쥐와 쥐에 구조와 기능적 시각 시스템 판독으로 광학 일관성 단층 촬영 및 Optokinetic 응답을 사용 하 여

요약

광학 일관성 단층 촬영 및 optokinetic 응답이 설치류에서 구조적 및 시각적 판독의 평가 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 결과 신경학 상 뿐 아니라 안과 연구에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공합니다.

초록

광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 고해상도 망막 이미징 수 있도록 빠르고, 비-침략 적 간섭 기술입니다. Neurodegeneration, neuroprotection 및 신경-수리 이러한 종종 망막 변화와 잘 상관 관계가 시각적 시스템 관련 프로세스의 수사를 위한 이상적인 도구입니다. 로 기능 판독, 시각적으로 갖는 보상 눈과 머리의 움직임 일반적으로 시각 기능을 포함 하는 실험 모델에 사용 됩니다. 두 기술을 결합의 구조와 기능, 병 적인 상태를 조사 하거나 새로운 치료제의 잠재력을 평가 하는 사용 될 수 있는 양적 vivo에서 조사 수 있습니다. 발표 기법 큰 혜택 동적 프로세스, 다양성 감소의 조사를 허용 하는 경도 분석을 수행할 수 이며, 실험에 필요한 동물의 수를 줄였다. 프로토콜 설명 수집 및 쥐 및 쥐 inhalational 마 취를 제공 하는 옵션으로 저비용 맞춤형된 홀더를 사용 하 여 고품질 망막 스캔의 분석에 대 한 설명서를 제공 하는 것을 목표로 합니다. 또한, 제안 된 가이드 교육 매뉴얼으로 연구자 optokinetic 응답 (OKR) 분석을 사용 하 여 그들의 특정 요구와 관심에 맞게 수 있는 설치류에 대 한 것입니다.

서문

중앙 신경 시스템의 한 부분으로 시각적인 통로의 시험 뿐만 아니라 안과^{1,2,3,4,5 해결에 효과적인 시작 지점 수 입증 되었습니다.} , 또한 신경학 상^{6,7,,89,10,11,12,13,14만 ,,1516} 질문. 최근 몇 년 동안, 10 월과 OKR retinopathies과 다양 한 설치류 모델^17,,1819 에 망막 발현의 큰 다양성을 평가 하는 유용한 분석, 비-침략 적 툴으로 확인 되었습니다 ^{, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25}. 10 월 망막 형태학과 구조 생쥐와 쥐, 동물 retinae²⁶의 조직학 섹션에 따라 좋은 결과 시각화 vivo에서 신속 하 고 높은 해상도 대 한 수 있습니다. OKR 구성 양적 시각 기능을 평가 하기 위해 신속 하 고 강력한 방법 합니다.

많은 10 월 장치 동시 공초점 레이저 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (cSLO) 이미징 즉 망막 병 리에 대 한 진단 정보를 제공 하는 다른 파장, lipofuscin 예금의 시각화 또는 망막의 변경 허용 안료 상피²⁷. 또한, 형광 유전자 변형 동물에서 세포 분류의 이미징 vivo에서 가능한^{28,29,30,,3132}입니다. 그러나, 10 월 기술 설치류 모델에서의 응용 프로그램은 여전히 도전, 작은 눈 크기 때문에 주로. 여러 상용 장치 적응을 요구 하 고 종종 소유자의 다른 크기 다른 종의 동물을 이미지 하는 데 필요한. 또한, 동물 측정에 대 한 마 취를 요구 한다.

OKR 장치는 설치류에 시각적 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 동물에 배치 됩니다 표시를 이동 하는 실제 또는 가상 실린더의 중심에서 플랫폼 격자, 동물 추적 재귀 머리와 목의 움직임을. 이 optokinetic 응답이 감소 또는 감소 또는 시각적 기능의 손실을 제거.

이 프로토콜의 목표는 상용 10 월 장치를 사용 하 여 흡입 마 취를 제공 하는 사용자 지정 보유자와 망막 두께의 측정에 대 한 매뉴얼을 제시 하는입니다. 프로토콜에서는 볼륨 검사는 제조업체에서 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하는 방법을 보여 줍니다. 시각적 테스트에 대 한 목표는 OKR를 평가 하기 위해 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하는 방법에 지침을 제공 하는.

프로토콜

모든 동물 (자연, 환경 및 소비자 보호를 위한 국가 기관, 참조 번호 84-02.04.2014.A059) 지역 당국에 의해 승인 실험 지침에 따라 수행한 과정과 협회에 대 한 준수 비전 및 안과 (ARVO) 문 안과 및 비전 연구와 유럽 지침 2010/63/EU 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 있는 동물의 사용에 대 한 연구.

1. 공초점 레이저 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy 광학 일관성 단층 촬영

참고: CSLO 10 월 측정을 위한 프로토콜은 실험실 쥐 및 쥐의 모든 변종에 대 한 적응력입니다.

1. 설치 및 사전 이미지 준비
   참고: 이 프로토콜에 사용 되는 10 월 장치 시스템 구성을 사용 하지 않는 것은 이미 설명 되어³¹.
2. 흡입 마 취에 대 한 설치류 준비
   1. 유도 챔버에 쥐를 놓고 isoflurane 농도 2 %2 L/min O₂에 하는 기화 기를 설정 합니다.
   2. 쥐 꼬리를 곤란 하 게 하 여 취는, 제거 약 실에서 확인 하 고 따뜻하게 유지를 종이 타월에 포장.
   3. 사용자 지정 홀더³³ 에 쥐를 놓고 기화 (2 L/min O₂에서 2.5 %isoflurane)에 연결, 입 작품의 통합된 물린 바에 상 악 앞 니를 연결 합니다.
   4. 동 공 팽창에 대 한 각각의 눈에 한 방울 Phenylephrine 2.5%-Tropicamide의 0.5%를 적용 합니다.
   5. 1 분 후 안 약의 어떤 과잉 액체를 닦아 내 고 기름칠을 메 틸-셀 루 로스 근거한 안과 젤 눈 (예: hypromellose 0.3% 안 약) 건조 하지 않도록 하 고 각 막의 혼 탁도.
   6. 손이나 집게를 사용 하 여 마우스 눈에 사용자 지정 콘택트 렌즈 (+ 4 디 옵 터)를 배치 합니다. 평면 서피스를 보장 하기 위해서 광학 속성 없이 (예를 들어, 라운드 12mm 직경 유리 coverslip) 유리 접시와 쥐 눈을 커버.
      참고: 마 취 동안 모니터 호흡 속도입니다. 필요한 경우 Isoflurane 농도 늘리거나 설정 합니다.
3. 측정 및 분석
   참고: ³⁴ APOSTEL 권장 사항 따라 OCT 측정 보고서 및 수행 오스카-IB 합의 기준³⁵에 따라 품질 관리를 수행 해야 합니다. 이러한 권장 사항을 개발 되었으며, 인간의 10 월 이미지, 일부 기준이 되지 않습니다 또는 부분적으로 적용.
   1. 왼쪽된 눈 이미지, 카메라 쥐 얼굴의 왼쪽된 눈 전구 되도록 그림 1A 에 제시 된으로 홀더를 놓습니다.
   2. 수집 모드를 시작 하려면 컨트롤 패널 디스플레이의 오른쪽 모서리에 있는 시작 버튼을 누릅니다.
   3. R 필터 레버를 설정 하 고 블루 반사율 저 영상과 B-스캔 수집 컨트롤 패널에 대 한 BR + 10 월 을 선택 합니다.
   4. 약 38 디 옵 터는 카메라의 뒷면에 초점 손잡이 사용 하 여에 초점 거리를 설정 하 고 망막에 OCT 스캔 화면에 표시 될 때까지 확대.
      참고: 첫 번째 측정에서 참조 팔 쥐 측정에 적용할 수 있다. 조합 Ctrl + Alt + Shift + O를 누르고 열린 창에서 참조 팔의 값을 조정 하는 OCT 스캔 화면에 나타날 때까지.
   5. 모든 비행기에 망막에 직교 각도와 눈동자의 가운데를 통해 빔 경로 보장 하기 위해, 광학 디스크 조명된 분야 (BR) 중간에 놓고 회전/회전 하 여 수평 및 수직 라인 B 검사는 수평 조정 홀더 (그림 1B) 하거나 카메라를 이동 합니다.
   6. 볼륨 스캔 모드를 선택 하 고 50 자동 추적 (미술, 래스터화된 50 평균된 A-스캔에서) 소프트웨어 화면에 고해상도 모드에서 25 B-스캔 설정.
   7. 광학 디스크의 볼륨 검색 표에의 중앙 센터 및 수집 컨트롤 패널에서 검은 감도 손잡이 그리고 취득 을 눌러 시작.
   8. A필터 레버를 설정, 컨트롤 패널에서 블루 자동 개화 (BAF)를 선택 하 고 감도 조절기와 이미지의 밝기를 조정. 이미지 형광 셀 (예: EGFP) 또는 자동 형광 예금 감도 손잡이 그리고 취득 을 누릅니다.
   9. 탈수를 방지 하기 위해 동물 열 소스와 별도 새 장에 넣어 쥐의 눈에 눈 젤을 적용 합니다.
   10. 완전히 별도 새 장에 마 취에서 회복 이며 개별적으로 지 내게 될 때까지 쥐를 감독. 동물 때 외래, 홈 케이지를 반환.
   11. 볼륨 검사의 분석을 위해 10 월 장치 소프트웨어의 자동화 된 세그먼트를 사용 하 여 스캔을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 세분화 다음 모든 레이어를 선택 합니다. OCT 이미지의 품질은 충분 한 ㄴ 다는 것을 확인 하 고 품질의 실험, 예를 들어, 각 집합에 대 한 차단 정의 > 20 데시벨.
   12. 원하는 스캔에 더블 클릭 하 여 레이어의 수동 보정을 수행, 두께 프로 파일 을 선택 하 고 레이어 세그먼트 편집을 클릭 합니다. 한 레이어를 선택, 예를 들어, ILM 내부 제한 막에 대 한 누르고, 필요한 경우 올바른 위치로 끌어서 여 빨간 점 들을 이동 하 여 녹색 라인을 수정.
       참고: 수동 보정을 수행 하는 조사 실험 그룹에 대 한 눈을 멀게 한다는 것을 확인해 라.
   13. 두께 지도 탭을 선택 하 고 당뇨병 성 망막 증 연구 (ETDRS) 격자의 1, 2, 3 mm 조기 치료를 선택. 광학 디스크 (그림 2, 왼쪽)에 측근 센터.
   14. 관심의 다른 망막 분야에 대 한 소프트웨어에 의해 제공 되는 두께 값에서 망막 층의 두께 계산 합니다. 양 검사에서 평균 두께 값을 계산 하려면 전체 1, 2, 3 m m ETDRS 그리드, 광학 디스크 (그림 2, 오른쪽)에 포함 된 내부 1 m m 원 제외 약 25 °의 각도 커버.
   15. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 동물의 두 눈에는 하는 경우 고려 내 주제 간 눈 상관 관계에 대 한 통계 모델 회계 (예:, 일반화 추정 방정식 또는 혼합 선형 모델) 한 주제의 눈은 통계적으로 종속,³⁶ .

