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Resumen

Se presenta un protocolo detallado para la evaluación de lecturas visuales y estructurales en roedores por coherencia óptica tomografía y optoquinéticas respuesta. Los resultados proporcionan información valiosa para la investigación oftalmológica y neurológica.

Resumen

Tomografía de coherencia óptica (OCT) es una técnica rápida, no invasiva, interferometría, permitiendo la proyección de imagen retiniana alta resolución. Es una herramienta ideal para la investigación de los procesos de neurodegeneración y neuroprotección neuro-reparación que implica el sistema visual, como estas a menudo correlación con cambios retinianos. Como una lectura funcional, ojo compensatoria visualmente evocado y movimientos de la cabeza se utilizan comúnmente en modelos experimentales que implican la función visual. La combinación de ambas técnicas permite una investigación cuantitativa en vivo de la estructura y función, que puede utilizarse para investigar las condiciones patológicas o para evaluar el potencial de la nueva terapéutica. Un gran beneficio de las técnicas actuales es la posibilidad de realizar análisis longitudinales que permite la investigación de procesos dinámicos, reducción de la variabilidad y reduce el número de animales necesarios para los experimentos. El protocolo descrito tiene como objetivo proporcionar un manual para la adquisición y análisis de análisis de alta calidad retina de ratones y ratas usando un soporte personalizado bajo costo con una opción para entregar anestesia por inhalación. Además, la guía propuesta está destinada como un manual de instrucciones los investigadores usando análisis de la respuesta (OKR) optokinetic en roedores, que pueden ser adaptados a sus necesidades e intereses específicos.

Introducción

El examen de la vía visual, como parte del sistema nervioso central, ha demostrado para ser un eficaz punto de partida para abordar no sólo oftalmológica1,2,3,4,5 , sino también neurológica6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 preguntas. En los últimos años, OCT y OKR han sido identificadas como útiles herramientas analíticas, no invasivo para evaluar una gran variedad de retinopatías y manifestaciones retinianas en varios modelos de roedores17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT permite rápido y de alta resolución en vivo visualización de la morfología retiniana y estructura en ratones y ratas, con resultados buenos de acuerdo con las secciones histológicas de las retinas de los animales del26. OKR constituye un método rápido y robusto para evaluar cuantitativamente la función visual.

Muchos dispositivos de la OCT permiten simultánea escaneo láser oftalmoscopia (cSLO) proyección de imagen confocal con diferentes longitudes de onda, que proporciona información de diagnóstico acerca de patologías retinianas, es decir, la visualización de los depósitos de lipofuscina o alteraciones de la retina del pigmento del epitelio27. Además, en vivo la proyección de imagen de fluorescencia con células de animales transgénicos es posible28,29,30,31,32. Sin embargo, la aplicación de la tecnología OCT en modelos de roedores es todavía un reto, principalmente debido al tamaño de ojo pequeño. Varios dispositivos disponibles en el mercado requieren adaptaciones y a menudo un tamaño diferente del titular es necesaria para los animales de especies diferentes de la imagen. Además, los animales requieren anestesia para medición.

Dispositivos OKR pueden utilizarse para evaluar la función visual en los roedores. Los animales se colocan en una plataforma en el centro de un cilindro virtual o real mostrando una mudanza reja, que los animales seguir con movimientos de cuello y cabeza reflexiva. Esta respuesta optokinetic es reducida o eliminada en el caso de la reducción o pérdida de la función visual.

El objetivo de este protocolo es presentar un manual para la medición del espesor retiniano utilizando un dispositivo comercialmente disponible de OCT con un soporte personalizado proporciona anestesia inhalante. El protocolo muestra cómo analizar exploraciones de volumen utilizando el software proporcionado por el fabricante. Para pruebas visuales, el objetivo es proporcionar instrucciones sobre cómo utilizar un sistema comercialmente disponible para evaluar el OKR.

