчета максимальной проекции всей последовательности. Он должен отображать изображение скважины без головастик.
  12. Вычтите максимальной проекции от сырой фильм. Порог на созданный фильм 32-разрядных и применять плагин wrMTrck. Настройте параметры WrMTrck надежно отслеживать животных движений. Передача полученных X, Y координаты в программу анализа.
  13. Координат с помощью X-Y, вычислить евклидово расстояние к источнику одоранта (перфузии вход в колодец), используя следующее уравнение:
    figure-protocol-18642
    где ОС указывает положение источника запаха и чуть указывает позицию головастиков в заданное время. Смотрите Рисунок 4A для деталей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этой статье, мы представляем сочетание двух взаимодополняющих подходов для выполнения в vivo исследования функциональности Xenopus головастика обонятельной системы: я) метод для визуализации Пресинаптический Ca2 + изменения в клубочков жизни с использова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот документ описывает методы, которые полезны для расследования функциональность обонятельных путей в жизни головастики Xenopus . Текущий протокол является особенно полезным для тех лабораторий, которые работают, или иметь доступ к Xenopus; Однако это также интересно для тех иссл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана от грантов от y El Ministerio де Economía развитию (МИНЕКО; SAF2015-63568-R) cofunded Европейского фонда регионального развития (ЕФРР), конкурентные исследования награды от M. F. G. Fuortes Мемориал стипендии, Стивен W. Kuffler стипендий Фонда, Лаура и Артур Колвин наделены летом исследовательских стипендий Фонда , Фишбах стипендий и большой фонд поколение морской биологической лаборатории и национальной Xenopus ресурсов RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) где часть этой работы была проведена. Мы также благодарим CERCA программы / Женералитата Каталонии для институциональной поддержки. А.л. является членом Серра Húnter.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

Ссылки

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

142Xenopus laevisXenopus tropicalis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены