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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les têtards de Xenopus offrent une plate-forme unique pour étudier la fonction du système nerveux in vivo. Nous décrivons des méthodologies pour évaluer le traitement de l’information olfactive vie Xenopus larves dans des conditions normales d’élevage ou après une blessure.

Résumé

Les têtards de Xenopus offrent une plate-forme unique pour étudier la fonction du système nerveux. Ils offrent plusieurs avantages expérimentales, telles que l’accessibilité à nombreuses approches d’imagerie, des techniques électrophysiologiques et tests comportements. Le système olfactif de Xenopus têtard est particulièrement bien adapté pour étudier la fonction des synapses établis au cours du développement normal ou réformés après une blessure. Nous décrivons ici les méthodologies permettant d’évaluer le traitement de l’information olfactive dans la vie des larves de Xenopus . Nous exposons une combinaison de mesures in vivo des réponses de calcium présynaptique dans les glomérules du bulbe olfactif avec des essais de comportement olfactif guidée. Méthodes est cumulable avec la transection des nerfs olfactifs pour étudier le recâblage de la connectivité synaptique. Des expériences sont présentées à l’aide d’animaux sauvage et génétiquement modifiés exprimant des reporters de la GFP dans les cellules du système nerveux central. Application des méthodes décrites aux têtards génétiquement modifiés peut être utile pour démêler les bases moléculaires qui définissent le comportement de vertébrés.

Introduction

Les têtards de Xenopus constituent un excellent modèle animal pour étudier la fonction normale du système nerveux. Transparence, un génome entièrement séquencé1,2et l’accessibilité aux techniques chirurgicales, électrophysiologiques et d’imagerie sont des propriétés uniques des larves de Xenopus qui permettent d’étudier les fonctions neuronales in vivo3 . Quelques-unes des multiples possibilités expérimentales de ce modèle animal sont illustrés par les études approfondies réalisées têtard les systèmes sensoriels et moteurs4,5,6. Un circuit neuronal particulièrement bien adapté pour étudier plusieurs aspects de l’information au niveau des synapses est le Xenopus têtard système olfactif7. Tout d’abord, sa connectivité synaptique est bien définie : neurones récepteurs olfactifs (Orn) projettent vers le bulbe olfactif et établir des contacts synaptiques avec les dendrites des cellules mitrales/tuffeté dans les glomérules pour générer des cartes de l’odeur. Deuxièmement, son Orn continuellement générés par neurogenèse tout au long de la vie pour maintenir le fonctionnement des voies olfactives8. Et troisièmement, parce que le système olfactif montre une grande capacité régénératrice, Xenopus têtards sont en mesure de reformer entièrement leur bulbe olfactif après ablation9.

Dans cet article, nous décrivons les approches qui combinent l’imagerie des glomérules olfactifs chez les têtards vivant avec des expériences comportementales pour étudier la fonctionnalité des voies olfactives. Les méthodes détaillées ici ont été utilisées pour étudier la récupération fonctionnelle de la connectivité glomérulaire dans le bulbe olfactif après transection de nerf olfactif10. Données obtenues chez les têtards de Xenopus sont représentatifs des vertébrés comme traitement olfactif est évolutive conservée.

Les méthodes décrites sont illustrés à l’aide de X. tropicalis , mais elles peuvent être facilement implémentées dans X. laevis. Malgré la grande taille des adultes X. laevis, les deux espèces sont remarquablement semblables au cours des étapes de têtard. Les principales différences résident au niveau génomique. X. laevis affiche les pauvre traçabilité génétique, principalement déterminée par son génome allotétraploïde et longue durée de génération (environ 1 an). En revanche, x. tropicalis est plus favorable à des modifications génétiques en raison de sa durée d’une génération plus courte (5 à 8 mois) et le génome diploïde. Les expériences représentatives sont illustrées pour animaux sauvage et trois différentes lignées transgéniques : Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) et tubb2:GFP (X. laevis).

On envisagera les méthodologies décrites dans les travaux en cours aux côtés de la génétique progresse dans le domaine de Xenopus . La simplicité et la simple mise en œuvre des techniques présentées qui les rend particulièrement utile pour l’évaluation mutants déjà décrit11, ainsi que des lignes de Xenopus générés par CRISPR-Cas9 technologie12. Nous décrivons également une intervention chirurgicale permettant de transect des nerfs olfactifs qui peuvent être implémentées dans un laboratoire ayant accès aux têtards de Xenopus . Les approches utilisées pour évaluer les réponses de calcium présynaptique et comportement olfactif guidée nécessitent des équipements spécifiques, quoique disponible à un coût modéré. Méthodes sont présentées sous une forme simple de promouvoir leur utilisation dans des groupes de recherche et marquera-t-il le début les bases de tests plus complexes en mettant en œuvre des améliorations, ou par l’association à d’autres techniques, c'est-à-dire aux approches de, histologiques ou génétiques.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale à l’Université de Barcelone.

Remarque : Les têtards de X. tropicalis et X. laevis sont élevés selon les méthodes standard13,14. Eau de têtard est préparé en ajoutant des sels commerciales (voir Table des matières) à eau obtenue par osmose inverse. Conductivité est réglée à ∼700 µS et ∼1, 400 µS pour les têtards X. tropicalis et X. laevis , respectivement. Les larves peuvent être obtenus par accouplement naturel ou par fécondation in vitro,14. Les embryons sont dejellied avec 2 % de que l-cystéine préparé en sonneries modifiée de 0,1 x Marc (ROR). 1 x ROR contient (en mM) : 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Les larves sont transférés après 2 – 3 jours (étape 25) aux réservoirs de 2 L d’eau de têtard. Quand les têtards atteignent étape 40 des critères Nieuwkoop-Faber (NF)15, ils sont placés dans des réservoirs de 5 litres et maintenues à une densité de 10 animaux/L. température est maintenue constante à 23 et 25 ° C et 18 à 20 ° C pour X. tropicalis et X. laevis les têtards, respectivement. Animaux trouvés à étapes 48 – 52 des critères NF sont utilisés pour des expériences.

1. transection des nerfs olfactifs

  1. Préparer une solution anesthésier de 0,02 % MS-222 dans 50 mL d’eau de têtard à température ambiante.
  2. Préparer un petit réservoir (1 à 2 L) avec têtard eau pour permettre la récupération des animaux après la chirurgie.
  3. Couper les morceaux rectangulaires de papier filtre qualitatif de cellulose (4 cm x 3 cm, voir Table des matières).
  4. Mouiller les 2 morceaux de papier filtre qualitative de cellulose en solution MS-222 0,02 % et placez-les dans le cadre de dissection.
  5. Choisir un têtard de la cuve et le plonger dans la solution anesthésier. L’animal s’arrête la natation dans les 2 à 4 min et ne réagit pas aux stimuli mécaniques appliquées au niveau de la queue à l’aide de la pince à épiler.
  6. Placez le têtard anesthésié sur le morceaux rectangulaires de papier filtre. La position de l’animal avec sa face dorsale vers le haut, donc les structures du cerveau peuvent être visualisées.
    1. À l’aide de ciseaux de vannas (voir Table des matières) coupe un ou des deux nerfs olfactifs (selon le type d’analyse à effectuer). Un seul nerf pour les expériences nécessitant un contrôle interne des lésions du nerf du transect.
    2. Pour des expériences comportementales, transect les deux nerfs afin de supprimer toutes les informations de substance odorante qui arrivent à l’ampoule olfactive. L’efficacité du sectionnement de nerfs olfactifs sont facilement observables dans le cadre de dissection ; Cependant, position de pigmentation ou un animal peut être des facteurs limitants.
      Remarque : (Facultatif) Le meilleur moyen pour certifier la validité de la procédure utilise les têtards transgéniques qui expriment les reporters fluorescents sur leur système nerveux (voir résultats représentatifs). Dans ce but, il est nécessaire d’utiliser une portée de dissection équipée de fluorescence (Figure 1). Si seulement les animaux sauvage sont disponibles, le traçage avec CM-diI peut être employée. Suivre le protocole 2 (voir ci-dessous) pour injecter une solution de 0,5 mg/mL de CM-diI préparé à 0,3 M de saccharose dans la capsule nasale. Voir 16 pour plus de détails sur la préparation et conservation des CM-diI. Fuite du colorant dans la cavité principale doit être minimiser. Dans ce but, il est nécessaire de modifier la pression d’injection et l’ouverture de micropipettes. Fluorescence au niveau de la couche glomérulaire du bulbe olfactif devient évidente 24h après l’application du CM-diI. Le présent ouvrage utilise le marquage avec CM-diI juste pour certifier la procédure transection ; Toutefois, cette méthode peut aussi servir pour obtenir des informations morphologiques des glomérules olfactifs à l’aide de méthodes histologiques conventionnelles.
  7. Transférer les animaux dans le réservoir de récupération. Les têtards devraient récupérer nage normale dans environ 10 min. effectuer une inspection minutieuse pour détecter la présence d’hémorragies, qui sont attendus dans environ 1 % des animaux soumise à la chirurgie.
  8. Euthanasier les animaux blessés dans une solution de MS-222 de 0,2 %.

2. marquage des neurones récepteurs olfactifs avec indicateurs fluorescents Calcium

  1. Préparer une solution contenant 12 % Calcium vert-1-dextran (voir Table des matières), 0,1 % Triton X-100 et 1 mM NaCl,17. Conserver la solution à-20 ° C ou à-80 ° C si c’est ne pas pour être utilisée pendant un mois.
  2. Préparer des pipettes de verre avec embout ouvertures ~ 1 à 2 µm (diamètre semblable à Microélectrodes utilisés pour des expériences de patch clamp) microinjection utilisant un micropipettes (voir Table des matières).
  3. Calibrer le volume des microinjections. À l’aide d’eau distillée, ajuster le temps de pression et d’injection afin d’obtenir des volumes d’injection de 0,15 à 0,3 µL.
    Remarque : Une méthode simple consiste à compter le nombre d’impulsions nécessaires pour vider une pipette remplie de 1 µL d’eau. Les paramètres typiques sont une pression de 30 lb/po2 et 50 ms temps d’injection.
  4. Placer une pipette dans le microinjector et le charger avec ~ 2 µL de solution de dextran vert-1 de calcium.
  5. Préparer un têtard suivant étapes 1.1 à 1.6.
  6. Déplacer l’extrémité de la pipette dans la cavité principale de la capsule nasale.
    Remarque : Voir la Figure 2A , qui décrit l’emplacement des voies olfactives dans un têtard de Xenopus.
  7. À l’aide de paramètres obtenus au point 2.3, fournir quelques bouffées. Restreindre la présence de colorant à la capsule nasale.
  8. Laissez le têtard reposer pendant 2 à 3 min. à l’aide d’une pipette Pasteur, verser des gouttes de solution MS-222 0,02 % sur les parties plus caudales de l’animal pour éviter le séchage.
  9. Transférer l’animal dans le réservoir de récupération.
    Remarque : Il devrait récupérer la natation normale dans environ 10 min. Manipulation des animaux pourrait causer des blessures.
  10. Euthanasier les têtards qui ne récupèrent pas le comportement de nage normale 15 min après l’injection à l’aide d’une solution de MS-222 de 0,2 %.
  11. Observer la fluorescence au niveau de la couche glomérulaire du bulbe olfactif le jour après l’injection.

