Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Resumo

Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso em vivo. Descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas em condições normais de criação ou após lesão.

Resumo

Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso. Eles oferecem várias vantagens experimentais, tais como a acessibilidade para inúmeras abordagens de imagem, técnicas eletrofisiológicas e ensaios comportamentais. O sistema olfativo do girino de Xenopus é particularmente adequado para investigar a função das sinapses estabelecido durante o desenvolvimento normal ou reformado após lesão. Aqui, descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas. Nós esboçamos uma combinação de medições in vivo de respostas de cálcio pré-sináptica em glomérulos do bulbo olfatório com ensaios de comportamento olfativo-interativa. Métodos podem ser combinados com a transecção dos nervos olfativos para estudar a religação de conectividade sináptica. Experimentos são apresentados usando animais selvagem-tipo e geneticamente modificados, expressando GFP aos jornalistas em células do sistema nervoso central. Aplicação das abordagens descritas para girinos geneticamente modificados pode ser útil para desvendar as bases moleculares que definem o comportamento de vertebrados.

Introdução

Xenopus girinos constituem um excelente modelo animal para estudar a função normal do sistema nervoso. Transparência, um genoma completamente sequenciado^1,2e acessibilidade às técnicas cirúrgicas, eletrofisiológicas e de imagem são propriedades exclusivas de Xenopus larvas que permitem investigar funções neuronais in vivo³ . Algumas das várias possibilidades experimentais deste modelo animal são ilustradas pelos estudos aprofundados realizados em girino sistemas sensorial e motor^4,5,6. Um circuito neuronal particularmente bem adaptado para estudar muitos aspectos do processamento no nível das sinapses de informações é o girino de Xenopus sistema olfativo⁷. Em primeiro lugar, sua conectividade sináptica é bem definida: neurônios olfactory do receptor (ORNs) projeto para o bulbo olfactório e estabelecer contatos sinápticos com dendritos de células mitral/adornou dentro glomérulos para gerar mapas de odor. Em segundo lugar, suas ORNs são continuamente gerados pelo neurogênese durante toda a vida para manter a funcionalidade dos caminhos olfativos⁸. E em terceiro lugar, porque o sistema olfativo mostra uma grande capacidade regenerativa, os girinos Xenopus são capazes de reformar inteiramente seu bulbo olfatório após ablação⁹.

Neste trabalho, descrevemos a abordagens que combinam imagens de glomérulos olfativos em girinos vivos com experimentos comportamentais para estudar a funcionalidade das vias olfativas. Os métodos detalhados aqui foram usados para estudar a recuperação funcional de conectividade glomerular no bulbo olfatório depois de transecção do nervo olfatório¹⁰. Dados obtidos em girinos Xenopus são representativos dos vertebrados desde processamento olfativo é evolutivo conservada.

Os métodos descritos são exemplificados usando X. tropicalis , mas eles podem ser facilmente implementados em X. laevis. Apesar do maior tamanho de adulto X. laevis, ambas as espécies são notavelmente semelhantes durante a fase de girino. As principais diferenças residem no nível do genoma. X. laevis exibe pobre rastreabilidade genética, determinada principalmente pelo seu genoma allotetraploid e tempo de geração longo (aproximadamente 1 ano). Em contraste, x. tropicalis é mais passível de modificações genéticas, devido ao seu menor tempo de geração (5-8 meses) e o genoma diploide. Os experimentos representativos são ilustrados por animais selvagem-tipo e três diferentes linhas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).

As metodologias descritas no trabalho atual devem ser consideradas juntamente com a genética avança no campo Xenopus . A simplicidade e a fácil implementação das técnicas apresentadas torna particularmente útil para avaliar mutantes já descrito¹¹, bem como linhas de Xenopus geradas pelo CRISPR-Cas9 tecnologia¹². Também descrevemos um procedimento cirúrgico utilizado para transecto nervos olfativos que podem ser implementados em qualquer laboratório tendo acesso para girinos de Xenopus . As abordagens utilizadas para avaliar as respostas de cálcio pré-sináptica e comportamento olfativo guiadas exigem equipamentos específicos, embora disponível a um custo moderado. Metodologias são apresentadas em uma forma simples de promover seu uso em grupos de pesquisa e poderiam definir as bases dos ensaios mais complexos implementando melhorias ou pela associação a outras técnicas, ou seja,, abordagens histológicas ou genéticas.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa animal na Universidade de Barcelona.

Nota: Girinos de X. tropicalis e X. laevis são criados de acordo com os métodos padrão^13,14. Água de girino é preparada pela adição de sais comerciais (ver Tabela de materiais) para água obtida por osmose reversa. Condutividade é ajustada para ∼700 µS e ∼1, 400 µS para girinos de X. tropicalis e X. laevis , respectivamente. As larvas podem ser obtidas através de acasalamento natural ou fertilização in vitro,¹⁴. Os embriões são dejellied com 2% de que l-cisteína preparado em 0.1 x Marc modificado Ringers (MMR). 1 x MMR contém (em mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 MgSO₄, 2 CaCl₂, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. As larvas são transferidas após 2 – 3 dias (fase 25) para tanques de 2 L com água de girino. Quando os girinos chegarem fase 40 dos critérios Nieuwkoop-Faber (NF)¹⁵, eles são colocados em tanques de 5 L e mantidos em uma densidade de 10 animais/L. temperatura é mantida constante a 23 – 25 ° C e 18 – 20 ° C para X. tropicalis e X. laevis girinos, respectivamente. Os animais encontrados em fases 48 – 52 dos critérios NF são utilizados para experimentos.

1. a transecção dos nervos olfativos

1. Preparar uma solução de anestésica de 0.02% MS-222 em 50 mL de água de girino à temperatura ambiente.
2. Prepare um pequeno tanque (1-2 L) com girino água para permitir a recuperação dos animais após a cirurgia.
3. Corte em pedaços retangulares de papel de filtro qualitativo da celulose (4 cm x 3 cm, consulte Tabela de materiais).
4. Molhar 2 pedaços de papel de filtro qualitativo celulose em 0,02% MS-222 solução e colocá-los no âmbito de dissecação.
5. Escolher um girino do tanque e mergulhá-lo na solução de anestésico. O animal para de nadar dentro de 2 – 4 min e não reage a estímulos mecânicos aplicados a nível de cauda usando uma pinça.
6. Coloque os pedaços retangulares de papel de filtro, o girino anestesiado. Posicione o animal com seu lado dorsal virado para cima, para que estruturas cerebrais podem ser visualizadas.
   1. Usando a tesoura vannas (ver Tabela de materiais), corte um ou ambos os nervos olfativos (dependendo do tipo de ensaio a ser realizado). Transecto de um único nervo para experimentos que exigem um controle interno de lesão do nervo.
   2. Para experimentos comportamentais, transecto ambos os nervos para suprimir todas as informações de odorante chegam ao bulbo olfactory. A eficiência do corte dos nervos olfativos pode ser facilmente observada sob o escopo de dissecação; no entanto, posição de pigmentação ou animal pode ser fatores limitantes.
      Nota: (Opcional) A melhor maneira de certificar a validade do procedimento é usar transgênicos girinos que expressam fluorescentes repórteres em seu sistema nervoso (ver resultados representativos). Para este objectivo, é necessário usar um escopo de dissecação equipado com fluorescência (Figura 1). Se apenas animais selvagem-tipo estão disponíveis, o rastreamento com CM-diI pode ser empregado. Segui o protocolo 2 (veja abaixo) para injetar uma solução de 0,5 mg/mL de CM-diI preparado em 0,3 M de sacarose na cápsula nasal. Ver ¹⁶ para obter detalhes sobre a preparação e armazenamento de CM-diI. Vazamento de tinta fora da cavidade principal deve ser minimizar. Para este objectivo, é necessário alterar a pressão de injeção e a abertura de micropipetas. Fluorescência no nível da camada glomerular do bulbo olfatório torna-se óbvio 24 h após aplicação do CM-diI. O presente trabalho utiliza a rotulagem com CM-diI só para certificar o procedimento de transecção; no entanto, esse método também pode ser usado para obter informações morfológicas dos glomérulos olfativos usando procedimentos histológicos convencionais.
7. Transferi os animais para o tanque de recuperação. Girinos devem recuperar natação normal dentro de ~ 10 min realizar uma inspeção cuidadosa para a presença de hemorragia, que são esperados em ~ 1% dos animais submetida a cirurgia.
8. Eutanásia em animais feridos em uma solução de MS-222 de 0,2%.

2. rotulagem de neurônios Olfactory do Receptor com indicadores de cálcio fluorescente

1. Preparar uma solução contendo 12% cálcio verde-1-dextrano (ver Tabela de materiais), 0,1% Triton X-100 e 1 mM de NaCl¹⁷. Armazene a solução a-20 ° C ou a-80 ° C, se não é para ser usado dentro de um mês.
2. Prepare-se para microinjection usando um extrator de micropipeta pipetas de vidro com ponta aberturas ~ 1-2 µm (diâmetro similar para microeletrodos usado para experiências de remendo-braçadeira) (ver Tabela de materiais).
3. Calibre o volume de microinjeções. Usando água destilada, ajustar o tempo de injeção e pressão para obter volumes de injeção de 0,15-0,3 µ l.
   Nota: Um procedimento simples consiste na contagem do número de pulsos necessários para esvaziar uma pipeta cheia de 1 µ l de água. Parâmetros típicos são uma pressão de 30 psi e 50 ms tempo de injeção.
4. Coloque uma pipeta no microinjector e carregá-lo com ~ 2 µ l da solução de dextran verde-1 de cálcio.
5. Prepare um girino seguindo passos 1.1 a 1.6.
6. Mova a ponta da pipeta na cavidade principal da cápsula nasal.
   Nota: Consulte a Figura 2A , descrevendo a localização das vias olfativas um girino Xenopus.
7. Usando configurações obtidas no ponto 2.3, entrega um par de sopros. Restringir a presença do corante da cápsula nasal.
8. Deixe o girino descansar por 2-3 min. com uma pipeta Pasteur, despeje gotas de solução de MS-222 0,02% nas partes mais caudais do animal para evitar a secagem.
9. Transferi o animal para o tanque de recuperação.
   Nota: Ele deve recuperar natação normal dentro de ~ 10 min. manipulação dos animais pode causar ferimentos.
10. Eutanásia em girinos que não recuperar natação normal comportamento 15 min após a injeção usando uma solução de MS-222 de 0,2%.
11. Observe a fluorescência no nível da camada glomerular do bulbo olfatório no dia após a injeção.

3. preparação dos girinos para geração de imagens ao vivo das respostas pré-sináptica

