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Resumen

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.

Resumen

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso. Proporcionan múltiples ventajas experimentales, tales como accesibilidad a numerosos métodos de proyección de imagen, técnicas electrofisiológicas y ensayos de comportamiento. El sistema olfativo del renacuajo Xenopus es particularmente idóneo para investigar la función de sinapsis establecidas durante el desarrollo normal o reformado después de la lesión. Aquí, describimos las metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de las larvas de Xenopus . Esbozamos una combinación de medidas en vivo de las respuestas de calcio presinápticos en glomérulos del bulbo olfativo con ensayos de comportamiento olfativo guiado. Métodos pueden combinarse con la transección de nervios olfativos para el estudio de la configuración de la conectividad sináptica. Los experimentos se presentan animales de tipo salvaje y genéticamente modificados expresando reporteros GFP en células del sistema nervioso central. Aplicación de los enfoques descritos a los renacuajos genéticamente modificados puede ser útil para desentrañar las bases moleculares que definen comportamiento vertebrado.

Introducción

Los renacuajos de Xenopus constituyen un excelente modelo animal para estudiar la función normal del sistema nervioso. Transparencia, un genoma completamente secuenciado1,2y accesibilidad a las técnicas quirúrgicas, electrofisiológicos y de imagenológicos son propiedades únicas de las larvas de Xenopus que permiten investigar las funciones neuronales in vivo3 . Algunas de las múltiples posibilidades experimentales de este modelo animal son ilustrados por los estudios cuidadosos en renacuajo sistemas sensorial y motor4,5,6. Un circuito neuronal particularmente bien adaptado para el estudio de muchos aspectos de procesamiento a nivel de las sinapsis de información es el de sistema olfativo de renacuajo Xenopus 7. En primer lugar, su conectividad sináptica está bien definido: neuronas receptoras olfatorias (ORNs) proyecto para el bulbo olfatorio y establecen contactos sinápticos con las dendritas de células mitrales/tufted dentro de glomérulos para generar mapas de olor. En segundo lugar, sus ORNs continuamente se generan por la neurogénesis durante toda la vida para mantener la funcionalidad de vías olfatorias8. Y en tercer lugar, porque el sistema olfativo muestra una gran capacidad regenerativa, los renacuajos de Xenopus son capaces de reformar completamente su bulbo olfatorio después de ablación9.

En este papel, describimos los enfoques que combinan la proyección de imagen de glomérulos olfativos en los renacuajos vivos con experimentos conductuales para el estudio de la funcionalidad de las vías olfatorias. Los métodos detallados aquí fueron usados para el estudio de la recuperación funcional de conectividad glomerular del bulbo olfatorio de transección del nervio olfatorio10. Datos obtenidos en los renacuajos de Xenopus son representativas de vertebrados desde procesamiento olfativo es evolutivo conservado.

Los métodos descritos se ejemplifican mediante X. tropicalis pero puede implementarse fácilmente en X. laevis. A pesar del tamaño más grande de adultos X. laevis, ambas especies son notablemente similares durante etapas de renacuajo. Las principales diferencias residen en el nivel genomic. X. laevis muestra pobre maleabilidad genética, determinada sobre todo por su genoma tetraploide y tiempo de generación largo (aproximadamente 1 año). En cambio, x. tropicalis es más susceptible a modificaciones genéticas debido a su corto tiempo de generación (5 – 8 meses) y el genoma diploide. Los experimentos representativos se ilustran para animales de tipo silvestre y tres líneas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) y tubb2:GFP (X. laevis).

Las metodologías descritas en el presente trabajo deben considerarse junto con los avances genéticos en el campo de Xenopus . La simplicidad y fácil aplicación de las técnicas presentadas los hace particularmente útiles para evaluar ya descrito mutantes11, así como líneas de Xenopus generadas por CRISPR Cas9 tecnología12. También describimos un procedimiento quirúrgico que se utiliza para nervios olfativos que puede implementarse en cualquier laboratorio de tener acceso a los renacuajos de Xenopus de transectos. Los enfoques utilizan para evaluar las respuestas de calcio presinápticos y comportamiento olfativo guiadas requieren equipamiento específico, aunque en un coste moderado. Metodologías se presentan en una forma simple para promover su uso en grupos de investigación y podrían sentar las bases de análisis más complejos mediante la implementación de mejoras o de la asociación a otras técnicas, es decir,, histológicos o genéticos enfoques.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética de investigación animal de la Universidad de Barcelona.

Nota: Los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis son criados según los métodos estándar13,14. Agua de renacuajo es preparado agregando sales comerciales (véase Tabla de materiales) al agua obtenida por ósmosis inversa. Conductividad se ajusta a ∼700 μs y ∼1, 400 μs para los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis , respectivamente. Las larvas pueden obtenerse ya sea por monta natural o fecundación in vitro14. Embriones son dejellied con el 2% de que l-cisteína preparada en de 0.1 x Marc modificado timbres (MMR). 1 x MMR contiene (en mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, EDTA 0,1, pH 7,8. Las larvas son transferidas después de 2-3 días (etapa 25) a los tanques de 2 L con agua de renacuajo. Cuando los renacuajos alcanzan la etapa 40 de los criterios de Nieuwkoop-Faber (NF)15, se colocan en tanques de 5 L y mantienen a una densidad de 10 animales/L. temperatura se mantiene constante en 23 – 25 ° C y 18-20 ° C para X. tropicalis y X. laevis renacuajos, respectivamente. Animales que se encuentran en etapas 48 – 52 de los criterios de NF se utilizan para los experimentos.

1. transección de nervios olfativos

  1. Preparar una solución de anestesia de 0.02% MS-222 en 50 mL de agua de renacuajo a temperatura ambiente.
  2. Preparar un pequeño tanque (1 – 2 L) con renacuajo agua para permitir la recuperación de los animales después de la cirugía.
  3. Cortar piezas rectangulares de papel de filtro cualitativo celulosa (4 cm x 3 cm, véase Tabla de materiales).
  4. Mojar 2 pedazos de papel de filtro cualitativo celulosa en solución al 0,02% MS-222 y colocarlos bajo el alcance de la disección.
  5. Escoja un renacuajo del tanque y sumergirlo en la solución de anestesia. El animal deja de nadar dentro de 2 a 4 minutos y no reacciona a estímulos mecánicos aplicados en el plano de cola con unas pinzas.
  6. Coloque el renacuajo anestesiado en piezas rectangulares de papel de filtro. Posición del animal con su lado dorsal hacia arriba, por lo que se pueden visualizar las estructuras del cerebro.
    1. Usando tijeras de vannas (véase Tabla de materiales), corte uno o ambos nervios olfativos (dependiendo del tipo de análisis a realizar). Transecto de un solo nervio para experimentos que requieren de un control interno de la lesión del nervio.
    2. Experimentos conductuales, transecto ambos nervios para suprimir toda la información olfativa llega al bulbo olfatorio. La eficacia de seccionamiento del nervios olfativos se puede observar fácilmente en el ámbito de la disección; sin embargo, posición de pigmentación o animal puede ser factores limitantes.
      Nota: (Opcional) La mejor manera de certificar la validez del procedimiento es utilizando los renacuajos transgénicos que expresan reporteros fluorescentes en su sistema nervioso (véase resultados representativos). Para ello, es necesario utilizar un ámbito de disección equipado con fluorescencia (figura 1). Si sólo se dispone de animales de tipo silvestre, trazado con CM-diI puede ser empleada. Seguir protocolo 2 (véase abajo) para inyectar una solución de 0,5 mg/mL de CM-diI en sacarosa de 0,3 M en la cápsula nasal. Ver 16 para más detalles sobre la preparación y almacenamiento de CM-diI. Salida de contraste fuera de la cavidad principal se debe minimizar. Para ello, es necesario modificar la presión de inyección y la apertura de Micropipetas. Fluorescencia en el nivel de la capa glomerular del bulbo olfatorio se convierte en obvio 24 h después de la aplicación del CM-diI. El presente trabajo utiliza etiquetado con CM-diI para certificar el procedimiento de corte transversal; sin embargo, este método también puede utilizarse para obtener información morfológica de glomérulos olfativos utilizando procedimientos histológicos convencionales.
  7. Transferencia de animales para el tanque de recuperación. Los renacuajos deben recuperar natación normal dentro de ~ 10 minutos realizar una inspección cuidadosa de la presencia de hemorragias, que se espera en el ~ 1% de los animales sometida a cirugía.
  8. Eutanasia de animales heridos en una solución de 0,2% MS-222.

2. etiquetado de las neuronas receptoras olfatorias con indicadores fluorescentes calcio

  1. Preparar una solución que contiene 12% calcio verde-1-dextrano (véase Tabla de materiales), 0,1% Tritón X-100 y 1 mM de NaCl17. Almacenar la solución a-20 ° C o a-80 ° C si no debe ser utilizado dentro de un mes.
  2. Preparación de pipetas de vidrio con punta aberturas ~ 1-2 μm (diámetro similar a microelectrodos usados para los experimentos de patch-clamp) para microinyección utilizando un extractor de micropipeta (véase Tabla de materiales).
  3. Calibrar el volumen de microinyecciones. Utilizando agua destilada, ajustar el tiempo de inyección y presión para obtener volúmenes de inyección de 0.15 – 0.3 μl.
    Nota: Un procedimiento sencillo consiste en contar el número de pulsos necesaria para vaciar una pipeta llenada con 1 μl de agua. Parámetros típicos son una presión de 30 psi y 50 ms el tiempo de inyección.
  4. Colocar una pipeta en la microinyectora y carga con 2 μl de solución de dextrano 1 verde de calcio.
  5. Preparar un renacuajo siguiendo los pasos 1.1 al 1.6.
  6. Mueva la punta de la pipeta a la cavidad principal de la cápsula nasal.
    Nota: Vea la figura 2A describir la situación de las vías olfatorias en un renacuajo Xenopus.
  7. Parámetros obtienen en 2.3, entregar un par de bocanadas. Restringir la presencia de tinte a la cápsula nasal.
  8. Deje que el renacuajo descansar durante 2 – 3 minutos usando una pipeta Pasteur, verter gotas de solución de MS-222 de 0.02% en las partes más caudales del animal para evitar la sequedad.
  9. Traslado del animal al tanque de recuperación.
    Nota: Él debe recuperar natación normal dentro de ~ 10 minutos manipulación de animales puede causar lesiones.
  10. Eutanasia a los renacuajos que no se recuperan natación normal comportamiento 15 min después de la inyección con una solución de 0,2% MS-222.
  11. Observar la fluorescencia en el nivel de la capa glomerular del bulbo olfatorio en el día después de la inyección.

3. preparación de los renacuajos en proyección de imagen de respuestas presinápticas

  1. 24 – 48 h antes de realizar el experimento, capa de 4 a 6 placas de Petri de 35 mm de diámetro con elastómero de silicona (por ejemplo, Sylgard). Una vez que el elastómero se ha polimerizado, fabricar un pozo rectangular para caber el renacuajo.
    Nota: Dimensiones típicas para los renacuajos de X. tropicalis encontradas etapas de NF 48 – 52 son 10 x 4 mm.
  2. Preparar 100 mL de una 160 μm a la solución de aminoácido 1 mM actuando como estímulo odorante para los renacuajos. La solución puede contener una mezcla de varios aminoácidos: metionina, leucina, histidina, arginina y lisina. Diluir los aminoácidos en solución de Ringer de Xenopus , compuesta por (en mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, glucosa 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Asegurar que el pH se mantiene en 7.8.
  3. Llenar un depósito elevado con 20 mL de la solución de aminoácido. Conecte el depósito polietileno tubo a un tubo capilar de 28 G (véase Tabla de materiales) colocado por encima de la cápsula nasal.
    Nota: El tubo capilar está montado sobre un micromanipulador (véase Tabla de materiales). Burbujas de aire deben estar ausentes del sistema de perfusión.
  4. Alcanzar la precisión temporal en la aplicación de la solución de aminoácidos mediante el control de la lógica (TTL) de transistor-transistor de pizca de electroválvulas (véase Tabla de materiales). Se utiliza un estimulador para generar pulsos TTL (véase Tabla de materiales). Compruebe la precisión temporal para ofrecer una solución de odorante por cambiar la duración de pulsos TTL, es decir., s de 0,1 a 1.
  5. Llenar otro depósito elevado con 100 mL de solución de Ringer de Xenopus .
  6. Anestesiar un renacuajo y colóquelo en el ámbito de la disección (pasos 1.1 a 1.6).
  7. Preparar un renacuajo para la proyección de imagen. Si se dispone de los renacuajos albinos proceda al paso 3.9, lo contrario quitar la piel sobre el bulbo olfativo ya que contiene melanocitos que deterioran la proyección de imagen (paso 3.8).
    Nota: Hay dos maneras de realizar el experimento según la pigmentación del animal. Es preferible usar animales albinos. Cepas de Albino están disponibles para X. laevis y líneas de albino X. tropicalis recientemente se han generado por CRISPR Cas9 12 o TALENs18.
  8. Usando las tijeras de vannas, haga una incisión lateral en la piel de renacuajo en el borde del sistema nervioso central. Hacer el corte debe hacerse a nivel del bulbo olfativo y nunca llegar a la posición de tectum, que puede ser fácilmente identificado por la localización del nervio óptico.
  9. Pellizcar la piel corte con pinzas y colocárselo sobre el sistema nervioso. Verificar Retiro acertado por la ausencia de melanocitos sobre el bulbo olfatorio. Mantenga el animal húmedo vertiendo gotas de 0.02% MS-222 solución utilizando una pipeta Pasteur.
  10. Coloque el renacuajo en el pozo del plato cubierto (véase Tabla de materiales). Poner un cubreobjetos de vidrio recubierto con grasa para alto vacío sobre el animal. Coloque el cubreobjetos para cubrir la parte superior del tectum hasta el final de la cola.
  11. Asegurar que el bulbo olfatorio y placodes permanecen expuestas al medio extracelular. Mantenga el renacuajo inmóvil durante proyección de imagen. Llene la caja Petri con tubocurarina de Xenopus Ringer solutioncontaining 100 μm (véase Tabla de materiales) para evitar las contracciones musculares.
    Nota: Tubocurarina se almacena en alícuotas a-80 ° C no más de 6 meses.
  12. Coloque el plato con el renacuajo un microscopio vertical. Conecte el depósito que contiene solución de Ringer de Xenopus con el plato utilizando polietileno de la tubería (véase Tabla de materiales) para perfusión continua de solución de Ringer de Xenopus para mantener al animal vivo para > 1 h.
    Nota: Mini pinzas magnéticas (véase Tabla de materiales) son muy útiles para estable conectar la tubería al plato. Tubos de succión y de perfusión deben estar ubicados en el ángulo de ~ 180°.
  13. Inicio perfundiendo solución de Ringer de Xenopus . Mantener el nivel de la solución de la constante del plato durante todo el experimento. Evaluar viabilidad del renacuajo de manera continua mediante la observación de la circulación sanguínea a través de los vasos.

4. proyección de imagen de presinápticos Ca2 + cambios en los glomérulos olfativos en vivo

Nota: El procedimiento imagenológico se describe para microscopía de amplio campo, pero podría adaptarse fácilmente a un microscopio confocal mediante el ajuste de los parámetros de adquisición. Se realizará la proyección de imagen en un microscopio vertical montado en una mesa antivibración.

  1. Visualizar el renacuajo con un objetivo de bajo aumento, por ejemplo 5 x.
  2. Movimiento de los ejes de instrumental quirúrgico para colocar el capilar entregando la solución de olor en la parte superior una cápsula nasal forma un ángulo de 90 º con el nervio olfatorio. El flujo de solución de olor sobre el bulbo olfativo debe evitarse porque puede causar turbulencias que distorsionan la imagen.
  3. Encontrar el bulbo olfatorio situado ipsilaterally a la cápsula nasal (sujeta a estimulación) usando una alta magnificación, distancia de funcionamiento larga, objetivo de inmersión de agua: 60Xx, 0.9 N.A.
  4. Verificar la emisión de fluorescencia por el ojo. Estructuras glomerulares deberían ser obvio (figura 2B).
  5. Realizar adquisición vivo con una cámara adecuada para proyección de imagen de calcio. Definir un cuadro que contiene el bulbo olfatorio entero, normalmente de 256 x 256 o 512 x 512 píxeles. Conjunto la adquisición de tasa marco de adquisición de 20 a 40 Hz. Ajuste la ganancia, por lo que los valores de fluorescencia basal son ~ 20% de saturación. Adquirir un vídeo s 5.
  6. Visualizar la película. Comprobar el foco de la imagen, la ausencia de artefactos de movimiento y de las regiones que contienen píxeles saturados. Valores de fluorescencia típico de regiones glomerulares deben ser de 5.000 – 20.000 a.u. Si usando una cámara de 16 bits. Proceder al siguiente paso si de las condiciones son óptimas. Repita el paso 4.6 si es necesario para mejorar la calidad de la imagen o ajustar la configuración de ganancia.
  7. Comienza un lapso de tiempo adquisición para registrar respuestas evocadas por estímulos olfativos.
    Nota: Aplicación precisa de la solución de olor es controlada por los estímulos de la TTL. Un experimento típico contiene un punto de referencia de 4 s, seguido por el estímulo de las épocas que van desde 0.1 a 0.5 s y un periodo de recuperación de 6 – 10 s.
  8. Realizar estímulos repetitivos de Odorantes para intervalos de tiempo > 2 min fijar el caudal a 1 – 1,5 mL·min-1. Puesto que la perfusión global está encendido durante todos los experimentos, se lavar localmente aplicados aminoácidos.
    Nota: El volumen de solución en el plato es de ~ 3 mL.
  9. Análisis de imagen
    1. Detección de respuestas
      1. Exportar películas a ImageJ.
        Nota: El objetivo es detectar la presencia de regiones glomerulares en respuesta a estímulos.
      2. Transformar la materia prima secuencia de imágenes de fluorescencia para una película de0 ΔF/F. Medir los cambios relativos en la fluorescencia basal según la siguiente relación: (F-F0) / f0, donde F0 indica los niveles de fluorescencia basal.
      3. Dibujar las regiones de interés (ROI) alrededor de las áreas que muestra supuesta de la fluorescencia aumenta durante la estimulación y registrar su posición en el administrador de ROI (figura 2E). Dibujar un ROI para detectar niveles de fluorescencia de fondo en una zona carente de estructuras glomerulares.
    2. Cuantificación de las respuestas.
      1. Lugar las ROIs definidos en la secuencia cruda de imágenes de fluorescencia. Obtener el valor medio de gris de las ROIs para cada fotograma. La secuencia de los valores obtenidos para un programa de análisis de la transferencia (por ejemplo., Igor Pro).
      2. Reste la fluorescencia del fondo y luego calcular cambios de0 ΔF/F para cada ROI (figura 2F). Parcela los aumentos en ΔF/F0 para cada uno de los ROIs seleccionadas. Calcular la desviación estándar de basal ΔF/F0 (antes del estímulo).
        Nota: Se considera una respuesta positiva si aumenta en ΔF/F0 obtenidos durante estimulación son más grandes que 2 desviaciones estándar de los valores basales.

5. ensayo de comportamiento olfativa guiada por

Nota: En la figura 3se muestra un diagrama esquemático de la instalación para realizar el análisis.

  1. Hacer pequeños agujeros para tubos de 1,14 mm de D.I. de O.D. x 1,57 mm en la parte superior de cada pozo de la fuente 6-bien. Inserte la tubería y selle con un adhesivo epoxy (véase Tabla de materiales).
    Nota: El plato modificado puede ser reutilizado muchas veces después de lavado exhaustivo con agua destilada.
  2. Preparar 50 mL de una solución de aminoácidos que contiene metionina, leucina, histidina, arginina y lisina (ver paso 3.2 para más detalles). Las concentraciones pueden variar desde 160 μm a 1 mM. Colocar 20 mL de la solución en un depósito elevado.
  3. No se alimentan los renacuajos durante al menos 12 h antes del ensayo. Tomar 6 renacuajos desde el tanque de su vivienda y colocarlos en 2 L de agua de renacuajo limpia para minimizar la exposición a olores.
  4. Coloque el plato de 6 pozos modificado en un transiluminador de LED blanco (figura 3).
  5. Par las entradas de perfusión al depósito que contiene la solución de aminoácido con un múltiple (véase Tabla de materiales). Compruebe el sistema de perfusión y eliminar burbujas de aire. Llenar los 6 pozos simultáneamente. Ajustar la altura del embalse para permitir la entrega de ≥5 mL de solución de olor dentro de ~ 30 s.
    Nota: Lavar cada pozo 4 veces con agua destilada después de la exposición a la solución de olor.
  6. Rellenar cada una con 10 mL de agua de renacuajo. Lugar 1 renacuajo/bien. Dejar reposar > 3 minutos.
  7. Establecer la adquisición de la imagen. Utilizar una cámara de CCD convencional que puede adquirir imágenes en ≥5 Hz. Conecte la cámara a un ordenador. Aquí, utilice una cámara Zeiss MRC5, controlada por el software Zen pero pueden utilizarse otras configuraciones equivalentes. Si es necesario aumentar la velocidad de fotogramas, aplicar pixel binning. Imágenes deben mostrar el plato entero 6-bien.
  8. Iniciar la adquisición de la imagen que contienen películas basal (30 s), estímulo (25 – 35 s) y períodos de recuperación (30 a 60 s).
  9. Animales retorno del plato 6 pozos a los tanques después de la proyección de imagen.
  10. Analizar películas en ImageJ usando plugins como wrMTrck19,20 que proporcionar varios parámetros asociados a la movilidad.
  11. Para preparar imágenes para el análisis, primero seleccione un pozo dibujando un ROI rectangular de 35 x 35 mm (figura 4A). Obtener una imagen de fondo mediante el cálculo de la proyección máxima de toda la secuencia. Debe mostrar una imagen del bien sin el renacuajo.
  12. Restar la máxima proyección de la película cruda. Realizar el umbral en la película de 32-bit generada y aplicar el plugin de wrMTrck. Ajustar los parámetros de WrMTrck para seguir confiablemente los movimientos animales. Transferir los obtenidos X, Y coordenadas en un programa de análisis.
  13. X-Y utilizando coordenadas, calcular la distancia Euclídea a la fuente de olor (entrada de la perfusión en el pozo), aplicando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-19739
    donde os indica la posición de la fuente del olor y tad indica la posición de renacuajo en un momento dado. Ver figura 4A para más detalles.

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Resultados

En este trabajo presentamos una combinación de dos enfoques complementarios para realizar el estudio en vivo de la funcionalidad del sistema olfativo renacuajo Xenopus : i) un método para la proyección de imagen presináptica Ca2 + cambios en los glomérulos de la vida los renacuajos con un indicador fluorescente de calcio y ii) un olor guiado ensayo conductual que puede utilizarse para investigar la respuesta a olores específicos de transmitidas por el ag...

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Discusión

Este documento describe técnicas que son útiles para investigar la funcionalidad de las vías olfatorias en la vida de los renacuajos de Xenopus . El protocolo actual es particularmente útil para aquellos laboratorios que trabajan o tienen acceso a Xenopus; sin embargo, también es interesante para aquellos investigadores que estudian las bases celulares y moleculares de la regeneración neuronal y reparación. Resultados obtenidos en Xenopus pueden combinarse con datos recogidos en otros mo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanciado por Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con premios de investigación competitiva de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, del fondo de becas de Stephen W. Kuffler, Laura y Arturo Colwin verano investigación beca Fondo , la beca de Fischbach y el gran fondo de generación del laboratorio biológico marino y el nacional Xenopus recursos RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) donde se llevó a cabo una parte de este trabajo. También agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional. A.L. es Serra Húnter.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

Referencias

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