3. préparation des têtards pour l’imagerie direct des réponses présynaptiques

  1. 24 à 48 h avant d’effectuer l’expérience, couche 4-6 boîtes de pétri de 35 mm de diamètre d’élastomère de silicone (p. ex., Sylgard). Une fois que l’élastomère a polymérisé, fabriquer un puits rectangulaire pour adapter le têtard.
    Remarque : Dimensions typiques pour les têtards X. tropicalis trouvés aux stades NF 48 – 52 sont 10 x 4 mm.
  2. Préparer 100 mL d’un 160 µM à solution d’acide aminé 1 mM agissant comme un stimulus odorants pour les têtards. La solution peut contenir un mélange de plusieurs acides aminés : méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine. Diluer les acides aminés dans une solution de Ringer Xenopus , composé de (en mM) : 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2glucose 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Veiller à ce que le pH est maintenu à 7,8.
  3. Remplir un réservoir en hauteur avec 20 mL de la solution d’acides aminés. Raccorder le réservoir avec du polyéthylène tube dans un tube capillaire de 28 G (voir Table des matières) placée au-dessus de la capsule nasale.
    Remarque : Le tube capillaire est monté sur un micromanipulateur (voir Table des matières). Bulles d’air doivent être absents du système de perfusion.
  4. Atteindre une précision temporelle dans l’application de la solution d’acides aminés en utilisant le transistor-transistor logic (TTL) contrôle pincée d’électrovannes (voir Table des matières). Un stimulateur est utilisé pour générer des impulsions TTL (voir Table des matières). Vérifier la précision temporelle pour offrir la solution de la substance odorante en changeant la durée des impulsions TTL, c’est à dire., s de 0,1 à 1.
  5. Remplir un autre réservoir surélevé avec 100 mL de solution de Ringer Xenopus .
  6. Anesthésier un têtard et placez-le dans le cadre de dissection (étapes 1.1 à 1.6).
  7. Préparer un têtard pour l’imagerie. Si têtards albinos sont disponibles, passez à l’étape 3.9, sinon Enlevez la peau au-dessus du bulbe olfactif car il contient des mélanocytes qui nuisent à l’imagerie (étape 3,8).
    Remarque : Il y a deux façons de réaliser l’expérience selon la pigmentation de l’animal. Il est préférable d’utiliser des animaux albinos. Les souches albinos sont disponibles pour X. laevis et albino X. tropicalis lignes ont récemment été générées par CRISPR-Cas9 12 ou TALENs18.
  8. À l’aide de ciseaux de vannas, faire une incision latérale sur la peau de têtards sur le bord du système nerveux central. Il faudrait faire la coupe au niveau du bulbe olfactif et de ne jamais atteindre la position de tectum, qui peut être facilement identifié par l’emplacement du nerf optique.
  9. Pincer la peau coupée à l’aide de la pince à épiler et tirez sur le système nerveux. Suppression réussie pour vérifier l’absence de mélanocytes au-dessus du bulbe olfactif. Garder l’animal humide par coulage de gouttes de solution de MS-222 de 0,02 % à l’aide d’une pipette Pasteur.
  10. Placez le têtard dans le puits du plat enduit (voir Table des matières). Mettre une lamelle de verre recouverte d’une graisse sous vide élevée au-dessus de l’animal. Position de la lamelle couvre-objet pour couvrir le haut du tectum jusqu’au bout de la queue.
  11. Veiller à ce que le bulbe olfactif et placodes restent exposés dans le milieu extracellulaire. Le têtard garder immobile pendant la formation image. Remplir la boîte de pétri avec tubocurarine de Xenopus Ringer solutioncontaining 100 µM (voir Table des matières) pour éviter les contractions musculaires.
    Remarque : La tubocurarine est stockée en aliquotes à-80 ° C n’est plus de 6 mois.
  12. Placer le plat tenant le têtard sous un microscope vertical. Raccorder le réservoir contenant une solution de Ringer Xenopus avec le plat à l’aide de tubes en polyéthylène (voir Table des matières) pour une perfusion continue de solution de Ringer Xenopus pour maintenir l’animal en vie pour > 1 h.
    Remarque : Mini pinces magnétiques (voir Table des matières) sont très utiles pour brancher stablement tuyau au plat. Tubes de perfusion et d’aspiration doivent être situés dans l’angle ~ 180°.
  13. Commencez perfusant de Xenopus Ringer. Maintenir le niveau de la solution dans la constante plat tout au long de l’expérience. Évaluer continuellement la viabilité de têtard en observant la circulation sanguine à travers les vaisseaux.

4. vivre d’imagerie présynaptique Ca2 + changements dans les glomérules olfactifs

Remarque : La procédure d’imagerie est décrite pour la microscopie à champ large, mais pourrait être facilement adaptée à un microscope confocal en ajustant les paramètres d’acquisition. Imagerie devrait être effectué dans un microscope vertical monté sur une table anti-vibration.

