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要約

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。

要約

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。多数のイメージング技術、電気生理学的手法、行動アッセイへのアクセシビリティなど、複数の実験的利点を提供します。アフリカツメガエル幼生の嗅覚系は特に正常な開発の間に確立されたまたは傷害の後改革シナプスの機能を調査するために適しています。ここでは、リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生。嗅覚に基づく行動アッセイと嗅球の糸球体におけるシナプス カルシウム反応の生体内測定の組み合わせの概要を説明します。メソッドは、シナプス接続の配線を検討する嗅神経の断裂と組み合わせることができます。中枢神経系細胞における GFP レポーターを表現する野生型および遺伝子組換え動物を用いる実験を紹介します。遺伝子組換えオタマジャクシに説明した方法の適用は、脊椎動物の動作を定義する分子基盤の解明に役立ちます。

概要

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の正常な機能を学習する優れた動物モデルを構成します。神経機能生体内で3 を調査できるようにアフリカツメガエル幼生のユニークな特性を透明性、完全に配列されたゲノム1,2, と外科、電気生理学とイメージング技術へのアクセス.この動物モデルの複数の実験的可能性のいくつかはオタマジャクシ感覚運動系4,5,6に対して徹底的な研究によって説明されます。情報レベル シナプスの処理の多くの側面を研究に特に適して神経回路は、アフリカツメガエルのオタマジャクシの嗅覚系7です。まず、そのシナプスの接続はよく定義された: 嗅覚受容ニューロン (ORNs) プロジェクトの嗅球へと臭気マップを生成する糸球体内の僧帽細胞の樹状突起とシナプスの接触を確立します。第二に、その ORNs は嗅覚経路8の機能を維持するために一生神経によって継続的に生成されます。第三に、アフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムは、素晴らしい再生能力を示すが完全切除9後の嗅球を改革することが.

本稿では嗅覚経路の機能を研究する行動実験と生活オタマジャクシで嗅糸球体の画像を結合する方法をについて説明します。ここで詳細な方法は、嗅神経断裂10後の嗅球糸球体接続機能回復の研究に使用されました。嗅覚情報処理の進化は脊椎動物の代表であるアフリカツメガエルのオタマジャクシで得られたデータ保存します。

X. tropicalisを使用して説明する方法を例示されるが、 Xで容易に実装することができます。発生学。大人のX. laevisの大きいサイズにもかかわらず両種は幼生の段階で著しく似ています。主な違いは、ゲノムのレベルで存在します。X. laevisには、allotetraploid のゲノム、長い生成時間 (約 1 年) によって大抵定められる貧しい人々 の遺伝的少ないが表示されます。対照的に、X の性はその短い世代時間 (5-8 ヶ月) と二倍体ゲノムのための遺伝の修正に向いています。代表的な実験は、野生型動物と 3 つの異なる形質転換線に図示されている: Hb9:GFP (X. tropicalis)、NBT:GFP (X. tropicalis)、tubb2:GFP (X. laevis)。

現在の作業に記載されている方法論は、アフリカツメガエルにおいて遺伝的進行と共に考慮されなければなりません。シンプルさと提示の技術の導入が容易になります CRISPR Cas9 技術12によって生成されたアフリカツメガエル行と同様に、既に説明した変異体11を評価する場合に役立ちます。アフリカツメガエル幼生へのアクセスを有するあらゆる研究室で実装できる嗅覚神経を縦断面に使用手術についても述べる。アプローチがシナプス前のカルシウム応答を評価するために使用し、嗅覚に基づく行動が特定の機器を必要とするとはいえ適度な費用でご利用いただけます。方法論研究グループでの使用を促進するために簡単な形式で掲載して、改善を実装することによって、または他の技術、すなわち,組織学的または遺伝学的アプローチへの関連付けによってより複雑なアッセイの拠点を設定することができます。

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プロトコル

すべてのプロシージャは、バルセロナ大学の動物研究倫理委員会で承認されました。

注:X. tropicalisとX. laevisのオタマジャクシは、標準的な方法13,14によると飼育されています。オタマジャクシの水は、逆浸透膜によって得られる水を市販食用塩 (材料の表を参照) を追加するによって準備されます。伝導率は、それぞれ ∼700 μ S、∼1、 X. tropicalisとX. laevisのオタマジャクシで 400 μ 秒に調整されます。幼虫は、自然交配または体外受精14によって取得できます。胚はゼリー 2 %l-システイン 0.1 x マーク変更の替え玉 (MMR) での準備を。1 x MMR が含まれています (mM): 2, 塩化ナトリウム 100 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES、0.1 の EDTA、pH 7.8。幼虫は、2-3 日第 25 期後オタマジャクシ水 2 L タンクに転送されます。5 L タンクに配置、10 の密度で維持オタマジャクシ Nieuwkoop フェイバー (NF) 基準15ステージ 40 に達すると、 X. tropicalisとX. laevisのために動物/l. 温度が 23 ~ 25 ° C、18-20 ° C で一定に保たれるオタマジャクシ、それぞれ。ステージ 48-52 NF 条件の動物は、実験に使用されます。

1. 嗅覚神経の断裂

  1. 0.02% の麻酔ソリューションを準備 MS-222 常温オタマジャクシ水 50 mL に。
  2. 手術後動物の回復を許可する水おたまじゃくしと小さなタンク (1-2 L) を準備します。
  3. セルロース定性ろ紙 (4 cm × 3 cm、参照テーブルの材料) の長方形の部分をカットします。
  4. セルロース 0.02 %222 MS ソリューションにおける定性ろ紙の 2 個セットをウェットし、切り裂くスコープの下に配置します。
  5. タンクからオタマジャクシをピックアップし、麻酔液に浸します。動物は 2-4 分以内でスイミングを停止し、ピンセットを使用してテール レベルで適用される機械的刺激に反応しません。
  6. フィルター紙の長方形の部分に麻酔のオタマジャクシを配置します。脳の構造を視覚化することができますので、上向き、その背側に動物を配置します。
    1. Vannas はさみ (材料の表を参照) を使用して (に応じて実施される試金の種類) の 1 つまたは両方の嗅神経をカットしました。神経損傷の内部統制を必要とする実験のための単一の神経を縦断面します。
    2. 行動実験のためには、嗅球に到着したすべての嗅覚情報を抑制するために両方の神経を縦断面します。切り裂くスコープ; 嗅神経の断面の効率で簡単に観察できただし、色素沈着または動物の位置の要因を制限があります。
      注:(省略可能)プロシージャの有効性を保証する最良の方法は彼らの神経系に蛍光レポーターを表現する遺伝子組換えオタマジャクシを使用している (代表的な結果を参照してください)。この目的に蛍光 (図 1)、郭清範囲を使用する必要は。野生の種類の動物が利用可能な場合にのみ CM diI でトレースを使用できます。CM diI 鼻カプセル 0.3 M ショ糖で準備の 0.5 mg/mL の溶液を注入するプロトコル 2 (下記参照) に従います。CM diI の作成、保管については、 16を参照してください。プリンシパルの空洞から染料の流出を最小限に抑える必要があります。この目的に射出圧力とマイクロ ピペットの開口部を変更する必要は。嗅球の糸球体層のレベルで蛍光 CM diI の適用後明白な 24 h になります。現在の仕事は CM diI とラベリングを使用して切除プロシージャを証明するだけでただし、このメソッドは、従来の組織学的プロシージャを使用して嗅糸球体の形態の情報を取得するも使用できます。
  7. 動物を回収タンクに転送します。オタマジャクシは、手術を受ける動物の ~ 1% で予想される出血の存在を注意してください検査実行 〜 10 分以内通常スイミングを回復するべき。
  8. 0.2 %222 MS ソリューションで負傷した動物を安楽死させます。

2. 蛍光カルシウム指示薬と嗅覚受容ニューロンの分類

  1. 12% を含む溶液を調製カルシウム グリーン 1 デキストラン (材料の表を参照)、0.1% トリトン X-100, と 1 mM NaCl17。それはヶ月以内に使用することは場合、-80 ° c または-20 ° C でソリューションを格納します。
  2. ガラス ピペット先端開口部 〜 1-2 μ m (パッチ ・ クランプ実験用電極によく似た直径) を備えるマイクロインジェクション ピペットの引き手を使用して (材料の表を参照してください)。
  3. 薬剤の量を調整します。0.15-0.3 の注入量を得るために圧力と注入時間を調整、蒸留水を使用して μ L。
    注:簡単な手順は、満ちている水 1 μ L ピペットを空にするために必要なパルス数をカウントで構成されます。代表的なパラメーターは、30 psi と 50 ms の噴射時間の圧力です。
  4. ガラスシリンジでピペットを置き、カルシウム グリーン 1 デキストラン溶液の 〜 2 μ L でそれをロードします。
  5. 手順 1.1 から 1.6 オタマジャクシを準備します。
  6. ピペットの先端を鼻腔カプセルの主腔に移動します。
    注:図 2Aアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の場所を記述するを参照してください。
  7. 2.3 で得られた設定を使用して、パフのカップルを提供します。鼻のカプセルに色素の存在を制限します。
  8. パスツール ピペットを使用して 2-3 分の残りの部分、乾燥を避けるために動物のより尾側の部分に 0.02% MS 222 溶液の滴を注ぐオタマジャクシをしましょう。
  9. 動物を回収タンクに転送します。
    注:それは通常スイミングを回復する必要があります 〜 10 分以内動物の操作は、損傷を引き起こす可能性があります。
  10. 0.2 %222 MS ソリューションを使用して注入後 15 分の通常の遊泳行動を回復しないオタマジャクシを安楽死させます。
  11. 投与後日の嗅球糸球体層のレベルで蛍光を観察します。

3. オタマジャクシのシナプス応答のライブ イメージングのための準備

  1. 実験を行う前に 24-48 h コート シリコーン ・ エラストマー (例えば、Sylgard) で直径 35 mm の 4-6 シャーレです。エラストマーが重合すると、一旦タドポールに合わせて長方形の井戸を作製します。
    注:NF ステージ 48-52、 X. tropicalis幼生の典型的な寸法が 10 mm × 4 mm です。
  2. オタマジャクシの嗅覚刺激として 1 mM アミノ酸溶液に 160 μ M の 100 mL を準備します。ソリューションは、いくつかのアミノ酸の混合物を含むことができます: メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン。アフリカツメガエルリンゲル液、mm で構成されるアミノ酸を希釈: 2, 塩化ナトリウム 100 KCl、1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 グルコース、10 HEPES、240 の mOsm/kg、pH 7.8。PH は 7.8 で維持されますを確認します。
  3. アミノ酸溶液 20 mL で昇格した貯水池を埋めます。ポリエチレン タンクを接続 28 G のキャピラリー チューブにチューブ (材料表参照) 鼻のカプセルの上に配置します。
    注:マイクロマニピュレーターのキャピラリー チューブをマウント (材料の表を参照してください)。空気の泡は欠席する必要があります血流システムから。
  4. ピンチ弁 (材料の表を参照してください) のトランジスタ-トランジスタ ロジック (TTL) コントロールを使用してアミノ酸ソリューションを適用することで時間的な精度を実現します。刺激物を使用して、TTL パルス (材料の表を参照) を生成します。TTL パルスの持続時間を変更することによって嗅覚ソリューションを提供する時間の精度をチェック、すなわち.、 0.1 を 1 s。
  5. もう一つ高架リザーバーをアフリカツメガエルリンガー液 100 mL で。
  6. オタマジャクシの麻酔し、切り裂くスコープ (1.1 から 1.6 のステップ) の下に置きます。
  7. イメージングのオタマジャクシを準備します。アルビノのオタマジャクシが利用できる場合は、3.9 の手順に進みます、イメージング (ステップ 3.8) を損なうメラノサイトが含まれているためそれ以外嗅球上のスキンを削除します。
    注:動物の色素沈着によって実験を実行する 2 つの方法があります。アルビノの動物を使用することをお勧めします。アルビノX. tropicalisラインは、最近 CRISPR Cas9 12または TALENs18によって生成されているし、 X. laevisのアルビノ系統があります。
  8. Vannas はさみを使用して、中枢神経系の端にオタマジャクシ皮膚に横切開を作る。嗅球と視神経の位置によって簡単に識別ことができます蓋の位置に届かないレベルで切口を作りをすべきであります。
  9. カットをピンセットを用いて皮膚をピンチし、神経系を引きます。嗅球上のメラノサイトの不在によって削除の成功を確認します。パスツール ピペットを使用して 0.02 %222 MS ソリューションの注ぐことの低下によって動物の潤いを保ちます。
  10. 塗の皿のウェルに、オタマジャクシを配置 (材料の表を参照してください)。動物の上高真空グリースをコーティングしたガラス基板を置きます。尾の先端に蓋の上部をカバーする coverslip を位置します。
  11. 嗅球と上板残る細胞外媒体に露出していることを確認します。イメージ投射の間に不動、オタマジャクシを保ちます。アフリカツメガエルリンゲル液 solutioncontaining 100 μ M ツボクラリンでペトリ皿を埋める (参照材料表) 筋収縮を防ぐために。
    注:ツボクラリンは、-80 ° c は、もはや 6 ヶ月以上因数に格納されます。
  12. 正立型顕微鏡下でおたまじゃくしを持って料理を配置します。生きている動物を維持するアフリカツメガエルリンゲル液の持続灌流のポリエチレン チューブ (材料の表を参照) を使用して料理アフリカツメガエルリンゲル液を含む貯水池を接続 > 1 h。
    注:ミニ磁気クランプ (材料の表を参照してください)、安定して皿にチューブを接続する非常に便利です。灌流・吸引チューブは、~ 180 ° の角度にある必要があります。
  13. アフリカツメガエルリンゲル液灌を開始します。実験を通して料理定数のソリューションのレベルを維持します。継続的に血管を血液の循環を観察することによって幼生の生存率を評価します。