Protocolo

Animales todos los procedimientos fueron realizados cumpliendo con las directrices experimentales aprobadas por las autoridades regionales (Agencia del estado de naturaleza, medio ambiente y protección del consumidor; referencia número 84-02.04.2014.A059) y se ajustan a la Asociación para la Investigación en visión y Oftalmología (ARVO) instrucción para el uso de animales en investigación de visión y oftálmica y la Directiva Europea 2010/63/CE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. confocal exploración tomografía de coherencia oftalmoscopia-óptica láser

Nota: El protocolo para la medición de cSLO-OCT es adaptable para todas las cepas de las ratas y ratones de laboratorio.

  1. Preparativos puesta en marcha y la proyección de pre-imagen
    Nota: La configuración del sistema del dispositivo OCT utilizado en este protocolo ya ha sido descrito en otra parte31.
  2. Roedor preparación para anestesia inhalante
    1. Coloque el roedor en una cámara de inducción y el vaporizador a una concentración de isoflurano de 2% a 2 L/min O2.
    2. Compruebe si el roedor es anestesiado por pellizcar la cola, lo retire de la cámara y envuelva en papel toalla para mantener caliente.
    3. Coloque el roedor en el titular de la aduana33 y los incisivos del gancho en la barra de mordedura integrada de la boquilla, conectada con el vaporizador (2,5% de isoflurano en 2 L/min O2).
    4. Aplique una gota de fenilefrina 2.5%-Tropicamide 0.5% en cada ojo para la dilatación pupilar.
    5. Limpie cualquier exceso de líquido de las gotas oftálmicas después de 1 minuto y lubricar los ojos con el gel oftálmico base de metil-celulosa (por ejemplo, hipromelosa 0,3% colirio) para evitar que se sequen fuera y enturbiamiento de la córnea.
    6. Coloque la lente de contacto personalizada (+ 4 dioptrías) en el ojo de ratón con la mano o con unas pinzas. Cubra el ojo de la rata con una placa de cristal (por ejemplo, redondo cubreobjetos de cristal de 12 mm de diámetro) sin propiedades ópticas para asegurar una superficie plana.
      Nota: Frecuencia respiratoria de monitor durante la anestesia. Aumentar o disminuir la concentración de isoflurano si es necesario.
  3. Medición y análisis
    Nota: Asegúrese de que realizar y notificar el OCT las mediciones en línea con las recomendaciones de APOSTEL34 y realizar controles de calidad según el OSCAR-IB consenso criterios35. Como estas recomendaciones se han desarrollado para imágenes de OCT humanos, algunos criterios no están o sólo parcialmente aplicable.
    1. Para el ojo izquierdo de la imagen, coloque el soporte tal como se presenta en la figura 1A para asegurar que el bulbo del ojo izquierdo de las caras de roedores la cámara.
    2. Pulse el botón Start en la esquina derecha de la pantalla del panel de control para iniciar el modo de adquisición.
    3. Ponga el filtro en R y seleccione BR + OCT para la proyección de imagen de reflectancia azul del fondo y la adquisición de B-scan en el panel de control.
    4. Ajuste la distancia de enfoque a aprox. 38 dioptrías utilizando la perilla de enfoque en la parte posterior de la cámara y zoom en la retina hasta que la OCT es visible en la pantalla.
      Nota: En la primera medición, el brazo de referencia tiene que ser adaptado para medida de roedor. Pulse la combinación Ctrl + Alt + Mayús + O y ajuste el valor del brazo de referencia en la ventana abierta hasta OCT-scan aparece en la pantalla.
    5. Para asegurar una trayectoria de viga a través del centro de la pupila con un ángulo ortogonal a la retina en los planos, coloque el disco óptico en medio del campo iluminado (BR) y ajustar la línea horizontal y vertical de B-SCAN a un nivel horizontal por el giro de rotación el soporte (figura 1B) o mover la cámara.
    6. Seleccione el modo de escaneo de volumen y establece en 25 B-SCAN en el modo de alta resolución en el seguimiento en tiempo real automática 50 (arte, rasterizada de promedio 50 A-Scan) en la pantalla de software.
    7. Centro el centro de la rejilla de análisis de volumen en el disco óptico e iniciar adquisición pulsando la perilla de sensibilidad negro y luego adquirir el panel de control.
    8. Ponga la palanca del filtro a, seleccione Azul Auto floración (BAF) en el panel de control y ajustar el brillo de la imagen con la perilla de sensibilidad. Presione la perilla de sensibilidad y luego adquirir las células imagen fluorescente (p. ej., EGFP) o depósitos fluorescente auto.
    9. Aplicar gel oftálmico en el ojo de los roedores para prevenir la deshidratación y poner el animal en una jaula separada con una fuente de calor.
    10. Supervisar el roedor hasta que esté totalmente recuperado de la anestesia, en una jaula separada y alojado individualmente. Cuando el animal es ambulatoria, volver a la jaula del hogar.
    11. Para el análisis de los escaneos de volumen, utilice la segmentación automatizada del software del dispositivo OCT haciendo clic derecho en la exploración y seleccione segmentación entonces Todas las capas. Asegúrese de que la calidad de las imágenes de OCT es suficiente y definir cortes de calidad para cada conjunto de experimentos, por ejemplo, > 20 decibelios.
    12. Realizar la corrección manual de las capas haciendo doble clic en la exploración deseada, seleccione Perfil de espesor y haga clic en Editar capa segmentaciones. Seleccionar una capa, por ejemplo, presione ILM para limitar la membrana internay, si es necesario, corrija la línea verde moviendo los puntos rojos por arrastrar y soltar en la posición correcta.
      Nota: Asegúrese de que el investigador realiza la corrección manual es ciego para los grupos experimentales.
    13. Seleccione la ficha Grueso mapa y elegir el tratamiento temprano 1, 2, 3 mm de cuadrícula de retinopatía diabética (ETDRS) de estudio. Centro del círculo interno del disco óptico (figura 2, izquierda).
    14. Calcular el espesor de las capas retinianas desde los valores de espesor proporcionados por el software para los diferentes sectores de retinales de interés. Para calcular los valores de espesor medio de exploraciones de volumen, utilice el entero 1, 2, 3 mm ETDRS la red, que cubre un ángulo de aproximadamente 25°, excepto el círculo interno de 1 mm, que contiene el disco óptico (figura 2, derecha).
    15. Realizar el análisis estadístico utilizando el software adecuado. Si se incluyen ambos ojos de un animal, considere un modelo estadístico que representa dentro de las correlaciones inter-ojo de tema (por ejemplo, las ecuaciones de estimación generalizada o mezclado modelos lineales), como los ojos de uno de los temas son estadísticamente dependientes36 .

2. Optokinetic respuesta

Nota: A continuación, se proporciona un manual detallado para las mediciones de OKR de ratones y ratas, que puede ser adaptado a las necesidades específicas individuales.

  1. Preparativos de montaje y medición antes
    1. Encienda el ordenador. Después de que el sistema ha arrancado, encender las pantallas de la cámara de prueba como se describe en más detalle en otra parte37.
    2. Seleccione una plataforma adecuada para la medición de ratones o ratas.
      Nota: El tamaño de la plataforma se selecciona en función del tamaño del cuerpo del roedor. Los animales deben ser capaces de sentarse correctamente en la plataforma sin la habilidad de caminar.
    3. Abrir la ventana de la configuración haciendo doble clic en el software, seleccione nuevo grupo y elija el nombre del grupo, el número de sujetos, las especies y cepas. Seleccionar un estímulo variable: frecuencia espacial/temporal, la sensibilidad al contraste, velocidad u orientación en el menú desplegable, pulse Crear nuevo grupo.
    4. Centrarse en la plataforma manipulando el anillo de enfoque de la cámara encima de la cámara y calibrar el sistema alineando (arrastrar y soltar) el círculo rojo alrededor del círculo negro en la plataforma.
  2. Medición y análisis
    1. Coloque el animal en la plataforma, que se adaptan al entorno ~ 5 min Levante el animal en la plataforma si cae (Figura 3A).
    2. Seleccione el número del sujeto y condición en la esquina superior derecha de la pantalla del software (figura 3B). Un estímulo es variable, los demás estímulos se mantienen constante. Esto es confirmado por el símbolo de abrir cerradura o candado cerrado al lado del estímulo.
    3. Iniciar medición seleccionando ◄ para sí o ■ No, si el animal realiza el seguimiento o no seguimiento, respectivamente.
      Nota: Seguimiento hacia la derecha se corresponde con el seguimiento de la izquierda y hacia la izquierda en el ojo derecho. El software cambia aleatoriamente la dirección de la red móvil.
    4. Seleccione el tamaño de paso del estímulo manualmente haciendo clic en las flechas arriba y abajo junto a la variable estímulo o dejarlo adaptar automáticamente por el software si converge de umbral de estímulo.
    5. Para obtener resultados óptimos, animar el animal, p. ej., alta sonidos que silban y esconder, haciendo clic en el símbolo de la caja negra o blanca en la pantalla del software. Realizar estas acciones repetidas veces en el caso de mediciones prolongadas.
    6. Para el análisis de datos, seleccione la ficha Resumen y haz clic en archivo | Tabla/gráfico de exportación para exportar el conjunto de datos deseado.
    7. Realizar el análisis estadístico utilizando el software deseado (véase también paso 1.3.15).

Resultados

Usando proyección de imagen de OCT de la generación derd 3 péptido de myelin oligodendrocyte glicoproteína (MOG) había inducida en modelos de ratón de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), se obtuvieron secciones alta resolución morfológicas de la retina de ratón. Utilizando esta tecnología, las capacidades protectoras de diversas sustancias fueron demostrados17. Los valores de espesor de las capas retinianas internas (IRL) obtenidos están en buen acuerdo con los números de las células ganglionares de la retina (RGC) obtenidas por tinción histológica de wholemounts retiniana (figura 4).

OKR proporciona una lectura funcional de la neurodegeneración vista por PTU. En estos experimentos, función visual evaluada como frecuencia espacial por OKR y daño neuroaxonal evaluadas como adelgazamiento de la IRL por OCT, estaban en estrecha correlación17. Varios protocolos pueden emplearse para examinar la agudeza visual por cambio de la frecuencia espacial o temporal, la sensibilidad al contraste, orientación o velocidad de la red móvil. En el modelo EAE, se detectó una frecuencia espacial mejorada de 0.05 ciclos/grado (c) de animales tratados con sustancia 1 en comparación con los ratones no tratados de MOG-EAE (figura 5).