  1. Visualiser le têtard avec un objectif de faible grossissement, par exemple 5 x.
  2. Déplacer les axes micromanipulateur pour placer le tube capillaire fournir la solution de la substance odorante sur le dessus une capsule nasale formant un angle de 90 ° avec le nerf olfactif. L’écoulement de la substance odorante solution au-dessus du bulbe olfactif doit être évitée car elle peut provoquer des turbulences qui dénaturent l’imagerie.
  3. Trouver le bulbe olfactif situé homolatéralement à la capsule nasale (sous réserve d’une stimulation) en utilisant un grossissement élevé, longue distance de travail, objectif à immersion d’eau : 60Xx, 0,9 N.A.
  4. Vérifier l’émission de fluorescence par oeil. Glomérulaires structures devraient être évidentes (Figure 2B).
  5. Effectuer achat direct avec un appareil approprié pour imagerie calcique. Définir une boîte contenant le bulbe olfactif ensemble, généralement de 256 x 256 ou 512 x 512 pixels. Ensemble l’acquisition de taux de trame acquisition de 20 à 40 Hz. ajuster le gain, afin que les valeurs de la fluorescence basale sont environ 20 % de saturation. Acquérir une vidéo s 5.
  6. Visualiser le film. Vérifier le focus de l’image, l’absence d’artefacts de mouvement et de régions contenant des pixels saturés. Valeurs de fluorescence typique des régions glomérulaires devraient être de 5 000 – 20 000 a.u. si vous utilisez une caméra de 16 bits. Passez à l’étape suivante si conditions d’imagerie sont optimales. Répétez l’étape 4.6 si nécessaire pour améliorer la qualité de l’image ou ajuster les réglages de gain.
  7. Démarrer une time-lapse acquisition pour enregistrer les réponses induites par les stimuli olfactifs.
    Remarque : Champ d’application de la solution de la substance odorante est contrôlée par des stimuli TTL. Une expérience typique contient une période de référence de 4 s, suivie d’une stimulation fois allant de 0,1 à 0,5 s et une période de récupération de 6 à 10 s.
  8. Effectuer des stimulations répétitives d’Odorisants pour des intervalles de temps > 2 min. régler le débit à 1 – 1,5 mL·min-1. Étant donné que la perfusion globale est activé au cours de toutes les expériences, les acides aminés appliqués localement sont délavées.
    Remarque : Le volume de solution dans le plat est ~ 3 mL.
  9. Analyse d’images
    1. Détection des réponses
      1. Exporter les films vers ImageJ.
        Remarque : L’objectif détecte la présence de régions glomérulaires en réponse à des stimuli.
      2. Transformer la séquence brute d’images de fluorescence à un film de0 ΔF/F. Mesurer les variations relatives en fluorescence basale selon la relation suivante : (F-F,0) / f0, où F0 indique les niveaux de fluorescence de base.
      3. Dessiner des régions d’intérêt (ROI) autour des zones démontrant des augmentations putatif de fluorescence au cours de la stimulation et enregistrer leur position dans le gestionnaire de ROI (Figure 2E). Dessiner un retour sur investissement pour détecter des niveaux de fluorescence de fond dans une zone dépourvue de structures glomérulaires.
    2. Quantification des réponses.
      1. Placer la ROIs définie dans la séquence brute d’images de fluorescence. Obtenir la valeur de gris moyenne des ROIs sélectionnés pour chaque image. La séquence des valeurs obtenues pour un programme d’analyse de transfert (par exemple., Igor Pro).
      2. Soustrayez la fluorescence de fond et ensuite calculer les changements de0 ΔF/F pour chaque ROI (Figure 2F). Tracer les augmentations ΔF/F0 pour chacun d'entre la ROIs sélectionné. Calculer l’écart type de basale ΔF/F0 (avant la stimulation).
        Remarque : Une réponse positive est considéré comme si des augmentations ΔF/F0 obtient au cours de la stimulation sont plus grandes que 2 écarts-types des valeurs basales.

5. test de comportement olfactives guidées

Remarque : Un schéma de l’installation pour la réalisation de l’essai est illustré à la Figure 3.

