卡瑞津、S100 蛋白和蛋白质基因产物9.5 的免疫修饰直肠吸吮活检诊断

摘要

该方案描述了对卡莱丁、S100 蛋白和蛋白质基因产物9.5 进行免疫染色直肠抽吸活检的过程。这种新型辅助诊断方法对先天性巨结肠病具有较好的敏感性和特异性。

摘要

先天性巨结肠病 (HD) 是一种先天性肠道疾病, 临床表现为婴儿无法通过胎粪或儿童长期便秘。直肠抽吸活检 (RSB) 测定神经节细胞的缺失和神经肥大是目前诊断亨廷顿舞蹈症最准确的方法。传统的血红素-eosin 染色缺乏敏感性和特异性。乙酰胆碱酯酶染色由于其复杂的过程, 不能被广泛使用。我们在 rsb 上进行的用于卡利丁、S100 蛋白和蛋白质基因产物 9.5 (PGP9.5) 的免疫染色新协议, 具有 96.49 (95% 置信区间、0.88-0.99) 和 100% (95% 置信度) 的高灵敏度和特异性。间隔, 分别为 0.97-1.00)。受 hd 影响的片段通常表现为缺乏卡莱丁、S100 蛋白和 PGP9.5 的表达, 而这些都是黏膜下组织中神经肥大的标志物。此协议描述了这种新诊断方法的详细操作过程。

引言

先天性巨结肠病 (HD) 是一种常见的先天性肠道疾病, 其特点是肠远端1的不同部分缺乏神经节细胞.胚胎神经细胞的入侵完成后, 就形成了人类肠道神经系统。如果有一个过程的干扰, 并且入侵未能完成, 新生儿的远端肠成为琼脂²。这种潜在的致命疾病被称为先天性巨结肠病。增殖、运动和肠道生长是成功殖民的三个主要组成部分。

传统的半粘膜下活检的血起毒素和 eosin (H & E) 染色不能像手术中获得的全厚度组织的 h & E 染色那样令人满意。此外, 直肠吸力组织的乙酰胆碱酯酶 (ache) 染色由于其灵敏度不足 (91%) 和冷冻切片 3^{, 4 的}复杂处理, 在理论上^具有挑战性。神经节细胞和神经纤维的其他几个免疫组织化学标志物, 可以染色的福尔马林固定和石蜡嵌入标本正在逐渐成为主流的亨廷顿舞蹈症诊断。卡莱丁素是一种维生素 d 依赖性钙结合蛋白, 不表达在肌肠内和粘膜下神经丛的 hd 影响段 5.S100 蛋白在神经冠产生的细胞中表达, 如神经纤维和胶质细胞, 这些细胞通常在 hd 影响的段的粘膜下组织中表现出神经肥大 6.蛋白质基因产品 9.5 (PGP9.5) 可靠地染色神经纤维和神经节细胞;PGP9.5 染色是对卡氏素染色的补充, 特别是在孤立的性腺功能减退症的情况下。双染色 S100 和 PGP9.5 可以降低假阴性率, 提高灵敏度。作为一个前提, 目前的研究旨在确保充分的特异性和高灵敏度的这种新的诊断方法。我们的新协议使用了所有三个标记的鉴别共济术肠和肥厚神经纤维。我们的实验室对318个儿童进行了前瞻性研究, 此前没有详细的协议⁷发表。本文讨论了详细的协议和注意事项。任何新生儿从出生起就患有严重的排便问题, 或患有慢性便秘的儿童, 不包括其他常见疾病, 都是直肠抽吸活检 (RSB) 的潜在候选人。我们的新方案不仅适用于动态实验室染色, 还适用于全厚度活检或手术标本的染色, 以做出最终诊断。

研究方案

该协议得到了华中科技大学联合医院研究伦理委员会的批准。

1. 直肠穿刺活检

1. 在获得监护人的知情同意后, 由训练有素的儿科外科医生和助理使用 Rbi2 抽吸直肠活检系统进行直肠穿刺活检。
   1. 对有以下症状的患者实施 RSB: 婴儿无法通过胎粪, 或儿童长期腹胀, 有或没有便秘;长期便秘的儿童, 需要石蜡油完成排便;患有肠造口术的儿童肠梗阻或肠穿孔, 原因不明。
      注: RSB 的禁忌症如下: 有严重症状、身体状况差或不能耐受 RSB 的儿童;急性期小肠结肠炎患儿;正在接受肠道吻合的儿童, 没有完全愈合。
2. 在手术前36小时进行正常的生理盐水保留灌肠, 以避免大便松动和粘膜过度水肿。如果孩子有严重便秘, 请加入硫酸镁溶液。对新生儿使用维生素 K (1 mg/kg)。
   注: 不要进行术前血液检查或使用抗生素, 因为它们是不需要的。
3. 把病人放在取石器的位置。在管表面涂上石蜡油。将钝管4-7 厘米插入直肠, 侧孔面向后壁或外侧壁。
4. 在管上施加温和的压力, 以促进侧孔与直肠壁的充分粘附。按下扳机并立即取出工具。
5. 使用活检仪获得4个吸力活检, 直径为2毫米, 在牙线上方3厘米, 6 厘米以上, 前后。使用针头将标本放在用盐水润湿的纱布上。
6. 观察患者, 直到手术后 2小时, 以排除直肠出血。避免在 RSB 后的前24小时内进一步的直肠和肛门操作。

2. RSB 部分的编写

1. 将直肠吸吮活检在4% 的甲醛中放置 6小时, 以固定组织。使用固定体积是组织体积的5倍。
2. 使用病理组织脱水剂使组织脱水11小时。整个编程过程包括以下5个步骤:
   1. 将组织放入甲醛中, 固定1小时。
   2. 将组织放入75% 乙醇中4小时。
   3. 将组织放入绝对乙醇 (两个变化, 每个变化 1小时)。
   4. 将组织放入绝对乙醇 (两个变化, 每个变化 30分钟)。
   5. 将组织置于二甲苯中 (三个变化, 每个变化 1小时)。
3. 将组织放入石蜡 (58-60°c) (三次变化, 每次 1小时)。将 RSB 组织嵌入石蜡块中。
4. 用微孔修剪石蜡块, 直到组织完全暴露在一个完整的截面平面上。
5. 用微孔将块切割成0.4 微米的部分。
6. 将部分放入45-50 的水中, 每片几秒钟, 使部分扩散到平板上。
7. 将石蜡部分传输到幻灯片上。
8. 将幻灯片在60°c 的烤箱中烘烤3-5 小时, 避免烘焙太久, 这可能会导致抗原的丢失。
9. 将幻灯片放入二甲苯中 (2个变化, 每次 15分钟)。
10. 将幻灯片在绝对乙醇、95%、80% 和75% 乙醇中进行一次, 每次5分钟。然后, 在反渗透 (RO) 纯净水中冲洗5分钟。

3. 抗原回收

1. 将 EDTA 抗原回收缓冲液的4毫升与200毫升的 r-净化水混合, 进行钙蛋白回收的工作稀释。将柠檬酸柠檬酸钠缓冲液 (100x) 1 毫升与99毫升的 RO-A纯化水混合, 对 S100 和 PGP9.5 的回收进行工作稀释。
   注: 卡尔雷丁可以通过 EDTA 检索解决方案优先检索。然而, 柠檬酸柠檬酸钠的柠檬酸钠缓冲液更适合于检索 S100 和 PGP9.5。
2. 将幻灯片放入可切片染色罐中。将罐子灌满回收液, 放入预热的沸水浴中。煮沸20分钟后, 将罐子从水浴中取出, 冷却至室温。冷却过程大约需要 10分钟, 取出幻灯片, 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 轻轻冲洗一次。
3. 用标记笔在纸巾周围画一个圆圈, 并准备一个湿箱, 以便进行以下操作。

4. 阻塞

1. 将 30% h2o2 的3毫升与 ro-a纯化的 27毫升混合, 进行工作稀释。
2. 在组织上滴入两滴或三滴 3% h2o2 溶液, 以阻断过氧化物.及时添加 H2o2 解决方案, 以确保解决方案不会从圆圈溢出.在37°c 的孵化器中对过氧化物进行堵塞20分钟。
3. 用 PBS 轻轻冲洗幻灯片 (每次洗三次, 每次洗 5分钟)。
4. 在37°c 下用5% 的牛血清白蛋白 (BSA, 将1.5 克 BSA 粉末与30毫升的 Ro-p来说的水混合制备) 将幻灯片块20分钟。
   注: 用 3% h2o2染色可以防止95% 的非特异性染色, 用 5% bsa 阻塞可以防止其余5% 的非特异性染色。将这两种方法结合起来, 获得可靠的结果。

5. 抗原抗体反应

1. 取出 5% BSA, 并在幻灯片中添加50μl 的原代抗体 (卡莱丁、S100 或 PGP9.5)。在4°C 下过夜。
2. 用 PBS 清洗幻灯片 (三次, 每次 3分钟)。
3. 在该部分添加50Μl 聚合物增强剂 (试剂 A; 见材料表), 并在37°c 孵化器中孵育20分钟。然后, 用 PBS 清洗幻灯片 (三次, 每次 3分钟)。
4. 在切片中加入50μl 的二级抗体 B (山羊抗兔子小鼠 IgG 二级抗体), 并在37°c 孵化器中孵育30分钟。用 PBS 清洗部分 (三次, 每次 5分钟)。

6. 3、3-二氨基苯并吡啶和半甲氧基染色

1. 在 1.5 mL 管中加入850Μl 的 RO-purified 水, 并按 a、B 和 C 的顺序添加染色试剂 (见材料表), 每种试剂加入 50Μl, 以获得 3, 3-二胺 (dab) 的工作溶液, 总共为1毫升。如果有沉淀物, 过滤后使用溶液。
2. 在组织部分加入一滴 DAB 工作溶液, 并在室温下在 DAB 中加染 3-10, 直到检测到棕色染色。使用明亮场显微镜仔细监测。使 DAB 工作解决方案远离光线。然后, 用 PBS 清洗幻灯片5分钟。
3. 加入一滴血红素, 以对抗细胞核约1分钟。然后, 拿着椰子罐, 在一滴水下清洗大约 30-40秒, 直到多余的染料被去除。注意不要损坏组织部分。
4. 将 RSB 幻灯片浸入含有 PBS 的共装罐中25-30。然后, 在1% 盐酸乙醇中进行分化, 用 PBS 清洗滑块1分钟。
5. 按水合作用的相反顺序脱水幻灯片: 75%、80%、95% 和绝对乙醇 (各 5分钟)。
6. 将幻灯片曝光至二甲苯 (2次更改, 每次 5分钟)。
7. 使用超薄安装安装盖板。在使用显微镜进行可视化之前, 请让幻灯片干燥。

结果

共有318名患者参加了我们的研究。所有患者均接受 RSB 治疗, 并对组织进行了卡瑞丁、S100 和 PGP9.5 的染色。基于我们的新协议的诊断是 HD 97 例, 非 hd 213 例, 疑似 HD 8 例。在132例手术患者中, 99 例经手术后对全厚度标本进行免疫染色, 诊断为亨廷顿舞蹈症。S100 和 PGP9.5 显示, 在99例患者中, 92% 和93% 的患者分别有神经干肥大。186名患者中, 其余83例接受了全厚度活检, 并显示了神...

讨论

在这里, 我们描述了一个程序, 使用三种不同的免疫组织化学抗体染色 RBS 部分诊断亨廷顿舞蹈症。我们的诊断方案的敏感性为 99.49% (95% CI, 0.88-0.99), 特异性为 100% (95% CI, 0.88-1.00)。

该协议最关键的步骤是 RSB 和抗原抗体反应。活检的大小决定了染色的准确性。小活检不会提供足够的组织来做出准确的诊断, 而大的活检会导致更高的出血风险。根据经验, 直径为2毫米的活检是最佳?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument