Method Article
פרוטוקול מפורט להערכה של המפרט מבנית וחזותית בחולדות על ידי תגובת טומוגרפיה ו optokinetic אופטית קוהרנטית מוצג. התוצאות מספקים תובנות בעלות ערך מחקר ophthalmologic, כמו גם רגשיות ונוירולוגיות.
טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) היא טכניקה מהירה, לא פולשנית, interferometric ומאפשר הדמיה הרשתית ברזולוציה גבוהה. זה כלי אידיאלי לחקירה של תהליכים הקשורים ניוון מוחיים, neuroprotection, נוירו-תיקון הכוללים מערכת הראייה, כמו אלה correlate לעיתים קרובות עם שינויים ברשתית. כמו את המחוון פונקציונלי תנועות ראש ועין ישימים מבחינה ויזואלית עורר משמשות בדרך כלל ניסיוניות המערבים את הפונקציה חזותי. שילוב של שתי טכניקות מאפשר חקירה ויוו כמותית של מבנה ותפקוד, אשר יכול לשמש כדי לחקור את התנאים פתולוגיים או להעריך את הפוטנציאל של הריפוי. יתרון גדול של טכניקות הציג האפשרות לבצע ניתוחי האורך מאפשר החקירה של תהליכים דינאמיים, הפחתת השתנות, מצמצם את מספר בעלי חיים לצורך הניסויים. הפרוטוקול המתואר שואפת לספק מדריך רכישת וניתוח של סריקות רשתית באיכות גבוהה של עכברים וחולדות באמצעות בעל עלות נמוכה מותאם אישית עם אפשרות לספק הרדמה inhalational. בנוסף, המדריך המוצעת מיועדת כמו חוברת הוראות לחוקרים באמצעות ניתוח התגובה (OKR) optokinetic בחולדות, אשר ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ואת האינטרסים שלהם.
הבדיקה של מסלול ויזואלי, כחלק של מערכת העצבים המרכזית, הוכח להיות נקודת מוצא יעיל בטיפול לא רק ophthalmologic1,2,3,4,5 , אבל גם נוירולוגיים6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 שאלות. בשנים האחרונות, OCT ו OKR זוהו כלים אנליטיים, לא פולשנית שימושיים כדי להעריך את מגוון גדול של retinopathies, רשתית ביטויים שונים מכרסמים מודלים17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT מאפשר רזולוציה גבוהה ומהירה ויוו ויזואליזציה של מורפולוגיה ברשתית, מבנה עכברים וחולדות, עם תוצאות בהתאם טוב עם מקטעים היסטולוגית של חיות retinae26. OKR מהווה שיטה חזקה ומהירה כדי להעריך באופן כמותי את תפקיד הראייה.
התקנים רבים OCT מאפשרים סימולטני קונאפוקלית סריקת לייזר ophthalmoscopy (cSLO) הדמיה עם אורכי גל שונים, אשר מספק מידע אבחון על פתולוגיות ברשתית, קרי, ויזואליזציה של הפקדות lipofuscin או שינויים של הרשתית פיגמנט אפיתל27. יתר על כן, אין ויוו הדמיה של זריחה מתויג תאים בעלי החיים הטרנסגניים הוא אפשרי28,29,30,31,32. עם זאת, היישום של טכנולוגיה OCT במודלים מכרסמים הוא עדיין מאתגר, בעיקר בשל גודל העין קטן. מספר התקנים זמינים מסחרית דרוש עיבודים, לעיתים קרובות גודל אחר מחזיק נדרשת תמונה החיות של מינים שונים. בנוסף, בעלי חיים לדרוש הרדמה למדידה.
OKR התקנים יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציה חזותיים במכרסמים. החיות ממוקמות על פלטפורמה במרכז גליל בפועל או וירטואלי הצגת נע grating, אשר החיות המסלול עם הראש רפלקסיבי ותנועות הצוואר. תגובה optokinetic זו מצומצמת או מסולק במקרה של הפחתת או אובדן התפקוד חזותי.
המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את המדריך מדידת עובי הרשתית באמצעות מכשיר OCT זמינים מסחרית עם בעל מותאם אישית במתן הרדמה נשימתית. הפרוטוקול מדגים כיצד לנתח סריקות אמצעי אחסון באמצעות התוכנה המצורפת על ידי היצרן. בדיקה חזותית, המטרה היא לספק הוראות כיצד להשתמש במערכת זמינים מסחרית כדי להעריך את OKR.
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ניסיוני שאושרו על-ידי רשויות אזוריות (המדינה הסוכנות עבור טבע, איכות הסביבה, הגנת הצרכן; הפניה מספר 84-02.04.2014.A059) ו לציית האגודה במחקר חזון והצהרת רפואת עיניים (ארוו) שימוש של החיות לרפואת עיניים, מחקר חזון ואת אירופה הוראת 2010/63/האיחוד האירופי בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.
1. קונאפוקלית סריקת לייזר טומוגרפיה Ophthalmoscopy-אופטית קוהרנטית
הערה: הפרוטוקול עבור cSLO-אוקטובר מדידה היא יכולת הסתגלות עבור כל זני מעבדה עכברים וחולדות.
2. Optokinetic תגובה
הערה: בחלק זה, מסופק המדריך מפורט OKR המידות של עכברים וחולדות, אשר ניתן להתאים לצרכים ספציפיים.
באמצעות 3rd דור OCT הדמיה ב המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) פפטיד המושרה מודלים העכבר ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE), סעיפים מורפולוגי ברזולוציה גבוהה של הרשתית העכבר התקבלו. באמצעות טכנולוגיה זו, היכולות מגן מחומרים שונים היו והפגינו17. הערכים עובי השכבות ברשתית הפנימי (IRL) שהתקבלו הם טובים בהתאם המספרים של תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) מתקבל על ידי צביעת היסטולוגית של הרשתית wholemounts (איור 4).
OKR ניטור מספק פונקציונלי readout הקשורים ניוון מוחיים ראיתי על-ידי OCT. בניסויים אלה, תפקיד הראייה לאומדן כמו תדירות מרחבית OKR, ואת הנזק neuroaxonal העריכו כמו IRL דליל על-ידי OCT, היו קרובים הקורלציה17. יכול להיות מועסק פרוטוקולים שונים כדי לבחון את חדות הראייה על ידי שינוי תדירות מרחבית או הזמנית, רגישות חדות, התמצאות או מהירות של הרשת נע. במודל EAE, זוהה של תדירות מרחבית משופרת של 0.05 מחזורים/תואר (c/d) של בעלי חיים מטופלים עם חומר 1 בהשוואה ל ש א-EAE שלא טופלו עכברים (איור 5).
איור 1: מותאם אישית מחזיק למדידה OCT. (א) OCT הדמיה של עכבר C57BL/6J שימוש מותאם אישית מחזיק33 ו- (B) ציר הסיבוב סביב העין מכרסמים. הוא הפגין סיבוב במטוס רוחבי (משמאל) ולא במישור צירית (מימין). איור זה שונה מדיטריך, מ et al.33. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: OCT פוסט ניתוח רכישת. "1, 2, 3 מ מ" רשת ETDRS בפרוטוקול 25 B-scan נפח (משמאל). עובי שכבות הרשתית מסופק עבור המגזרים השונים הרשתית על ידי התוכנה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: OKR מדידה של עכברים, גירוי הגדרות. מבט מלמעלה (א) דרך המצלמה ניתוח עכבר C57BL/6J על פלטפורמת בבית הבליעה. (B) ממשק המשתמש ואת ההגדרות של התוכנה OKR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: C57BL/6J עכברים עם ש א EAE הצג מסלול המחלה הקלוש כאשר מטופלים עם חומר 1 לעומת שולט לא מטופל. (א) התנוונות רשתית לשכבות הפנימיות הוא מופחת (B) ולא במישור הקליני EAE הציון הוא נחלש במהלך הקורס EAE כאשר חומר 1 היה מנוהל. עכברים זכו מדי יום, OCT מדידות בוצעו מדי חודש על פני תקופה של 120 ימים. הגרפים מייצגים את אומר, שגיאת תקן של חיות לפחות עשרה לכל קבוצה. (*p < 0.05, * * *p < 0.001, אזור תחת עקומת מאת אנובה לעומת הבדיקה לאחר הוק של Dunnett). (ג) השינוי עובי IRL הוא בהתאם טוב עם אובדן מהרשות לשיקום האסיר (* * *p < 0.001, מאת אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett בהשוואה ל ש א לא מטופל עכברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: OKR מדידה של C57BL/6J עכברים עם ש א-EAE. (א) OKR מגלה ראייה משופרת של חיות מטופלים עם חומר 1 בהשוואה שלא טופלו עכברים EAE ש א נמדדת סף בתדר המרחבי בדיקות על פני תקופה של 120 ימים. הגרפים מייצגים את מתכוונת שגיאת תקן של חיות לפחות שש לכל קבוצה (* *p < 0.01, * * *p < 0.001, אזור תחת עקומת מאת אנובה לעומת הבדיקה לאחר הוק של Dunnett). (B) תמונה של עכבר C57BL/6J בחדר הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
פרוטוקול זה מספק הוראה המדידות עובי, הבחינה של תפקיד הראייה בחולדות. המפרט חזותיים משמשים יותר ויותר המחקר translational18,26,38,39,40 , המתעכבים בקלות ניסויים קליניים. היתרון המשמעותי של OCT בהשוואה חקירות היסטולוגית בניסויים על בעלי חיים היא ניתוחי האורך עלול לאפשר החקירה של תהליכים פתולוגיים דינאמיים, בעיקר צמצום מידת ההשתנות ואת המספר של בעלי החיים זקוקים לכל מחקר. יתר על כן, אין ויוו הדמיה עם OCT כפוף לא יציבות, חיתוך או צביעת חפצים, אשר עשוי להשפיע על עובי השכבה בחקירות היסטולוגית.
אולם, כיוון אורתוגונלית קרן הלייזר בתוך כל המטוסים ביחס הרשתית הוא שלב קריטי כדי להבטיח את האיכות ואת הפארמצבטית הערכים עובי. זה דורש אימון של החוקר, והוא חובה לפני הרכישה של OCT סריקות. בנוסף, כפי המכשירים מסחרי נבנים עבור יישומים אנושי, איכות התמונות OCT מכרסמים הוא עדיין נחות בהשוואה ל- B-סריקות של בני אדם חולים. בחוויה של המחברים, זה יכול להיות קשה להבחין את רשתית הפנימי שונה שכבות (סיבי עצב ברשתית שכבה, שכבת תאים גנגליון, השכבה הפנימית plexiform) במהלך תיקון ידני. לכן מומלץ ניתוח שכבות אלה כמו הבדיקה מורכב (IRL).
הגדרת הניסוי מספקת אפשרות לקבלת הרדמה נדיפים, למשל, נשימתית איזופלוריין, אשר הוא, מניסיוננו, יותר קל לשלוט מאשר זריקות הרדמה, למשל, קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים41,42 , מפחיתה את הסיכון התעוררות מוקדמת של מכרסמים במקרה של רכישה יותר פעמים (למשל, בעת ביצוע הדמיה של תאים עם תוויות ברורות fluorescently). מחקר ראשוני, נפח הסריקות אותרו כמו הפרוטוקולים עם הגבוה ביותר תוקף ומהימנות. מהימנות הבחינה מדרג בין ובדיקה מעולה כאשר נפח סריקות למעט החלק המרכזי המכיל את התקליטור האופטי היו העריך עם ICC ערכים (מקדם המתאם אינטרה-class) מעל 0.85 עבור כל הערכות.
המדד של התגובה optokinetic מבוסס על רפלקס לא רצוני optokinetic, אשר מתרחשת בתגובה שדה נע באופן רציף. בחולדות, בניגוד מינים אחרים, התנועה כרוך לא רק העיניים, אבל הראש הזה, אשר בקלות ניתן לאתרם באמצעות המצלמה.