  1. Faire des petits trous pour s’adapter à 1,57 mm diamètre extérieur x 1,14 mm diamètre intérieur tube dans la partie supérieure de chaque cupule d’une boîte de 6 puits. Insérer le tuyau et le sceller à l’aide d’une colle époxy (voir Table des matières).
    Remarque : Mis à jour le plat peut être réutilisé plusieurs fois après lavage complet avec de l’eau distillée.
  2. Préparer 50 mL d’une solution d’acides aminés contenant méthionine, leucine, histidine, arginine et lysine (voir l’étape 3.2 pour plus de détails). Les concentrations varient de 160 µM à 1 mM. Dans un réservoir en hauteur, placer 20 mL de la solution.
  3. Ne pas nourrir les têtards pendant au moins 12 h avant le dosage. Prélever 6 têtards dans leur réservoir de logements et les placer dans 2 L d’eau propre têtard pour minimiser l’exposition aux substances odorantes.
  4. Placer le plat de 6 puits modifiés sur un LED-transilluminateur blanc (Figure 3).
  5. Couple des entrées de perfusion au réservoir contenant la solution d’acides aminés à l’aide d’un collecteur (voir Table des matières). Vérifier le système de perfusion et d’éliminer les bulles d’air. Remplir les 6 puits simultanément. Régler la hauteur du réservoir afin de permettre l’acheminement de ≥ 5 mL de solution de substance odorante dans les ~ 30 s.
    Remarque : Laver chaque puits de 4 fois avec l’eau bidistillée après exposition à la solution de la substance odorante.
  6. Remplir chaque bien avec 10 mL d’eau de têtard. Placez 1 têtard/puits. Laisser reposer pendant > 3 min.
  7. Mettre en place l’acquisition d’images. Utiliser une caméra CCD classique qui peut acquérir des images au moins 5 Hz. connecter la caméra à un ordinateur. Ici, utilisez une caméra Zeiss MRC5 contrôlée par logiciel Zen mais autres configurations équivalentes peuvent être utilisées. S’il est nécessaire d’augmenter la cadence, appliquer pixel binning. Images devraient montrer le plat entier 6 puits.
  8. Démarrer une acquisition d’images tels que films contiennent basale (30 s), stimulus (25 – 35 s) et périodes de récupération (30 à 60 s).
  9. Retour animaux du plat 6 puits aux réservoirs après l’imagerie.
  10. Analyser des films en utilisant des plugins tels que wrMTrck19,20 qui fournissent plusieurs paramètres associés à la motilité de ImageJ.
  11. Pour préparer les images pour l’analyse, sélectionnez d’abord un puits en dessinant un ROI rectangulaire de 35 x 35 mm (Figure 4A). Obtenir une image d’arrière-plan en calculant la projection maximale de la séquence entière. Il doit afficher une image du puits sans le têtard.
  12. Soustraire la projection maximale du film brut. Effectuer le seuillage sur le film de 32 bits généré et appliquer le plugin wrMTrck. Ajuster les paramètres de WrMTrck pour suivre efficacement les mouvements d’animaux. Transfert obtenus des coordonnées X, Y dans un programme d’analyse.
  13. X-Y à l’aide de coordonnées, calculer la distance euclidienne à la source odorante (inlet de perfusion dans le puits), en appliquant l’équation suivante :
    figure-protocol-20106
    où os indique la position de la source de l’odeur, et le tad indique la position de têtard à un moment donné. Voir Figure 4A pour plus de détails.

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Résultats

Dans cet article, nous présentons une combinaison des deux approches complémentaires à effectuer en vivo étude des fonctionnalités du système olfactif Xenopus têtard : J’ai) une méthode d’imagerie présynaptique Ca2 + change dans les glomérules de la vie les têtards en utilisant un indicateur calcique fluorescent et ii) une odeur guidé analyse comportementale qui peut être utilisé pour étudier la réponse spécifique Odorisants d’origine h...

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Discussion

Cet article décrit les techniques qui sont utiles pour étudier la fonctionnalité des voies olfactives dans vie Xenopus têtards. Le protocole actuel est particulièrement utile pour les laboratoires qui travaillent ou ont accès aux Xenopus; Toutefois, il est également intéressant pour les chercheurs qui étudient les bases cellulaires et moléculaires de la réparation et la régénération neuronale. Résultats obtenus chez Xenopus est cumulable avec les données recueillies dans d’aut...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO ; SAF2015-63568-R) co-financé par le Fonds européen de développement régional (FEDER), de bourses de recherche concurrentielle de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, le Stephen W. fonds de bourses Kuffler, Laura et Arthur Colwin doué Summer Research Fellowship Fund , la bourse de Fischbach et le grand fonds de génération du laboratoire de Biologie Marine et la National Xenopus ressources RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts), où une partie de ce travail a été effectuée. Nous remercions également le programme CERCA / Generalitat de Catalunya d’appui institutionnel. A.L. est un camarade de Serra Húnter.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

Références

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

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