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摘要

提出了一种利用光学相干层析成像和光致动反应来评估啮齿类动物结构和视觉读数的详细方案。研究结果为眼科和神经学研究提供了有价值的见解。

摘要

光学相干断层扫描 (oct) 是一种快速、非侵入性的干涉技术, 可实现高分辨率视网膜成像。它是研究涉及视觉系统的神经退行性、神经保护和神经修复过程的理想工具, 因为这些过程往往与视网膜变化密切相关。作为一种功能读出, 视觉诱发代偿眼和头部运动通常用于涉及视觉功能的实验模型。结合这两种技术可以在体内定量调查结构和功能, 可用于调查病理条件或评估新疗法的潜力。所介绍的技术的一个巨大好处是可以进行纵向分析, 以便对动态过程进行调查, 减少可变性, 并减少实验所需的动物数量。该协议描述的目的是提供一个手册, 以获取和分析高品质的视网膜扫描小鼠和大鼠使用低成本定制持有人提供吸入麻醉的选项。此外, 拟议指南旨在作为研究人员在啮齿类动物中使用视感反应 (okr) 分析的指导手册, 该指南可根据其具体需要和兴趣加以调整。

引言

视觉通路作为中枢神经系统的一部分, 检查已被证明是一个有效的起点, 不仅可以解决眼科1、2、3、4、5, 但也神经学6,7,8,9, 10,11, 12, 13,14 ,15,16个问题。近年来, oct 和 okr 被确定为有用的分析, 非侵入性的工具, 以评估各种视网膜病变和视网膜表现在各种啮齿类动物模型17,18,19,20,21,22,23,24,25. oct 可在体内快速和高分辨率地对小鼠和大鼠的视网膜形态和结构进行可视化, 其结果与动物视网膜的组织学部分很好地吻合.okr 是定量评估视觉功能的一种快速、稳健的方法。

许多 oct 设备允许同时扫描不同波长的激光眼镜片 (cSLO) 成像, 从而提供有关视网膜病变的诊断信息, 即脂肪素沉积的可视化或视网膜的改变色素上皮 27.此外,在体内成像荧光标记细胞在转基因动物是可能的28,29,30,31,32。然而, oct 技术在啮齿类动物模型中的应用仍然具有挑战性, 主要原因是眼睛体积小。一些商业上可获得的设备需要调整, 通常需要不同大小的支架来成像不同物种的动物。此外, 动物需要麻醉来测量。

okr 设备可用于评估啮齿类动物的视觉功能。这些动物被放置在一个实际或虚拟圆筒中心的平台上, 显示一个移动的格栅, 动物用反身的头部和颈部运动来跟踪。在视觉功能减少或丧失的情况下, 这种视感反应被减少或消除。

该协议的目的是提供一个手册, 用于测量视网膜厚度使用商业上可用的 oct 装置与一个定制持有人提供吸入剂麻醉。该协议说明了如何使用制造商提供的软件分析卷扫描。对于视觉测试, 目的是提供如何使用商业上可用的系统来评估 okr 的指导。

研究方案

所有动物程序都是按照地区当局 (国家自然、环境和消费者保护局; 参考编号 84-02.04.2014.A059) 批准的实验准则进行的, 并符合视觉和眼科研究 (arvo) 关于在眼科和视力研究中使用动物的声明和关于保护用于科学目的的动物的欧洲指令 201/63/欧盟。

1. 共聚焦扫描激光眼科光学相干层析成像

请注意:cSLO-OCT 测量方案适用于所有实验室小鼠和大鼠菌株。

  1. 设置和成像前准备
    请注意:本协议中使用的 oct 设备的系统配置已在其他地方描述过31。
  2. 吸入剂麻醉的啮齿类动物制备
    1. 将啮齿类动物放置在感应室中, 并将蒸发器设置为 2 l/min o2时的异氟烷浓度为2%。
    2. 检查啮齿类动物是否通过捏尾巴麻醉, 将其从房间中取出, 用纸巾包裹, 以保持其温暖。
    3. 将啮齿类动物放置在习惯支架33上, 并将上颌门牙挂在口腔块的集成咬片上, 连接到蒸发器 (2 l/min o 2时为2.5% 的异氟醚)。
    4. 在每只眼睛上应用一滴苯乙胺 2.5%--------------------------------------------------------------------
    5. 1分钟后擦掉任何多余的眼药液, 用甲基纤维素为基础的眼用凝胶 (例如, 低血糖0.3% 眼药水) 润滑眼睛, 以避免角膜干燥和浊度。
    6. 手动或使用钳子将自定义隐形眼镜 (+ 4 屈光度) 放在鼠标上。用玻璃板 (例如直径12毫米圆形的玻璃盖板) 覆盖老鼠的眼睛, 不具有光学特性, 以确保平面。
      请注意:监测麻醉过程中的呼吸速率。如有需要, 增加或减少异氟醚浓度。
  3. 测量和分析
    请注意:确保按照 apostel 建议34执行和报告 oct 测量结果, 并根据 oscar-ib 共识标准 35执行质量控制。由于这些建议是为人类 oct 图像制定的, 因此有些标准并不适用或只是部分适用。
    1. 要对左眼进行成像, 请将支架放置在图 1a中, 以确保啮齿类动物的左眼球面向相机。
    2. 按控制面板显示屏右上角的"开始" 按钮启动采集模式。
    3. 将过滤杆设置为r , 并选择br + oct 进行控制面板上的蓝色反射眼底成像和 b 扫描采集。
    4. 使用相机背面的对焦旋钮将对焦距离设置为大约38张, 并放大视网膜, 直到在屏幕上看到 oct 扫描。
      请注意:在第一次测量时, 参考臂必须适应于啮齿类动物的测量。按组合 ctrl + alt + shift + o, 并调整打开窗口中参考臂的值, 直到 oct 扫描出现在屏幕上。
    5. 为了确保在所有平面上与视网膜具有正交角度的光束路径穿过瞳孔中部, 将视盘放置在照明场 (br) 的中间, 并通过旋转/旋转将水平和垂直线 b 扫描调整到水平水平(图 1 b) 或移动相机。
    6. 选择音量扫描模式, 并在软件屏幕上以50自动实时跟踪 (art, 从50个平均 a-scans 栅格化) 的高分辨率模式将其设置为 25次 b 扫描。
    7. 将音量扫描栅格的中间集中在光学光盘上, 然后按下控制面板上的黑色灵敏度旋钮, 然后启动采集。
    8. 将滤镜杆设置为a, 在控制面板上选择"蓝色自动花色(baf)", 并使用灵敏度旋钮调整图像亮度。按下灵敏度旋钮, 然后向图像荧光细胞 (如 egfp) 或自动荧光沉积物按水瓶座。
    9. 将眼胶涂在啮齿类动物的眼睛上, 以防止脱水, 并将动物放入一个单独的笼子中, 并提供热源。
    10. 监督啮齿类动物, 直到它从麻醉中完全恢复, 在一个单独的笼子和单独的住所。当动物流动时, 将其送回家庭笼子。
    11. 对于卷扫描的分析, 请使用 oct 设备软件的自动分割, 方法是右键单击扫描, 然后选择 "分割" , 然后选择"所有图层"。确保 oct 图像的质量是足够的, 并为每组实验定义质量截止,例如, & gt;20 分贝。
    12. 通过双击所需的扫描执行图层的手动校正, 选择 "厚度配置文件", 然后单击"编辑图层分割"。选择一层, 例如, 按内部限制膜的 ilm, 如有必要, 通过拖放将红点移动到正确的位置来纠正绿线。
      请注意:确保进行手动校正的调查员对实验组视而不见。
    13. 选择选项卡厚度图, 并选择1, 2, 3 毫米早期治疗糖尿病视网膜病变研究 (etdrs) 网格。将内圈居中显示在视盘上 (图 2, 左图)。
    14. 根据软件为不同的视网膜部门提供的厚度值计算视网膜层的厚度。要计算体积扫描的平均厚度值, 请使用整个 1, 2, 3 mm etdrs 网格, 该网格包含约25°的角度, 不包括包含视盘的内部1毫米圆圈 (图 2, 右)。
    15. 使用适当的软件进行统计分析。如果将动物的两只眼睛都包括在内, 请考虑一个统计模型, 该模型考虑主体之间的相关性 (例如,广义估计方程或混合线性模型), 因为一个主体的眼睛在统计上是相关的36.

2. 光动响应

请注意:下文提供了一份关于小鼠和大鼠 okr 测量的详细手册, 该手册可根据个人的具体需要加以调整。

  1. 设置和测量前准备
    1. 打开计算机。系统启动后, 打开测试室的屏幕, 如其他地方更详细的描述37。
    2. 选择一个合适的平台来测量小鼠或大鼠。
      请注意:平台大小是根据啮齿类动物的主体大小选择的。动物应该能够在没有行走能力的情况下正确地坐在平台上。
    3. 通过双击软件打开预设置窗口, 选择"新建组", 然后选择组名、主题数、物种和菌株。选择可变刺激: 在下拉菜单中选择时空频率、对比度灵敏度、速度或方向, 然后按"创建新组"。
    4. 通过操纵机房顶相机的焦环, 并通过对齐 (拖放) 平台上黑色圆圈周围的红色圆圈来校准系统, 从而将焦点聚焦在平台上。
  2. 测量和分析
    1. 将动物放置在平台上, 让它适应环境 ~ 5分钟, 如果掉落, 将动物抬回平台上 (图 3 a)。
    2. 选择软件屏幕右上角的"主题编号和条件" (图 3b)。一个刺激是可变的, 另一个刺激是恒定的。刺激旁边的"打开锁定"或"关闭锁定" 符号证实了这一点。
    3. 开始测量, 如果动物分别跟踪或不跟踪, 则分别为 "是" 或 "否" 选择 "是" 或 "否"。
      请注意:顺时针跟踪对应于左眼和逆时针跟踪到右眼。软件随机改变移动网格的方向。
    4. 手动选择刺激的步长, 方法是单击变量刺激旁边的向上和向下箭头, 如果刺激阈值收敛, 则让它自动适应软件。
    5. 为了获得最佳效果, 请通过单击软件屏幕上的黑色或白色框符号, 对动物进行动画处理, 例如, 通过高口哨的声音和空白。在长时间测量的情况下重复执行这些操作。
    6. 对于数据分析, 请选择 "摘要" 选项卡, 然后单击"文件" 导出表/图形以导出所需的数据集。
    7. 使用所需的软件执行统计分析 (另请参阅步骤 1.3.15)。

结果

应用第3代 oct 成像技术, 对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (mog) 肽诱导实验性自身免疫性脑髓炎 (eae) 小鼠模型进行了应用, 得到了小鼠视网膜的高分辨率形态学切片。利用这一技术, 证明了不同物质的保护能力。获得的视网膜内层 (irl) 的厚度值与视网膜整体组织学染色得到的视网膜神经节细胞 (rgc) 的数量吻合较好 (图 4)。

okr 监测提供了 oct 所看到的神经退行性变的功能读数。在这些实验中, okr 评估为空间频率的视觉功能与 oct 评估为 irl 变薄的神经轴突损伤具有密切的相关性17。可以使用各种协议来通过改变移动网格的空间或时间频率、对比度灵敏度、方向或速度来检查视觉敏锐性。在 eae 模型中, 与未经处理的 mog-eae 小鼠相比, 检测到经第1种物质处理的动物的空间频率提高了0.05 周期 (c/d) (图 5)。

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图 1: 用于 oct 测量的自定义支架.(a) 使用自定义支架33和 (b) 鼠眼周围的旋转轴对 c57bl/6j 鼠标进行 oct 成像。演示了横向平面 (左) 和轴向平面 (右) 的旋转。这一数字已从 dietrich 等人33修改.请点击这里查看此图的较大版本.