הבחנה בין "מעקב" או נורמלי תנועות ההתנהגות של בעלי החיים דורש הכשרה של החוקר וזה חשוב להיות עיוור עבור קבוצת הניסוי. בנוסף, בעלי החיים זקוקים שלב התאקלמות כדי להכיל את ההגדרה ניסיוני ובמהלכה מדידה ותיק פרוטוקולים, החיות חייב להיות אנימציה שוב ושוב כדי להבטיח כי "אין מעקב" הוא בשל להגיע לסף OKR ולא על הפחתת תשומת לב. יש גם השתנות המתח משמעותי לגבי הפונקציה חזותי של מעבדה עכברים וחולדות43,44. לכן צריך ניתן להעריך את חדות הראייה של מכרסם לפני שהם נבדקים זנים מסוימים, כגון עכברים SJL, אפילו עשוי להיות לא מתאים מדידות OKR, כפי שהם homozygous עבור אלל Pde6brd1 (ניוון הרשתית 1).
לסיכום, בחינת תפקיד הראייה ומורפולוגיה ברשתית במודלים של בעלי חיים מאפשר החקירות לא פולשנית, האורך של נזק תפקודי מבניים המתרחשים בהקשר של EAE והוא עשוי להיות שימושי במודלים אחרים המערבים את התמונה מערכת, כולל אך לא מוגבל הדגמים של retinopathies או פציעה של עצב הראייה.
לא קשור לעבודה. הציגו שהמחברים מצהירים על גילויים הפיננסיים הבאים:
דיטריך מייקל קיבל רמקול honoraria נוברטיס. אנדרס קרוס-Herranz הוא בחור דוקטורט של האגודה לטרשת נפוצה הלאומית. ארי ג'יי ירוק מוגש למועצה המדעית המייעצת של MedImmune, נוברטיס, OCTIMS, ראשית החיים 5 ו Bionure; היא עורכת-משנה לנוירולוגיה ג'אמה; היה חבר מועצת המנהלים העריכה לנוירולוגיה; בעל פטנט על מולקולות remyelination מסלולים; יש להתייעץ עם הקמתה 5 מדעי; המחקר קיבל תמיכה של נוברטיס פארמה OCTIMs הקמתה מדעי ההזמנות, NINDS, ניה, חברה MS לאומית, Sherak קרן, קרן הילטון; מחזיק מניות או אופציות הקמתה 5; שימש כעד מומחה-v Mylan פארמה טבע. הנס פטר הארטונג קיבלה דמי הגשה על ועדות ההיגוי של Biogen איידק, GeNeuro, סאנופי ג'נזיים, מרק, נוברטיס פרמצבטיקה, Octapharma, Opexa הרפוי, טבע, MedImmune, Bayer HealthCare, קדימה פארמה, ו רוש דמי הגשה על לוחות המייעצת Biogen איידק, סאנופי ג'נזיים, מרק, נוברטיס פרמצבטיקה, Octapharma, Opexa הרפוי, במוטורולה, רוש, הרצאה תעריפים מעת Biogen איידק ג'נזיים סאנופי, מרק, נוברטיס פרמצבטיקה , Octapharma, Opexa הרפוי, במוטורולה, MedImmune ורוש. פיליפ אלברכט קיבל פיצוי על ההגשה על גבי לוחות המדעית המייעצת Ipsen, נוברטיס, Biogen; הוא קיבל רמקול honoraria ולנסוע תמיכה נוברטיס, טבע, Biogen, תרופות Merz, Ipsen, Allergan, Bayer Healthcare, איסיי, UCB, גלקסו סמית קליין; הוא קיבל תמיכה במחקר של נוברטיס, Biogen, טבע, Merz תרופות, Ipsen רושה. המחברים אחרים מדווחים אין גילויים.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ד ר רוברט Pfleger-קרן Ilselore Luckow-קרן, כמו גם Biogen ואת נוברטיס על אבא איור 1B שוחזר מ "לכל הגוף סימולטורי לפי מיקום עבור הדמיה עינית של מרדימים עכברים וחולדות: מדריך עשה זאת בעצמך. דיטריך, מ., קרוס-Herranz, ת., Yiu, ה, Aktas, O..., ברנדט, א. א, הארטונג, HP., ירוק, א, אלברכט, עיניים פתוחות עמ' BMJ. 1 (1), e000008, 2017" באישור BMJ קבוצת פרסום בע מ
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved