JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.

Özet

Xenopus kurbağa yavrularını sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Onlar çok sayıda görüntüleme yaklaşımlar, elektrofizyolojik teknikleri ve davranışsal deneyleri için erişilebilirlik gibi birden çok deneysel avantajlar sağlar. Xenopus iribaş koku alma sistemi normal gelişim sırasında kurulan veya yaralanma sonra reform sinapslarda işlevi araştırmak için özellikle uygundur. Burada, biz yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için yöntemleri tarif Xenopus larvaları. Biz bir arada glomeruli koku güdümlü davranış deneyleri ile olfaktör ampul presynaptic kalsiyum tepkilerin içinde vivo ölçümlerin anahat. Yöntemleri Olfaktör sinirler sinaptik bağlantı hızına uyumlanma çalışmaya transeksiyon ile kombine edilebilir. Deneyler vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar GFP gazetecilere merkezi sinir sistemi hücrelerdeki ifade kullanarak sunulmaktadır. Uygulama için genetik olarak değiştirilmiş kurbağa yavrularını açıklanan yaklaşımların omurgalı davranışı tanımlayın moleküler üsleri çözülüyor için yararlı olabilir.

Giriş

Xenopus kurbağa yavrularını sinir sisteminin normal işlevi eğitim için mükemmel bir hayvan model oluşturur. Şeffaflık, tam sıralı genom1,2ve cerrahi, elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri erişilebilirlik nöronal işlevleri içinde vivo3 soruşturma izin Xenopus larva benzersiz özelliklerdir . Bazı hayvan bu modelin çok deneysel olasılık iribaş duyusal ve motor sistemleri4,5,6tarihinde gerçekleştirilen kapsamlı çalışmalar tarafından gösterilmiştir. Bilgi sinapslarda düzeyinde işlem birçok yönlerini incelemek için özellikle uygun bir nöronal devre Xenopus iribaş koku alma sistemi7' dir. İlk olarak, onun sinaptik bağlantı iyi tanımlanmış: koku reseptör nöronlar (ORNs) proje olfaktör ampul ve dendrites glomeruli koku eşleme içindeki mitral/tufted hücreleri ile sinaptik temas kurmak. İkinci olarak, onun ORNs sürekli neurogenesis koku yolları8işlevselliğini korumak için hayatı boyunca tarafından oluşturulur. Ve üçüncü olarak, Xenopus kurbağa yavrularını koku alma sistemi büyük bir rejeneratif yetenek gösterir çünkü tamamen onların olfaktör ampul ablasyon9' dan sonra reform yapabiliyor musunuz.

Bu yazıda, koku glomeruli yaşayan kurbağa yavrularını görüntüleme koku yolları işlevselliğini çalışmaya Davranışsal deney ile birleştirmek yaklaşımları açıklar. Burada ayrıntılı yöntemleri glomerular bağlantısı'nda olfaktör ampul fonksiyonel iyileşme Olfaktör sinir transeksiyon10' dan sonra eğitim için kullanılmıştır. Xenopus iribaşlar alınan verileri çoğu temsilcisi omurgalıların koku işleme evrimsel olduğu için korunmuş.

X. tropicalis kullanarak açıklanan yöntemleri örneği ama Xiçinde kolayca uygulanabilirdi. laevis. Yetişkin X. laevisdaha büyük boyutlarına rağmen her iki tür iribaş aşamaları sırasında oldukça benzer. Ana farklar genomik düzeyinde bulunur. X. laevis çoğunlukla onun allotetraploid genom ve uzun oluşturma süresi (yaklaşık 1 yıl) tarafından belirlenen zavallı genetik tractability görüntüler. Buna ek olarak, tropicalis X. daha kısa oluşturma süresi (5-8 ay) ve diploit genom nedeniyle genetik değişiklikler için mükellef. Temsilcisi deneyler vahşi-türü hayvanlar ve üç farklı transgenik satır için gösterilmiştir: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) ve tubb2:GFP (X. laevis).

Geçerli çalışmalarında özetlenen metodolojileri Xenopus alanındaki genetik ilerledikçe birlikte düşünülmelidir. Sadelik ve sunulan teknikleri kolay uygulanması yapar onları zaten açıklanan mutantlar11, hem de CRISPR-Cas9 teknoloji12tarafından oluşturulan Xenopus satırları değerlendirmek için özellikle yararlı. Biz de Xenopus kurbağa yavrularını erişimi olan herhangi bir laboratuvar uygulanan Olfaktör sinirler transect için kullanılan bir cerrahi prosedür tanımlamak. Yaklaşımlar presynaptic kalsiyum yanıtları değerlendirmek için kullanılan ve koku güdümlü davranış gerektiren belirli donanımları, kullanılabilir olsa, ılımlı bir mal. Metodolojisi bunların kullanımı araştırma gruplarındaki tanıtmak için basit bir form içinde sunulan ve daha karmaşık deneyleri üsleri geliştirmeler uygulayarak ya da Derneğin diğer teknikleri, yani, histolojik veya genetik yaklaşımlar için ayarlayabilirsiniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yordamları hayvan Araştırma Etik Komitesi, Barselona Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Not: X. Tropicalis ve X. laevis kurbağa yavrularını standart yöntemleri13,14göre yetiştirilen. Kurbağa yavrusu su ticari tuzları ( Tablo malzemelerigörmek) ters ozmos tarafından elde edilen su ekleyerek hazırlanır. İletkenlik ∼700 µS ve ∼1, X. tropicalis ve X. laevis kurbağa yavrularını için 400 µS için sırasıyla ayarlanır. Larva doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon14tarafından elde edilebilir. Embriyo 0.1 x Marc'ın modifiye Ringers (MMR)'l-sistein hazırlanan % 2 ile dejellied. 1 x MMR içerir (mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7.8. Larva (sahne 25) 2-3 gün sonra 2 lt tank iribaş su ile aktarılır. Kurbağa yavrularını Nieuwkoop-Faber (NF) ölçüt1540 aşaması ulaştığınızda, onlar 5 L tanklarda yerleştirilir ve 10 bir yoğunluk muhafaza X. tropicalis ve X. laevis için hayvanlar/L. sıcaklık 23-25 ° C ve 18 – 20 ° C de sabit tutulur kurbağa yavrularını, anılan sıraya göre. NF ölçüt 48-52 aşamalarında bulunan hayvan deneyleri için kullanılır.