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图2:oct 采集后分析.25个 b 扫描卷协议上的 "1, 2, 3 毫米" etdrs 网格 (左)。软件为不同的视网膜区提供了视网膜层的厚度 (右)。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3: 小鼠的 okr 测量和刺激设置.(a) 通过摄像机在室内平台上分析 c57bl/6j 鼠标的顶部视图。(b) okr 软件的用户界面和设置。请点击这里查看此图的较大版本.

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图4:c57bl/6j 小鼠与 mog eae 相比, 在使用第1种物质治疗时, 显示出一种衰减的病程.(a) 在服用第1种物质的 eae 过程中, 视网膜内层的变性减少 (b), 临床 eae 评分减弱。每天对老鼠进行评分, 在120天的时间里, 每月进行 oct 测量。这些图表示每组至少10只动物的平均和标准误差。(*p < 0.05, * ** p < 0.001, 与 dunova 的事后测试相比, 曲线下的面积)。(c) irl 厚度变化与 rgc 损失 (* ** p < 0.001 相符, 由方差分析与 dunnett 的事后试验相比, 与 mog 未处理的小鼠相比)。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 5: mog-eae 对 C57BL/6J 小鼠的 okr 测量.(a) 与在120天的时间内通过空间频率阈值测试测量的未经处理的 mog eae 小鼠相比, okr 显示, 使用1物质治疗的动物的视力得到了提高。这些图表示每组至少6只动物的平均和标准误差 (* *p < 0.01, * ** p < 0.001, 方差分析与 dunnett 的事后测试比较, 曲线下的面积)。(b) 试验室内 c57bl/6j 鼠标的图像。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

该协议为啮齿类动物的厚度测量和视觉功能检查提供了指导。视觉读数越来越多地用于翻译研究18、26、38、39、40, 并且很容易转移到临床试验中。与动物实验中的组织学调查相比, oct 的显著优势是纵向分析是可能的, 可以对动态病理过程进行调查, 从而在很大程度上减少了变异性和数量。每项研究都需要动物。此外, oct 体内成像不受固定、切割或染色伪影的影响, 这可能会影响组织学调查中的层厚度。

然而, 激光束在所有平面上相对于视网膜的正交定向是确保厚度值的质量和重现性的关键步骤。它需要对调查员进行一些培训, 并且在获得 oct 扫描之前是强制性的。此外, 由于商业设备是为人类应用而制造的, 与人类患者的 b 扫描相比, 老鼠 oct 图像的质量仍然较低。在作者的经验中, 在人工矫正过程中, 可能很难区分不同的视网膜内层 (视网膜神经纤维层、神经节细胞层和神经丛内层)。因此, 我们建议将这些图层作为复合读数 (irl) 进行分析。

实验装置为挥发性麻醉提供了一个选择, 例如吸入异氟烷, 根据我们的经验, 它比注射麻醉更安全、更容易控制, 例如氯胺-雷嗪41、42, 并降低了风险在采集时间较长的情况下 (例如, 在对荧光标记的细胞进行成像时), 啮齿类动物过早苏醒。在初步研究中, 体积扫描被确定为有效性和可靠性最高的协议。用 icc (类内相关系数值) 对所有评估进行了不包括含有光学盘的中心部分的体积扫描, 测试内的可靠性非常高。

运动反应的测量是基于非自愿的视动反射, 这种反射是在连续移动的场上发生的。在啮齿类动物中, 与其他物种不同的是, 这种运动不仅涉及眼睛, 还涉及整个头部, 使用相机很容易检测到。

区分动物的 "跟踪" 或正常行为动作需要对研究者进行一些培训, 对实验组来说, 蒙蔽双眼是很重要的。此外, 动物需要一个适应阶段, 以适应实验设置, 在长期的测量协议, 动物必须反复动画, 以确保 "没有跟踪" 是由于达到 okr 阈值, 而不是减少注意。实验室小鼠和大鼠 43, 44 的视觉功能也有显著的菌株变异性。因此, 应在对啮齿类动物进行测试之前对其视力进行评估, 并且某些菌株 (如 sjl 小鼠) 甚至可能不适合 okr 测量, 因为它们是等位基因 pde6brd1 (视网膜变性 1) 的纯合子。

总之, 对动物模型中视网膜形态和视觉功能的检查允许对 eae 环境中发生的结构和功能损伤进行非侵入性的纵向调查, 并可能有助于涉及视觉的其他模型。系统, 包括但不限于视网膜病变或视神经损伤的模型。

披露声明

与提交人提交的工作无关, 他们宣布了以下财务披露:

迈克尔·迪特里希获得了诺华的演说者酬金。安德烈斯·克鲁兹-赫兰兹是国家多发性硬化症学会的博士后研究员。ari j. green 曾在 medimune、novartis、octims、初始5生物科学和生物技术的科学咨询委员会任职;是 jama 神经病学的副主编;是神经病学的编辑委员会成员;拥有再髓鞘分子和途径的专利;咨询为盗五科学;获得诺华制药公司 octims、初始科学 sa、ninss、nia、国家 ms 协会、sherak 基金会和希尔顿基金会的研究支持;持有《盗梦空间5》中的股票或股票期权;并在美兰诉特瓦制药公司担任专家证人。hans-peter hartung 从 biogen idec、genuro、赛诺菲根齐姆、默克、诺华制药、八塔巴哈、奥克罗华治疗、teva 制药、medimmune、拜耳医药保健、前进制药公司和制药公司获得了在指导委员会任职的费用。罗氏, 在 biogen idec、赛诺菲genzyme、merck、novarts 制药、octapharma、opexa 治疗药物、teva 制药和罗氏的咨询委员会任职费用, 以及 biogen idec、赛诺菲根齐姆、默克、诺华制药公司的讲座费用, 奥克塔帕马, 奥普萨治疗学, 泰瓦制药, 医疗免疫和罗氏。菲利普·阿尔布雷希特因在 ipsen、诺华、biogen 的科学咨询委员会任职而获得赔偿;他获得了诺华、特瓦、生物根、默兹制药、伊普森、阿勒甘、拜耳医疗、埃赛伊、ucb 和葛兰素史制药公司的演讲人荣誉和旅行支持;他得到了诺华、生物根、泰瓦、默茨制药、伊普森和罗氏的研究支持。其他作者报告没有披露。

致谢

这项工作得到了罗伯特·普弗莱格-基金会博士和伊尔塞洛尔·卢克基金会以及 biogen 和诺华向巴勒斯坦权力机构提供的赠款的支持。图1b 转载于 "全身位置机械手, 用于麻醉小鼠和大鼠的眼部成像: 自己动手的指南。dietrich, m., cruz-herranz, a., yiu, h., aktas, o., bradt, a. u., hartung, hp., green, a. albrecht, p. bmj 开放眼科。1 (1)、e000008、2017 ", 经 bmj 出版集团有限公司许可。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system Heidelberg Engineering, GermanyN/Aophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg Engineering, GermanyN/AVersion 1.9.10.0
blue 25D non-contact  lensHeidelberg Engineering, GermanyN/Alens for rodent mesurement
OptoMotryCerebralMechanics Inc., CanadaN/Asystem for visual function analysis
OptoMorty HD softwareCerebralMechanics Inc., CanadaN/AVersion 2.1.0
Inhalation Anesthetic IsofluranePiramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA 803250inhalation anesthetic
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% University Hospital Düsseldorf, GermanyN/Apupillary dilation 
Visc-OphtalDr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany58407ophthalmologic eye gel
GraphPad PrismGraphPad Software Inc, San Diego, CA, USAN/Astatistical analysis software, Version 5.00
IBM SPSS StatisticsIBM Corporation, Armonk, New York, USAN/Astatistical analysis software, Version 20

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