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Figura 1: soporte personalizado para medición OCT. (A) OCT proyección de imagen de un ratón C57BL/6J, utilizando el soporte personalizado33 y (B) eje de rotación alrededor de los ojos de roedor. Rotación en el plano transversal (izquierda) y en el plano axial (derecha) se demuestra. Esta figura ha sido modificada de Dietrich, M. et al.33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: OCT post análisis adquisición. «1, 2, 3 mm» ETDRS red 25 B-scan volumen protocolo (izquierda). El espesor de las capas retinianas se proporciona para los diferentes sectores de la retinales por el software (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: medición de OKR de ratones y de estímulo configuración. Parte superior (A) ve a través de la cámara analizar un ratón C57BL/6J en la plataforma en la cámara. (B) interfaz de usuario y configuración del software OKR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: ratones C57BL/6J con MOG EAE muestran un curso de la enfermedad atenuada cuando se tratan con la sustancia 1 en comparación con controles no tratados. (A) la degeneración de las capas retinianas internas es reducida (B) y la clínica puntuación de EAE se atenúa durante la EAE cuando se administró la sustancia 1. Ratones fueron anotados todos los días, y las mediciones de la OCT se realizaron mensualmente durante un período de 120 días. Los gráficos representan la media y error estándar de al menos diez animales por grupo. (*p < 0.05, ***p < 0.001, área bajo la curva por ANOVA con prueba post-hoc de Dunnett). (C) el cambio de espesor IRL está en buen acuerdo con pérdida leve (***p < 0.001, por ANOVA con prueba post-hoc de Dunnett en comparación con ratones MOG no tratado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: medida de OKR de ratones C57BL/6J con MOG-EAE. (A) OKR revela una mejor agudeza visual de los animales tratada con sustancia 1 en comparación con ratones no tratados de MOG EAE medidos por umbral de frecuencia espacial de prueba durante un período de 120 días. Los gráficos representan la media y error estándar de al menos seis animales por grupo (**p < 0.01, ***p < 0.001, área bajo la curva por ANOVA con prueba post-hoc de Dunnett). (B) imagen de un ratón C57BL/6J en la cámara de pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo proporciona una instrucción para las mediciones de espesor y el examen de la función visual en los roedores. Lectura visual se utiliza cada vez más en la investigación traslacional18,26,38,39,40 y es fácilmente transferible a los ensayos clínicos. La gran ventaja de PTU en comparación con las investigaciones histológicas en experimentos con animales es análisis longitudinales posibles permitiendo la investigación de dinámicos procesos patológicos, en gran medida reducir la variabilidad y el número de animales necesarios por estudio. Además, la proyección de imagen in vivo con OCT no es objeto de fijación, corte o coloración de artefactos, que pueden afectar el espesor de la capa en las investigaciones histológicas.

Sin embargo, la orientación ortogonal del rayo láser en todos los planos en lo referente a la retina es un paso crítico para asegurar la calidad y reproducibilidad de los valores de espesor. Requiere cierto entrenamiento del investigador y es obligatorio antes de la adquisición de escaneos OCT. Además, los dispositivos comerciales son construidos para aplicaciones humanas, la calidad de las imágenes de OCT roedores es todavía inferior en comparación con B-scan de pacientes humanos. En la experiencia el authors', puede ser difícil distinguir la retina interna diferentes capas (capa de fibras nerviosas retinianas, capa de células ganglionares y la capa plexiforme interna) durante la corrección manual. Por lo tanto recomendamos analizar estas capas como una lectura compuesta (IRL).

La disposición experimental proporciona una opción para la anestesia volátil, por ejemplo, inhalante isoflurano, que es, en nuestra experiencia, más seguro y más fácil de controlar que la anestesia inyectable, por ejemplo, la ketamina-xilacina41,42 y reduce el riesgo del prematuro despertar de roedores en el caso de adquisición más veces (p. ej., al realizar la proyección de imagen de células con fluorescencia). En un estudio preliminar, análisis del volumen fueron identificados como los protocolos con la más alta validez y confiabilidad. La fiabilidad inter-rater y prueba de retest fue excelente cuando exploraciones de volumen, excepto la parte central que contiene el disco óptico se evaluaron con valores de ICC (coeficiente de correlación intra-clase) por encima de 0,85 para todas las evaluaciones.

La medición de la respuesta optokinetic se basa en el reflejo optokinetic involuntario, que ocurre en respuesta a un campo en continuo movimiento. En roedores, en contraste con otras especies, el movimiento implica no sólo los ojos, sino toda la cabeza, que puede ser detectada fácilmente mediante la cámara.