2. Optokinetic 응답

참고: 다음에, 쥐 및 쥐의 OKR 측정을 위한 상세한 설명서 제공, 개인의 특정 요구에 적응 될 수 있는.

1. 설치 및 사전 측정 준비
   1. 컴퓨터를 켭니다. 시스템, 부팅 후 설정 화면 자세히 다른 곳에 설명 된 대로 테스트 챔버의³⁷.
   2. 쥐 또는 쥐의 측정에 적합 한 플랫폼을 선택 합니다.
      참고: 플랫폼 크기는 설치류의 신체 크기에 따라 선택 됩니다. 동물 산책 하는 능력 없이 플랫폼에 제대로 앉아 있어야한다.
   3. 소프트웨어 두 번 클릭 하 여 사전 설정 창을 엽니다, 그리고 새 그룹 을 선택 하 고 그룹 이름, 과목, 종 및 종자의 수를 선택 하십시오. 선택 변수 자극: 공간/시간 주파수, 대비 감도, 속도 또는 방향 드롭 다운 메뉴에서 누른 다음 새 그룹 만들기.
   4. 챔버의 위에 카메라의 포커스 링을 조작 하 여 플랫폼에 집중 하 고 (드래그 앤 드롭)을 정렬 하 여 시스템을 보정 플랫폼에 검은 동그라미 주위에 빨간색 원을.
2. 측정 및 분석
   1. 플랫폼에는 동물, ~ 5 분 (그림 3A) 떨어지면 동물 플랫폼에 다시 리프트에 대 한 환경에 적응 하자.
   2. 소프트웨어 화면 (그림 3B)의 오른쪽 상단 모서리에 주제 번호 및 상태 를 선택 합니다. 한 자극은 변수, 다른 자극 일정 하 게 유지 됩니다. 이 자극 옆 오픈 잠금 또는 잠금 폐쇄 상징에 의해 확인 된다.
   3. 선택 하 여 ◄ 예 또는 ■ No, 동물 추적 하거나 추적 하지 않습니다, 각각 측정을 시작 합니다.
      참고: 시계 방향으로 추적 오른쪽 눈에 왼쪽 및 시계 반대 방향으로 추적에 해당합니다. 소프트웨어는 무작위로 움직이는 격자의 방향을 변경합니다.
   4. 변수 자극 옆의 위로 및 아래로 화살표를 클릭 하 여 수동으로 자극의 스텝 크기를 선택 하거나 자극 임계값 수렴 하는 경우는 소프트웨어에 의해 자동으로 적응 하자.
   5. 최적의 결과 얻으려면 높은 휘파람 소리와 소프트웨어 화면에 검은색 또는 흰색 상자 기호를 클릭 하 여 블랭킹 동물, 을 예를 들어, 애니메이션. 반복적으로 장기간된 측정의 경우 이러한 작업을 수행 합니다.
   6. 데이터 분석을 위해 요약 탭을 선택 하 고 파일 을 클릭 | 원하는 데이터 집합을 내보내려면 테이블/그래프 내보내기 .
   7. 원하는 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 (1.3.15 단계 참조).

결과

실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 마우스 모델을 이용한 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 펩 티 드의 3^rd 세대 10 월 이미지를 사용 하 여, 마우스 망막의 고해상도 형태학 섹션 획득 했다. 이 기술을 사용 하 여, 다른 물질의 보호 용량 시연된¹⁷이었다. 가져온 (IRL) 안 망막 층의 두께 값 망막 신경 절 세포 (RGC) 망막 wholemounts (그림 4)의 조직학에 게 얼룩이 지기 여의 숫자에 따라 좋은에 있습니다.

OKR 모니터링 10 월 볼 neurodegeneration의 기능 판독을 제공 합니다. 이 실험에서 OKR, 공간 주파수로 평가 하는 시각 기능 및 IRL 10 월,으로 숱이로 평가 neuroaxonal 손상 가까운 상관 관계¹⁷에 있었다. 다양 한 프로토콜 공간 또는 일시적인 주파수, 대비 감도, 방향 또는 이동 격자의 속도 변경 하 여는 시력 검사를 사용할 수 있습니다. EAE 모델에서 물질 1로 치료 하는 동물의 0.05 사이클/학위 (c/d)의 향상 된 공간 주파수 치료 MOG EAE 마우스 (그림 5)에 비해 검색 되었습니다.

그림 1: 10 월 측정에 대 한 사용자 정의 홀더. 사용자 지정 홀더³³ 설치류 눈 주위 회전 축 (B)를 사용 하 여 C57BL/6J 마우스의 (A) 10 월 이미지입니다. (왼쪽) 가로 평면에서 회전 축 평면 (오른쪽)에 보여 줍니다. 이 그림에서 디트리히, M. 수정 되었습니다 외.³³. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 10 월 게시물 수집 분석. (왼쪽) 25 B-스캔 볼륨 프로토콜에 "1, 2, 3 mm" ETDRS 그리드. 망막 층의 두께 다른 망막 분야 (오른쪽) 소프트웨어에 의해 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 쥐와 자극의 OKR 측정 설정. (A) 상단 챔버에 플랫폼에 C57BL/6J 마우스를 분석 하는 카메라를 통해 보기. (B) 사용자 인터페이스 및 OKR 소프트웨어의 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: MOG EAE 된 C57BL/6J 마우스 표시 물질 치료 컨트롤에 비해 1로 치료 하면 감쇠 질병 과정. (A) 안 망막 층의 변성은 감소 (B)와 임상 물질 1 투여 때 EAE 점수 EAE 과정 감쇠입니다. 마우스는 매일, 득점 했다 그리고 120 일의 기간 동안 매월 10 월 측정 수행 했다. 그래프는 평균 및 그룹 당 적어도 10 동물의 표준 오차를 나타냅니다. (*p < 0.05, * * *p < 0.001, ANOVA에 의해 Dunnett의 포스트 hoc 테스트에 비해 곡선 아래의 영역). (C) IRL 두께 변화는 좋은 따라 RGC 손실 (* * *p < 0.001, 집 고 양이 치료 쥐에 비해 Dunnett의 포스트 hoc 테스트와 ANOVA에 의해). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: MOG EAE C57BL/6J 생쥐의 OKR 측정. (A) OKR 밝혀 동물의 향상 된 시력 치료 물질 공간 주파수 임계값 120 일의 기간 동안 테스트에 의해 측정 치료 MOG EAE 쥐에 비해 1. 그래프 표현 의미와 그룹 당 6 동물의 표준 오차 (* *p < 0.01, * * *p < 0.001, ANOVA에 의해 Dunnett의 포스트 hoc 테스트에 비해 곡선 아래의 영역). 테스트 챔버에 C57BL/6J 마우스의 (B) 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 프로토콜은 두께 측정 및 설치류에서 시각적 기능 시험에 대 한 지침을 제공합니다. 시각적 정보 변환 연구^{18,26,38,,3940} 에서 점점 사용 되 고 임상 시험을 쉽게 양도할 수 있습니다. 동물 실험에서 조직학 조사에 비해 10 월의 중요 한 장점은 경도 분석은 크게 다양성 그리고 수를 감소 동적 병 적인 프로세스의 조사를 허용 가능 동물 연구 당 필요 합니다. 또한, oct vivo에서 이미징 고정, 절단 또는 얼룩 아티팩트를 레이어 두께 조직학 수사에 영향을 미칠 수 있는 대상이 아니다.

그러나, 망막에 관하여 모든 비행기에 레이저 광선의 직각 방향 품질 및 두께 값의 재현성을 보장 하기 위해 중요 한 단계입니다. 그것은 탐정의 몇 가지 훈련이 필요 하 고 10 월 검사의 인수 전에 필수. 또한, 상업적인 장치는 인간의 응용 프로그램 구축, 설치류 10 월 이미지의 품질이 여전히 열 등 한 인간 환자의 B-스캔에 비해 합니다. 저자의 경험에서 그것은 다른 내부 망막을 구별 하기 어려울 수 있습니다 레이어 (망막 신경 섬유 층, 신경 절 세포 층 및 안 plexiform 층) 수동 교정 중. 따라서 복합 판독 (IRL)으로 이러한 계층을 분석 것이 좋습니다.

실험적인 체제는 휘발성 마 취, 예를 들어, 흡입 isoflurane, 우리의 경험, 안전 하 고 쉽게 마 취 제-xylazine^41,42 주 사용 마 취, 예를 들어, 보다 제어 하 고 위험 감소에 대 한 옵션을 제공 합니다. 더 이상 획득 시 설치류의 조기 각 성 시간 (예를 들어, 이미징 붙일 이라는 셀의 수행). 예비 연구에서 볼륨 검사 높은 타당성과 신뢰성 프로토콜 확인 되었다. 간 측정 자 및 시험 재 시험 안정성 우수한 때 볼륨 스캔 광학 디스크를 포함 하는 중앙 부분을 제외한 모든 평가 대 한 0.85 위의 ICC (내부 클래스 상관 계수) 값으로 평가 했다.

Optokinetic 응답이 측정 무의식적인 optokinetic 반사, 지속적으로 이동 필드에 대 한 응답에서 발생을 기반으로 합니다. 설치류, 다른 종 달리에서 움직임 뿐만 아니라 눈, 하지만 쉽게 카메라를 사용 하 여 검출 될 수 있다 전체 머리를 포함 한다.

"추적" 사이 구별 또는 정상적인 동물의 행동 움직임 요구는 수 사관의 훈련 하 고 실험적인 그룹에 대 한 눈을 멀게 하는 것이 중요 하다. 또한, 동물 실험 설정 하 고 장기간 측정 프로토콜 중에 맞게 적응 단계, 동물이 "추적"가 때문에 OKR 임계값에 도달 하지 감소를 보장 하기 위해서 반복 애니메이션 주의입니다. 또한 실험실 생쥐와 쥐^43,44의 시각 기능에 관한 중요 한 스트레인 변화가 있다. 그들은 테스트 전에 SJL 마우스 같은 일부 긴장 되지 않을 수 있습니다 심지어 OKR 측정을 위해 적당 한 그들은 Pde6brd1 대립 유전자를 위해 homozygous 쥐의 시력 평가 따라서 한다 (망막 변성 1).

요약, 동물 모델에서 망막 형태학 및 시각적 기능 시험 EAE의 맥락에서 발생 하는 구조적 및 기능적 손상의 비-침략 적, 경도 수사 허용 하 고 시각을 포함 하는 다른 모델에 도움이 될 수 있습니다. 시스템, retinopathies 또는 시 신경 상해의 모델에 제한 되지 않음.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.10.0
blue 25D non-contact  lens	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	lens for rodent mesurement
OptoMotry	CerebralMechanics Inc., Canada	N/A	system for visual function analysis
OptoMorty HD software	CerebralMechanics Inc., Canada	N/A	Version 2.1.0
Inhalation Anesthetic Isoflurane	Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA	803250	inhalation anesthetic
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5%	University Hospital Düsseldorf, Germany	N/A	pupillary dilation
Visc-Ophtal	Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany	58407	ophthalmologic eye gel
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software, Version 5.00
IBM SPSS Statistics	IBM Corporation, Armonk, New York, USA	N/A	statistical analysis software, Version 20