1. 24 – 48 h antes de realizar o experimento, casaco 4 – 6 caixas de Petri de 35 mm de diâmetro com elastómero de silicone (por exemplo, Sylgard). Uma vez que o elastômero tem polimerizado, fabrica um poço Retangular para caber o girino.
   Nota: Dimensões típicas para girinos de X. tropicalis encontrados em fases NF 48 – 52 são 10 x 4 mm.
2. Prepare 100 mL de um 160 µM a solução de ácido aminado 1mm agindo como um estímulo de odorante para girinos. A solução pode conter uma mistura de vários aminoácidos: metionina, leucina, histidina, arginina e lisina. Diluir os aminoácidos em solução de Ringer Xenopus , composta por (em mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 CaCl₂, 2 MgCl₂, glicose 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Certifique-se de que o pH é mantido em 7,8.
3. Encha um reservatório elevado com 20 mL da solução de ácido aminado. Conecte o reservatório com polietileno tubos para um tubo capilar de 28 G (ver Tabela de materiais) colocado acima da cápsula nasal.
   Nota: O tubo capilar é montado sobre um micromanipulador (ver Tabela de materiais). Bolhas de ar devem estar ausentes do sistema de perfusão.
4. Conseguir a precisão temporal em aplicar a solução de ácido aminado usando o transistor-transistor logic (TTL) controle das válvulas de solenoide pitada (ver Tabela de materiais). Um estimulador é usado para gerar pulsos TTL (ver Tabela de materiais). Verificar a precisão temporal para entregar a solução de odorante, alterando a duração de pulsos TTL, i.., 0,1 a 1 s.
5. Encha o reservatório elevado outra com 100 mL de solução de Ringer Xenopus .
6. Anestesiar um girino e colocá-lo no âmbito de dissecação (passos 1.1 a 1.6).
7. Prepare-se para a imagem latente um girino. Se os girinos albinos estão disponíveis avance para o passo 3.9, caso contrário, retire a pele acima do bulbo olfatório porque ele contém melanócitos que afectar a imagem (passo 3.8).
   Nota: Existem duas maneiras de realizar o experimento dependendo da pigmentação do animal. É preferível usar animais albinos. Cepas de Albino estão disponíveis para X. laevis e linhas de X. tropicalis albino recentemente foram geradas pelo CRISPR-Cas9 ¹² ou TALENs¹⁸.
8. Usando uma tesoura vannas, faça uma incisão lateral na pele girino na borda do sistema nervoso central. Faça o corte deve ser feita a nível do bulbo olfatório e nunca alcançando a posição de tectum, que pode ser facilmente identificada pela localização do nervo óptico.
9. Beliscar a pele corte usando uma pinça e puxe-o sobre o sistema nervoso. Verifique se a remoção bem sucedida pela ausência de melanócitos acima do bulbo olfatório. Manter o animal úmido, derramando gotas de solução de MS-222 de 0,02% com uma pipeta Pasteur.
10. Coloque o girino dentro do poço do prato revestido (ver Tabela de materiais). Coloca uma lamela de vidro revestida com graxa de vácuo elevada acima do animal. Posicione a lamela para cobrir a parte superior do tectum à extremidade da cauda.
11. Certifique-se de que o bulbo olfatório e placoides permanecem expostos ao meio extracelular. Manter o girino imóvel durante a imagem latente. Encher o prato de Petri com tubocurarina µM Xenopus Ringer solutioncontaining 100 (consulte Tabela de materiais) para evitar as contrações musculares.
    Nota: Tubocurarina é armazenada em alíquotas a-80 ° C não é mais do que 6 meses.
12. Coloque o prato segurando o girino sob um microscópio vertical. Conecte o reservatório contendo solução de Ringer Xenopus com o prato usando tubos de polietileno (ver Tabela de materiais) para perfusão contínua de solução de Ringer Xenopus para manter o animal vivo para > 1 h.
    Nota: Mini grampos magnéticos (ver Tabela de materiais) são muito úteis para estàvel Conecte o tubo ao prato. Tubos de sucção e perfusão devem estar localizados no ângulo ~ 180°.
13. Comece a perfusing solução de Ringer Xenopus . Manter o nível da solução em constante durante todo o experimento do prato. Continuamente avalie a viabilidade de girino, observando a circulação de sangue através dos vasos.

4. viver por imagem da pré-sináptica Ca^{2 +} alterações em glomérulos olfativos

Nota: O procedimento da imagem latente é descrito para a microscopia de campo amplo, mas pode ser facilmente adaptado a um microscópio confocal, ajustando as configurações de aquisição. Imagem latente deve efectuar-se em um microscópio vertical montado sobre uma mesa de antivibração.

1. Visualizar o girino com um objetivo de ampliação baixa, por exemplo, 5 x.
2. Mova os eixos micromanipulador para colocar o capilar, entregando a solução odorante no topo de uma cápsula nasal, formando um ângulo de 90 ° com o nervo olfativo. O fluxo da solução odorant acima do bulbo olfatório deve ser evitado porque pode causar turbulências que distorcem a imagem.
3. Encontrar o bulbo olfatório, localizado ipsilaterally da cápsula nasal (sujeito a estimulação) usando uma alta ampliação, distância de trabalho longa, objectivo de imersão de água: 60Xx, 0,9 N.A.
4. Verificar a emissão de fluorescência pelo olho. Estruturas glomerulares devem ser óbvio (Figura 2B).
5. Realize a aquisição ao vivo com uma câmera apropriada para a imagem latente de cálcio. Defina uma caixa contendo o bulbo olfativo inteiro, normalmente de 256 x 256 ou 512 x 512 pixels. Conjunto a aquisição de taxa de quadro de aquisição de 20 – 40 Hz. ajustar o ganho, para que os valores de fluorescência basal são ~ 20% de saturação. Adquira um vídeo s 5.
6. Visualize o filme. Verifica o foco da imagem, a ausência de artefatos de movimento e regiões que contêm pixels saturados. Valores de fluorescência típica das regiões glomerulares devem ser de 20.000 – 5.000 u.a., se usando uma câmera de 16 bits. Prossiga para a etapa seguinte se imagem as condições forem ideais. Repita a etapa 4.6 se necessário para melhorar a qualidade da imagem ou ajustar as configurações de ganho.
7. Começa uma aquisição de lapso de tempo para gravar respostas evocadas por estímulos olfactory.
   Nota: Aplicação precisa da solução odorant é controlada por estímulos TTL. Um experimento típico contém um período inicial de 4 s, seguido de estimulação vezes variando de 0,1 a 0,5 s e um período de recuperação de 6 a 10 s.
8. Realizar estimulações repetitivas de odorantes para intervalos de tempo > 2 min. definir a taxa de fluxo de 1-1.5 mL·min^-1. Desde que a perfusão global está no durante todos os experimentos, localmente aplicados aminoácidos são lavados para fora.
   Nota: O volume de solução no prato é ~ 3 mL.
9. Análise de imagem
   1. Deteção de respostas
      1. Exporte filmes para ImageJ.
         Nota: O objetivo é detectar a presença de regiões glomerulares, respondendo a estímulos.
      2. Transforme a sequência primas de imagens de fluorescência para um filme de₀ ΔF/F. Medir as mudanças relativas na fluorescência basal de acordo com a seguinte relação: (F-F₀) f₀, onde F₀ indica basais de fluorescência.
      3. Desenhar as regiões de interesse (ROI) em torno das áreas apresentando fluorescência putativo aumenta durante a estimulação e gravar a sua posição no Gerenciador de ROI(Figura 2). Desenhe um ROI para detectar níveis de fluorescência de fundo em uma área desprovida de estruturas glomerulares.
   2. Quantificação das respostas.
      1. Coloque o ROIs definido na sequência cru de imagens de fluorescência. Obter o valor de cinza médio de ROIs selecionados para cada quadro. A sequência dos valores obtidos para um programa de análise de transferência (por exemplo., Igor Pro).
      2. Subtrair a fluorescência de fundo e em seguida, calcular as mudanças de₀ ΔF/F para cada ROI (Figura 2F). Traça os aumentos em ΔF/F₀ para cada um do ROIs selecionado. Calcule o desvio padrão de ΔF basal/F₀ (antes de estimulação).
         Nota: Uma resposta positiva é considerada se aumenta em ΔF/F₀ obtidos durante estimulação são maiores do que 2 desvios-padrão dos valores basais.

5. ensaio de comportamento olfativo-guiado

Nota: Um diagrama esquemático da configuração para a realização do ensaio é mostrado na Figura 3.