4. ライブ嗅糸球体の神経終末の Ca2 +変化のイメージング

注:イメージの作成手順はワイド フィールド顕微鏡用が簡単に取得設定を調整することによって共焦点顕微鏡に適応することができる.イメージングは、正立型顕微鏡マウント防振テーブルの上で実施されなければなりません。

  1. 低倍率の目的でオタマジャクシを視覚化する 5 x など。
  2. 嗅神経と 90 ° の角度を形成鼻の 1 つのカプセルの上に匂いのソリューションを提供する毛細血管を配置するマニピュレーターの軸を移動します。匂い嗅球上のソリューションのフロー イメージングを歪める乱れが生じるために避けるべきであります。
  3. 高倍率、長作動距離 (刺激) を受ける鼻カプセルに同側にある嗅球水浸対物レンズを見つける: 0.9 60Xx エヌ ・ エイ
  4. 蛍光性の放出を目で確認します。糸球体の構造は明らかである (図 2B) をする必要があります。
  5. カルシウム イメージングに適したカメラでライブ集録を実行します。全体嗅球、通常 256 x 256 または 512 x 512 のピクセルを含むボックスを定義します。セット取得フレーム率獲得に 20-40 Hz. 基底蛍光の値は彩度の ~ 20%、ゲインを調整します。5 s ビデオを取得します。
  6. 映画を視覚化します。画像のフォーカス、アーチファクトと飽和ピクセルを含む領域がないことを確認します。16 ビットのカメラを使用している場合、糸球体領域の一般的な蛍光値は 5,000-20,000 a.u. のはずです。撮影条件が最適な場合は、次の手順に進みます。画像の品質を改善したり、ゲイン設定を調整する必要が場合は、4.6 のステップを繰り返します。
  7. 嗅覚刺激によって誘発される応答を記録するタイムラプス集録を開始します。
    注:匂いソリューションの正確なアプリケーションは、TTL の刺激によって制御されます。典型的な実験 4 のベースラインの期間が含まれている s、0.1 から 0.5 まで回刺激に続いて s と 6-10 s の回復期間。
  8. 時間間隔で匂いの反復的な刺激を実行 > 2 分が 1-1.5 mL·min-1に流量を設定します。グローバルの灌流はすべて実験中には、ローカルで適用されるアミノ酸が色あせています。
    注:皿の中の溶液の体積は 〜 3 mL です。
  9. 画像解析
    1. 応答の検出
      1. ImageJ にムービーをエクスポートします。
        注:目標は糸球体領域の刺激への応答の存在を検出します。
      2. ΔF/F0映画に蛍光画像の raw のシーケンスを変換します。次の関係によると基底の蛍光性の相対的な変化を測定: (F F0)/F0F0が蛍光のベースライン レベルを示します。
      3. 周辺刺激の間に推定される蛍光の増加を示す利益 (率 ROI) の領域の描画し、ROI マネージャー (図 2E) 内の位置を記録します。糸球体の構造に欠けている領域のバック グラウンド蛍光レベルを検出する投資収益率を描画します。
    2. 反応の定量化。
      1. 蛍光画像の raw のシーケンスに定義された Roi を配置します。各フレームの選択した Roi の平均グレー値を取得します。解析プログラムに得られた値のシーケンスを転送 (例えば.、イゴール プロ)。
      2. バック グラウンド蛍光を引くし、各投資収益率 (図 2 f) の ΔF/F0変更を計算します。選択・ ロワのそれぞれの ΔF/F0の増加をプロットします。(刺激) の前に基底の ΔF/F0の標準偏差を計算します。
        注:肯定的な反応は、ΔF/F0の増加中に得られた刺激が基底値の標準偏差は 2 よりも大きいと見なされます。