Distinción entre "seguimiento" o normal movimientos conductuales de los animales requiere cierto entrenamiento del investigador y es importante ser ciego para el grupo experimental. Además, los animales necesitan una fase de adaptación para adaptarse a la configuración experimental y protocolos de medición de largo plazo, los animales tienen que ser animado repetidamente para asegurar que "no seguimiento" está por alcanzar el umbral OKR y no a la disminución de atención. También hay una variabilidad significativa de la tensión con respecto a la función visual de laboratorio las ratas y ratones43,44. La agudeza visual de los roedores, por tanto, deben ser evaluada antes de que se prueban y algunas cepas, como ratones SJL, pueden no ser siquiera apto para mediciones de OKR, ya que son homocigóticos para el alelo Pde6brd1 (degeneración retiniana 1).

En Resumen, el examen de morfología retiniana y la función visual en modelos animales permite que las investigaciones no invasivas, longitudinales de daños estructurales y funcionales que ocurren en el contexto de la EAE y puede ser útil en otros modelos con la visual sistema, incluyendo pero no limitado a los modelos de retinopatías o lesión del nervio óptico.

Divulgaciones

No relacionado con el trabajo presentado que los autores declaran las revelaciones financieras siguientes:

Michael Dietrich recibió honorarios de orador de Novartis. Andrés Cruz-Herranz es una beca posdoctoral de la sociedad nacional de esclerosis múltiple. Ari J. Green sirvió en el Consejo Asesor científico de MedImmune, Novartis, OCTIMS, Inicio 5 Biociencias y Bionure; es editor asociado de Neurología de JAMA; fue un miembro del Consejo editorial de Neurología; posee una patente para el remyelination moléculas y vías; consultar Inicio 5 Ciencias; investigación recibido apoyo de Novartis Pharma OCTIMs, Fundación Ciencias de la SRA, NINDS, NIA, National MS Society, Fundación Sherak y Hilton Foundation; tiene acciones u opciones sobre acciones en 5 de creación; y servido como testigo experto en Mylan v Teva Pharma. Hartung Hans-Peter ha recibido honorarios por servir en comités directivos de Biogen Idec GeNeuro, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals, MedImmune, Bayer HealthCare, adelante Pharma, y Roche, honorarios para servir en tableros consultivos de Biogen Idec, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals y Roche y los honorarios de la Conferencia de Biogen Idec, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals , Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals, MedImmune y Roche. Philipp Albrecht recibió indemnización por servir en tableros consultivos científicos para Ipsen, Novartis, Biogen; recibió honorarios de ponente y apoyo de Novartis, Teva, Biogen, Merz Pharmaceuticals, Ipsen, Allergan, Bayer Healthcare, Esai, UCB y Glaxo Smith Kline; recibió apoyo en investigación de Novartis, Biogen, Teva, Merz Pharmaceuticals, Ipsen y Roche. Otros autores no reportan revelaciones.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Pfleger Dr. Robert Ilselore Luckow-Fundación, así como Biogen y Novartis a PA Figura 1B fue reproducido de «manipuladores posicionales de todo el cuerpo para la proyección de imagen ocular de ratones anestesiados y ratas: una guía del hágalo usted mismo. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Aktas, O., Brandt, A. U., Hartung, HP., verde, A., Albrecht, P. BMJ Open Oftalmología. 1 (1), e000008, 2017" con el permiso de BMJ Publishing Group Ltd.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system Heidelberg Engineering, GermanyN/Aophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg Engineering, GermanyN/AVersion 1.9.10.0
blue 25D non-contact  lensHeidelberg Engineering, GermanyN/Alens for rodent mesurement
OptoMotryCerebralMechanics Inc., CanadaN/Asystem for visual function analysis
OptoMorty HD softwareCerebralMechanics Inc., CanadaN/AVersion 2.1.0
Inhalation Anesthetic IsofluranePiramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA 803250inhalation anesthetic
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% University Hospital Düsseldorf, GermanyN/Apupillary dilation 
Visc-OphtalDr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany58407ophthalmologic eye gel
GraphPad PrismGraphPad Software Inc, San Diego, CA, USAN/Astatistical analysis software, Version 5.00
IBM SPSS StatisticsIBM Corporation, Armonk, New York, USAN/Astatistical analysis software, Version 20

Referencias

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