1. Fazer pequenos furos para encaixar o tubo de 1,14 mm ID OD x 1,57 mm na parte superior de cada poço de um prato de 6-poços. Inserir o tubo e selar usando um adesivo epóxi (ver Tabela de materiais).
   Nota: O prato modificado possa ser reutilizado muitas vezes, após a lavagem exaustiva com água destilada.
2. Prepare-se 50 mL de uma solução de aminoácido metionina, leucina, histidina, arginina e lisina (consulte a etapa 3.2 para detalhes). As concentrações podem variar de 160 µM a 1 mM. Coloca 20 mL da solução em um reservatório elevado.
3. Não alimente os girinos pelo menos 12 h antes do ensaio. Pegue 6 girinos de seu tanque de habitação e colocá-los em 2 L de água limpa girino para minimizar a exposição a odores.
4. Coloque o prato de 6 poços modificados em um LED branco-transiluminador (Figura 3).
5. Casal das entradas de perfusão para o reservatório que contém a solução de ácido aminado usando um tubo colector (ver Tabela de materiais). Verificar o sistema de perfusão e eliminar as bolhas de ar. Preencha os 6 poços simultaneamente. Ajustar a altura do reservatório para permitir a entrega de ≥ 5 mL da solução de odorante dentro de ~ 30 s.
   Nota: Cada um bem 4 vezes com água bidestilada lave após a exposição à solução odorante.
6. Encha cada um com 10 mL de água de girino. Coloque 1 girino/bem. Deixe descansar por > 3 min.
7. Configure a aquisição de imagens. Use uma câmera CCD convencional que pode adquirir imagens em ≥ 5 Hz. conecta a câmera a um computador. Aqui, use uma câmera de Zeiss MRC5 controlada pelo software de Zen, mas outras configurações equivalentes podem ser usadas. Se for necessário aumentar a taxa de quadros, aplica pixel binning. Imagens devem mostrar o prato inteiro 6-poços.
8. Começar a aquisição de imagens que contêm filmes basal (30 s), estímulo (25 – 35 s) e períodos de recuperação (30-60 s).
9. Animais retorno do prato 6 poços para tanques após a imagem.
10. Analise filmes no ImageJ usando plugins como wrMTrck^19,20 que fornecem vários parâmetros associados à motilidade.
11. Para preparar imagens para análise, primeiro selecione um poço desenhando um ROI retangular de 35 x 35 mm(Figura 4). Obter uma imagem de fundo, calculando-se a projeção máxima de toda a sequência. Ele deve exibir uma imagem do bem sem o girino.
12. Subtrai a projeção máxima do filme cru. Executar limiarização no filme 32 bits gerado e aplicar o plugin wrMTrck. Ajuste os parâmetros de WrMTrck para confiantemente controlar movimentos de animais. Transferir o obtidas coordenadas X, Y em um programa de análise.
13. Coordenadas X-Y utilizando, calcular a distância euclidiana para a fonte de odorante (entrada de perfusão no poço), aplicando-se a seguinte equação:
    
    onde so indica a posição da fonte de odor e tad indica a posição de girino, em um determinado momento. Consulte a Figura 4para obter detalhes .

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Resultados

Neste trabalho, apresentamos uma combinação das duas abordagens complementares para executar na vivo estudo da funcionalidade do sistema olfativo Xenopus girino: eu) um método de imagem pré-sináptica Ca^{2 +} altera em glomérulos de viver girinos usando um indicador fluorescente de cálcio e ii) um odor guiada ensaio comportamental que pode ser usado para investigar a resposta ao específico odorantes transmitidas pela água. Desde que estas abordagens têm...

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Discussão

Este artigo descreve técnicas que são úteis para investigar a funcionalidade das vias olfativas vivos Xenopus girinos. O protocolo atual é particularmente útil para os laboratórios que trabalham, ou tem acesso a Xenopus; no entanto, também é interessante para aqueles pesquisadores estudando as bases celulares e moleculares de reparação e regeneração neuronal. Resultados obtidos em Xenopus podem ser combinados com dados coletados em outros vertebrados modelos para identificar mecanis...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)	Tecniplast	XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)	World Precision Instruments	501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)	World Precision Instruments	501778
Whatman qualitative filter paper	Fisher Scientific	WH3030917
X. laevis tubb2-GFP	National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731	NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP	European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI	ThermoFisher Scientific	C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic	ThermoFisher Scientific	C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection	Sutter Instrument	B100-75-10	O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller	Sutter Instrument	P-97
Microinjector	Parker Instruments	Picospritzer III
Sylgard-184	Sigma-Aldrich	761028-5EA
Microfil micropipettes	World Precision Instruments	MF28G-5
Upright microscope	Zeiss	AxioImager-A1
Master-8 stimulator	A.M.P.I.
CCD Camera	Hamamatsu	Image EM
Solenoid valves	Warner Instruments	VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR Scientific	636082B
Tubocurarine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T2379
CCD Camera	Zeiss	MRC-5 Camera	Controlled by Zen software
camera lens	Thorlabs	MVL8ML3	There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin	RS Components
Manifold	Warner Instruments	MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions	Narishige	MN-153
Mini magnetic clamps	Warner Instruments	MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0755	O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.