5. 嗅覚に基づく行動分析

注:分析を実行するためのセットアップの図は図 3に示します。

  1. 6 よく料理の各井戸の上部に 1.57 mm 外径 x 内径 1.14 mm チューブに合うように小さな穴を作る。チューブを挿入し、エポキシ樹脂接着剤を使用して密封する (材料の表を参照してください)。
    注:変更された料理再利用できる何回も蒸留水で徹底洗浄後。
  2. メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン (詳細については手順 3.2 参照) を含むアミノ酸溶液 50 mL を準備します。濃度の範囲は 160 μ M から 1 mM です。高架タンクに溶液 20 mL を配置します。
  3. アッセイの前に少なくとも 12 時間のオタマジャクシを与えないでください。彼らの住宅のタンクから 6 オタマジャクシを取るし、2 L きれいなオタマジャクシ水の匂いへの露出を最小限に抑えるために配置します。
  4. 白 LED transilluminator (図 3) に変更された 6 井戸皿を置きます。
  5. 灌流の入り江を含む多様体を用いたアミノ酸液貯留層にカップル (材料の表を参照してください)。灌流システムをチェックし、空気の気泡を除去します。同時に 6 の井戸を埋めます。≥5 〜 30 内臭気物質溶液の mL の配信を許可する貯留層の高さを調整する s。
    注:匂いソリューションへの暴露後 4 回も二重蒸留水でそれぞれを洗ってください。
  6. 塗りつぶしは各おたまじゃくし水 10 mL とよく。場所 1 オタマジャクシ/ウェル。残りの部分を残す > 3 分。
  7. 画像の取得を設定します。≥5 hz 接続コンピューターにカメラでの画像を取得することができます従来の CCD カメラを使用します。ここでは、禅のソフトウェアによって制御されるツァイス MRC5 カメラを使用して、他の同等の構成を使用できます。フレーム レートを増加する必要がある場合、は、ピクセルビニングを適用します。画像全 6 よく料理が表示されます。
  8. その映画を含む基底画像集録を開始 (30 s)、刺激 (25-35 秒) と回復 (30-60 s) 期間。
  9. イメージング後、動物を 6 井戸皿からタンクに戻ります。
  10. ImageJ 運動に関連付けられている複数のパラメーターを提供する wrMTrck19,20などのプラグインを使用しての映画を分析します。
  11. 分析用の画像の準備、まず 35 mm × 35 mm (図 4A) の長方形の投資収益率を描画することによって井戸を選択します。シーケンス全体の最大の投影を計算することにより、背景画像を取得します。タドポールせず井戸のイメージが表示されます。
  12. 生ムービーから最大投影を減算します。生成された 32 ビット映画に対して閾値処理を行い wrMTrck プラグインを適用します。動物の動きを確実に追跡する WrMTrck パラメーターを調整します。転送得られた解析プログラムに X、Y 座標します。
  13. 使用する X と Y 座標は、次の式を適用することによって嗅覚ソース (井戸の灌流入口) までのユークリッド距離を計算します。
    figure-protocol-9853
    os は、臭気発生源の位置を示す、少しは特定の時点でオタマジャクシの位置を示します。詳細は、図 4Aを参照してください。

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結果

本稿で提案する体内のアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムの機能の研究を実行する 2 つの相補的アプローチの組み合わせ: 私) 生活の糸球体におけるシナプス前 Ca2 +のイメージング手法を変更オタマジャクシ蛍光カルシウム インジケーター、および ii を使用して) 匂いは特定の水系匂いへの反応を調査するため行動のアッセイを導...

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ディスカッション

リビングで嗅覚経路の機能を調査するために役立つ手法について述べるアフリカツメガエルのオタマジャクシ。現在のプロトコルはアフリカツメガエル; へのアクセス、仕事、またはそれらの研究所にとって特に便利しかし、神経細胞の再生と修復の細胞および分子基盤を調査しているそれらの研究のための興味深いですも。アフリカツメガエルで得られた結果は、され?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、エル Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO; からの補助金によって支えられました。SAF2015-63568-R) M. G. F. Fuortes 記念フェローシップ、スティーブン ・ w ・ Kuffler 奨学基金、ローラ、アーサー Colwin 恵まれて夏研究奨学基金から競争的研究賞によって、欧州地域開発基金 (ERDF) を cofunded、フィッシュバッハ親睦と海洋生物学研究所の、国立アフリカツメガエル リソース RRID:SCR_013731 (森の穴、マサチューセッツ) この仕事の部分が行った偉大な世代ファンド。またセルサ プログラムに感謝/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ機関サポートのため。アダムローリーはセラ Húnter やつです。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015)World Precision Instruments501778
Whatman qualitative filter paperFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, AnionicThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicate capillaries for microinjectionSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
MicroinjectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettesWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Upright microscopeZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD CameraHamamatsuImage EM
Solenoid valvesWarner InstrumentsVC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD CameraZeissMRC-5 CameraControlled by Zen software
camera lensThorlabsMVL8ML3There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resinRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutionsNarishigeMN-153
Mini magnetic clampsWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethylene tubingWarner Instruments64-0755O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

参考文献

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