1. transeksiyon Olfaktör sinirler

  1. %0,02 anesthetizing bir çözüm hazırlamak MS-222 iribaş su oda sıcaklığında 50 ml.
  2. Küçük tankı (1-2 L) kurbağa ile su kurtarma hayvan ameliyattan sonra izin vermek için hazır olun.
  3. Selüloz nitel filtre kağıdı (4 cm x 3 cm, bakınız Tablo reçetesi) dikdörtgen parçalar koparıp.
  4. Selüloz nitel filtre kağıdı % 0,02 MS-222 çözüm içinde 2 adet ıslak ve parçalanmış kapsamına koyun.
  5. Bir kurbağa yavrusu tankından almak ve anesthetizing çözüm içine bırakın. Hayvan 2-4 dk içinde yüzme durdurur ve cımbız kullanarak kuyruk düzeyinde uygulanan mekanik uyaranlara tepki vermez.
  6. İmzalat iribaş üzerinde filtre kağıt dikdörtgen alin. Beyin yapıları görüntülenir şekilde hayvan onun dorsal yüzü yukarı, bakacak şekilde yerleştirin.
    1. Kenasen makas ( Tablo malzemelerigörmek) kullanılarak bir veya her iki Olfaktör sinirler (uygulanacak tahlil tipine) kesme. Sinir yaralanması iç denetim gerektiren deneyler için tek bir sinir transect.
    2. Davranışsal deney için her iki sinir olfaktör ampul için gelen tüm propil bilgileri bastırmak için transect. Olfaktör sinirler kesit verimliliğini diseksiyon kapsamına kolayca görülebilir; Ancak, pigmentasyon ya da hayvan pozisyonunda faktörler sınırlama.
      Not: (İsteğe bağlı) En iyi yolu yordamı geçerliliğini tasdik floresan gazetecilere sinir sistemlerinde hızlı transgenik kurbağa yavrularını kullanıyor (temsilcisi sonuçları görmek). Bu amaçla, floresan (Şekil 1) ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı kullanmak gereklidir. Vahşi-türü hayvanlar kullanılabilir yalnızca, izleme CM-dıı ile istihdam edilebilir. Protokolü 2 (aşağıya bakın) CM-dıı 0,3 M Sükroz burun kapsül içinde hazırlanan 0,5 mg/mL çözeltisi enjekte için izleyin. 16 ayrıntılı bilgi için bkz: hazırlık ve CM-dıı depolanmasını. Asıl kavite dışında boya kaçağı gerekir olmak en aza indirgemek. Bu amaç için enjeksiyon basıncı ve Mikropipetler açılışı değiştirmek gereklidir. Floresans olfaktör ampul glomerular katman düzeyinde açık 24 h CM-dıı uygulamadan sonra olur. Mevcut çalışma CM-dıı ile etiketleme sadece transeksiyon yordamı tasdik için kullanır; Ancak, bu yöntem aynı zamanda koku glomeruli geleneksel histolojik yordamları kullanarak morfolojik bilgilerini elde etmek için kullanılabilir.
  7. Hayvan kurtarma deposuna aktarın. Kurbağa yavrularını ~ 10 dk. bir dikkatli incelenmesi bulunup bulunmadığına hayvanların % ~ 1 bekleniyor kanama ameliyata tabi gerçekleştir içinde normal yüzme kurtarmanız gerekir.
  8. Bir % 0,2 MS-222 çözümde yaralı hayvanları ötenazi.

2. koku reseptör nöronların florasan kalsiyum göstergeler ile etiketleme

  1. % 12 içeren bir çözüm hazırlamak kalsiyum yeşil-1-dextran (bakınız Tablo malzemeler), % 0,1 Triton X-100 ve 1 mM NaCl17. Eğer bir ay içinde kullanılmak üzere çözüm-20 ° c veya-80 ° C'de depolayın.
  2. Cam pipetler ipucu açıklıklar ~ 1-2 µm (yama-kelepçe deneyler için kullanılan microelectrodes için benzer çapı) ile bir micropipette çektirmenin kullanılarak mikroenjeksiyon için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Microinjections hacmi kalibre. Distile su, kullanarak 0,15-0,3 enjeksiyon miktarda elde etmek için basınç ve enjeksiyon zamanı ayarlayın µL.
    Not: Basit bir prosedür su 1 µL ile dolu bir pipet boşaltmak için gerekli darbeleri sayılması oluşur. 30 psi ve 50 ms enjeksiyon zaman baskısı tipik parametreleridir.
  4. Bir pipet microinjector içinde yer ve kalsiyum yeşil-1 dextran çözüm ~ 2 µL ile yükleyin.
  5. Aşağıdaki adımları 1.1-1.6 bir kurbağa yavrusu hazırlayın.
  6. Pipet ucu burun kapsül asıl boşluğuna taşıyın.
    Not: Şekil 2bir Xenopus iribaş koku yollar konumunu açıklayanA bakın.
  7. 2.3 içinde elde ayarları kullanarak, birkaç ponponları teslim. Boya varlığı için burun kapsül kısıtlayın.
  8. 2-3 dk. için Pasteur pipet kullanarak tutun, % 0,02 MS-222 çözüm kurutma kaçınarak hayvan daha kaudal parçaları üzerinde damla dökün iribaş izin.
  9. Hayvan kurtarma deposuna aktarın.
    Not: Normal yüzme kurtarmanız gerekir ~ 10 dk. içinde hayvanlar manipülasyon yaralanmalara neden.
  10. Normal yüzme davranış 15 dk sonra enjeksiyon % 0,2 MS-222 çözüm kullanarak geri mi kurbağa yavrularını ötenazi.
  11. Gün'den sonra enjeksiyon olfaktör ampul glomerular katman düzeyinde floresans gözlemlemek.

3. Presynaptic tepkilerin canlı görüntüleme için kurbağa yavrularını hazırlanması

  1. 24-48 h deney önce 4-6 Petri yemekler 35 mm çapında silikon elastomer (örneğin, Sylgard) ile kat. Sonra elastomer polimerli, iribaş uyacak bir dikdörtgen de imal.
    Not: Tipik NF aşamalarında 48-52 bulundu X. tropicalis kurbağa yavrularını için 10 x 4 mm boyutlardır.
  2. 100 mL 160 µM 1 mM amino asit çözüm için kurbağa yavrularını bir propil uyarıcı olarak hareket için hazır ol. Çözüm birkaç amino asit karışımı içerebilir: metionin, lösin, histidin, arginin ve lizin. Xenopus zil'ın çözümünde, (mM) oluşan amino asit seyreltik: 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7.8. Bu pH 7.8 korunur emin olun.
  3. Yükseltilmiş bir rezervuar 20 mL amino asit çözeltisi ile doldurun. Havzanın polietilen ile bağlanmak için 28 G kılcal tüp boru burun kapsül yerleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Kılcal tüp bir micromanipulator monte edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Hava kabarcıkları yok olması gerekir perfüzyon sistemi.
  4. Solenoid çimdik valfleri ( Tablo malzemelerigörmek) transistör transistör mantık (TTL) kontrolünü kullanarak amino asit solüsyonu uygulanmasında zamansal hassas ulaşmak. Bir uyarıcı TTL bakliyat ( Tablo malzemelerigörmek) oluşturmak için kullanılır. TTL Bakliyat, süresi değiştirerek propil çözümleri sunmaya zamansal hassas kontrol i.e., 0.1-1 s.
  5. Başka bir yükseltilmiş rezervuar 100 mL Xenopus zil'ın çözeltisi ile doldurun.
  6. Bir kurbağa yavrusu anestezi ve parçalanmış kapsamına (adım 1.1-1.6) yerleştirin.
  7. Bir kurbağa yavrusu görüntüleme için hazır olun. Albino kurbağa yavrularını yoksa 3.9 adıma geçin, görüntüleme (adım 3.8) zarar melanosit içerdiğinden Aksi takdirde yukarıda olfaktör ampul deri kaldırmak.
    Not: Deney hayvanı pigmentasyon bağlı olarak gerçekleştirmek için iki yol vardır. Albino hayvanlar kullanmak tercih edilir. Albino suşları X. laevis için kullanılabilir ve albino X. tropicalis satırları CRISPR-Cas9 12 veya TALENs18tarafından oluşturulan.
  8. Kenasen makas kullanırken, merkezi sinir sistemi kenarındaki kurbağa yavrusu deri üzerinde yanal bir kesi yapmak. Marka kesme olfaktör ampul ve hiç tectum, optik sinir konum tarafından kolayca tanımlanabilir konumunu ulaşan düzeyinde yapılması gerekir.
  9. Kesilmiş deri Cımbız kullanarak çimdik ve sinir sistemi üzerinden çekin. Melanosit olfaktör ampul yukarıda yokluğunda tarafından başarılı kaldırma doğrulayın. Hayvan % 0,02 MS-222 çözüm Pasteur pipet kullanarak yağan damlaları rutubetli.
  10. İribaş boyalı çanak kuyunun içine yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Hayvan yukarıda yüksek vakum yağıyla kaplı bir cam coverslip koymak. Kuyruk sonuna tectum üst kapak coverslip getirin.
  11. Olfaktör ampul ve placodes hücre dışı ortama maruz kalmadığından emin olun. İribaş görüntüleme sırasında hareketsiz tutun. Petri kabına Xenopus zil'ın solutioncontaining 100 µM tubocurarine ile doldurun (kas kasılmaları önlemek için Malzemeler tablobkz:).
    Not: Tubocurarine aliquots-80 ° C'de artık 6 aydan depolanır.
  12. İribaş dik bir mikroskop altında tutan çanak yerleştirin. (Bkz. Tablo reçetesi) Polietilen boru Xenopus zil'ın çözüm sürekli perfüzyon için hayvan için canlı tutmak için kullanarak çanak ile Xenopus zil'ın solüsyon içeren rezervuar bağlanmak > 1 h.
    Not: (Bkz. Tablo reçetesi) mini manyetik kıskaçları stabil boru yemek için bağlanmak çok yararlıdır. Perfüzyon ve emici borular ~ 180 ° açı içinde yer almalıdır.
  13. Xenopus zil'ın çözüm ventriküler başlatın. Deneme boyunca yemek sabitindeki çözüm seviyesini korumak. Sürekli iribaş canlılığı kan dolaşımını damarlar yoluyla gözlemleyerek değerlendirin.

4. canlı koku Glomeruli Presynaptic Ca2 + değişiklikleri görüntüleme

Not: Görüntüleme yordam geniş alanlı Mikroskopi için açıklanan ancak kolayca confocal mikroskop için satın alma ayarlarını yaparak adapte. Görüntüleme bir anti-titreşim masaya monte bir dik mikroskobu içinde yapılmalıdır.

  1. Düşük büyütme objektif ile iribaş görselleştirmek örneğin 5 x.
  2. Olfaktör sinir ile 90 ° açı oluşturan bir burun kapsül üst propil çözüm teslim kılcal yerleştirmek için micromanipulator eksenleri hareket. Görüntüleme deforme turbulences neden olabilir çünkü propil çözüm olfaktör ampul yukarıda akışının kaçınılmalıdır.
  3. Olfaktör ampul ipsilaterally yüksek büyütme, uzun çalışma mesafesi, kullanarak burun kapsül (stimülasyon) tabi bulunan su daldırma amaç bulmak: 60Xx, 0,9 N.A.
  4. Floresans emisyon gözle kontrol edin. Glomerular yapıları açık (Şekil 2B) olmalıdır.
  5. Kalsiyum görüntüleme için uygun bir kamera ile canlı edinme gerçekleştirin. Genellikle, 256 x 256 veya 512 x 512 piksel tüm olfaktör ampul içeren bir kutu tanımlayın. Set edinme çerçeve oranı edinimi için 20-40 Hz. kazanç, böylece bazal floresan ~ %20 doygunluk değerleri ayarlayın. 5 s video elde etmek.
  6. Film görselleştirin. Görüntü odağı, devamsızlık hareketi eser ve doymuş pikselleri içeren bölgeleri denetleyin. Tipik floresans değerleri glomerular bölgelerin bir 16-bit kamera ile 5.000-20.000 yapıyordum olmalıdır. Görüntüleme koşulları en iyi durumda, sonraki adıma geçin. 4.6 Eğer görüntü kalitesini artırmak veya kazanç ayarlarını yapmak için gerekli adımları yineleyin.
  7. Koku uyaranlara tarafından uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için hızlandırılmış bir kazanım başlatın.
    Not: Kesin uygulama propil çözümün TTL uyaranlara tarafından kontrol edilir. Tipik bir deney 4 temel nokta işareti 0,1 0,5 arasında değişen kez stimülasyon ardından s, s ve iyileşme süresi 6-10 s.
  8. Odorants tekrarlayan elektrodlar zaman aralıkları için gerçekleştirmek > 2 dk. 1-1.5 mL·min-1için akış hızı ayarlayın. Küresel perfüzyon üzerinde tüm deneyler sırasında olduğu için yerel olarak uygulanan amino asitler yıkanır.
    Not: Çanak çözümde ~ 3 mL birimdir.
  9. Görüntü Analizi
    1. Yanıt-e doğru tespiti
      1. Filmler için ImageJ verme.
        Not: Amaç glomerular bölgeleri uyaranlara yanıt varlığı tespit.
      2. ΔF/F0 sinemaya floresans görüntülerin ham sıra dönüşümü. Aşağıdaki ilişki göre bazal floresans göreli değişiklikleri ölçmek: (F-F0) / f0burada F0 gösterir temel floresans düzeyleri,.
      3. Faiz (ROI) bölgelerinde sözde floresans artar stimülasyon sırasında gösterilen alanların etrafında çizmek ve yatırım getirisi müdür (Şekil 2E) içindeki konumlarını kaydedin. Arka plan floresans düzeylerine glomerular yapıları yoksun bir alanda algılamak için bir yatırım getirisi çizin.
    2. Yanıt-e doğru miktar.
      1. Tanımlanmış ROIs floresans görüntülerin ham sırayla yerleştirin. Her çerçeve için seçili ROIs ortalama gri değeri elde edilir. Bir analiz programı için elde edilen değerler dizisi transfer (e.g., Igor Pro).
      2. Arka plan floresans çıkarmak ve sonra her ROI (Şekil 2F) ΔF/F0 değişiklikleri hesaplamak. ΔF/F0 artışlar seçili ROIs her biri için arsa. Bazal ΔF/F0 (stimülasyon önce) standart sapmasını hesaplar.
        Not: Olumlu bir yanıt ΔF/F0 artışlar sırasında aldıysanız stimülasyon bazal değerlerden 2 standart sapma daha büyük olarak kabul edilir.

5. koku güdümlü davranış tahlil

Not: Tahlil gerçekleştirmek için Kur bir Şematik diyagramı Şekil 3' te gösterilmiştir.

  1. 1.57 mm O.D. x 1.14 mm kimlik boru üst kısmında, her şey bir 6-şey tabak sığacak şekilde küçük delikler yapmak. Tüp takın ve bir epoksi yapıştırıcı kullanarak mühür ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Değiştirilmiş çanak birçok kez distile su ile kapsamlı yıkama sonra yeniden olabilir.
  2. 50 mL metiyonin, lösin, histidin, arginin ve lizin (bkz. Adım 3.2 Ayrıntılar için) içeren bir amino asit çözeltisi hazırlamak. Konsantrasyonları 160 µM için 1 mM arasında olabilir. Yükseltilmiş bir rezervuar çözümde yer 20 mL.
  3. En az 12 h önce tahlil için kurbağa yavrularını beslemeyin. Onların konut tanktan 6 kurbağa yavrularını alıp odorants maruz en aza indirmek için 2 L temiz iribaş su içinde yerleştirebilirsiniz.
  4. Değiştirilmiş 6 kuyu tabak bir beyaz LED-transilluminator üzerinde (Şekil 3) yerleştirin.
  5. Perfüzyon alıcılar bir manifold kullanarak amino asit solüsyonu içeren rezervuar çift ( Tablo malzemelerigörmek). Perfüzyon sistemi kontrol edin ve hava kabarcıkları ortadan kaldırmak. 6 wells aynı anda doldurun. ~ 30 çözümünüzde propil ≥5 mL teslimini sağlamak için rezervuar yüksekliğini ayarlamak s.
    Not: Her çift kişilik distile su ile de 4 kez propil çözüm maruz kaldıktan sonra yıkayın.
  6. Her doldurmak 10 mL iribaş su ile iyi. Yer 1 iribaş/iyi. İçin dinlenmeye bırakın > 3 dak.
  7. Resim alma kadar ayarla. Vasıl ≥5 Hz. bağlamak bir bilgisayara kamera görüntüleri elde edebilirsiniz geleneksel bir CCD fotoğraf makinesi kullanın. Burada, Zen yazılım tarafından kontrollü bir Zeiss MRC5 kamera kullanmak ancak eşdeğer başka yapılandırmalarda kullanılabilir. Kare hızı artırmak gerekli ise, piksel binning geçerlidir. Resim 6 iyi çanak göstermelidir.
  8. Öyle ki filmler içeren resim alma bazal başlatmak (30 s), uyarıcı (25-35 s) ve kurtarma (30-60 s) dönemleri.
  9. 6 kuyu çanağı dönüş hayvanlardan tankları görüntüleme sonra için.
  10. Birden çok parametre hareketliliği için ilişkili sağlamak plugins wrMTrck19,20 gibi kullanarak ImageJ filmlerde analiz.
  11. Analiz için görüntüleri hazırlamak için önce 35 mm x 35 mm (Şekil 4A) dikdörtgen bir yatırım getirisi çizerek bir şey seçin. Arka plan resmi bütün sıra maksimum projeksiyon hesaplayarak edinin. İribaş olmadan iyi bir resim göstermek gerekir.
  12. Ham film maksimum projeksiyon çıkarma. Eşik oluşturulan 32-bit film üzerinde gerçekleştirmek ve wrMTrck eklenti uygulayın. Güvenilir bir şekilde hayvan hareketleri izlemek için WrMTrck parametrelerini ayarlamak. Elde edilen aktarım X, Y koordinatları bir analiz programına.
  13. Kullanarak X-Y koordinatları, aşağıdaki denklemi uygulayarak propil kaynağına (perfüzyon giriş iyi), Öklid uzaklığı hesaplamak:
    figure-protocol-17242
    Burada os koku kaynak konumunu gösterir ve tad iribaş konumu herhangi bir anda gösterir. Şekil 4A ayrıntılı bilgi için bkz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu yazıda, biz bir arada Xenopus iribaş koku alma sistemi işlevselliğini vivo içinde çalışma gerçekleştirmek için iki tamamlayıcı yaklaşımlar mevcut: Ben) presynaptic Ca2 + görüntüleme için bir yöntem değiştirir yaşam glomeruli içinde kurbağa yavrularını bir floresan kalsiyum göstergesi ve II kullanarak) bir koku belirli su bazlı odorants cevaben araştırmak için kullanılan davranış tahlil destekli. Bu yaklaşımlar koku işle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu kağıt yaşayan koku yolları işlevselliğini araştırmak yararlı teknikler açıklanır Xenopus iribaşlar. Geçerli protokol işe veya Xenopuserişimi Bu laboratuarlar için yararlıdır; Ancak, bu da nöronal rejenerasyon ve onarım hücresel ve moleküler üsleri eğitim Bu araştırmacılar için ilginçtir. Xenopus elde edilen sonuçlar diğer omurgalı modellerinde korunmuş mekanizmaları tanımlamak için toplanan veriler ile kombine edilebilir. Açıklanan yöntemleri genetiği...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser El "gayri resmi" de Economía y Competitividad (MINECO; dan gelen hibe tarafından desteklenmiştir SAF2015-63568-R) rekabetçi Araştırma Ödülleri M. G. F. Fuortes Memorial Bursu, Stephen W. Kuffler Burs Fonu, Laura ve Arthur Colwin donatılmış yaz araştırma bursu Fonu tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF tarafından), cofunded , Fischbach Bursu ve büyük üretimi Fonu Deniz Biyoloji Laboratuvarı ve ulusal Xenopus kaynak nerede bu eser bir kısmını gerçekleştirilmiştir RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA). Eğer bir Program ayrıca teşekkür ederim / Generalitat de Catalunya kurumsal destek için. Al Serra Húnter biri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

Referanslar

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 142kurba aXenopus laevisXenopus tropicaliskalsiyumsinapskoku resept r n ronpresynaptic terminal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır